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        一步法構(gòu)建萊茵衣藻葉綠體表達(dá)載體

        2021-03-04 07:40:32劉國興胡玉立徐丹丹
        現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究 2021年3期

        劉國興,胡玉立,徐丹丹,徐 松

        (國藥集團(tuán)動物保健股份有限公司 湖北,武漢 430075)

        萊茵衣藻是一種生活在淡水里的單細(xì)胞真核綠藻,其葉綠體表達(dá)的外源蛋白具有安全性好、培養(yǎng)周期短、遺傳穩(wěn)定、容易擴大培養(yǎng),并且成本低廉等優(yōu)點[1,2,3]。近些年來,多種具有應(yīng)用前景的蛋白在萊茵衣藻葉綠體中成功表達(dá)[4]。而一般構(gòu)建衣藻葉綠體表達(dá)載體需要通過兩步克隆來完成:首先將外源基因插入克隆載體的衣藻來源的5’和3’非翻譯區(qū)(UTR)多克隆位點間,再將5’UTR-外源基因-3’UTR的表達(dá)盒酶切下,通過同源重組構(gòu)建至表達(dá)載體[5,6]。為了簡化衣藻葉綠體表達(dá)載體的構(gòu)建步驟,本研究構(gòu)建了一種T載體pBTNK,通過一步TA克隆可將待表達(dá)的外源基因插入衣藻來源5’和3’UTR 之間,藍(lán)白斑篩選獲得陽性轉(zhuǎn)化子后,重組質(zhì)??芍苯佑糜谵D(zhuǎn)化植物,因此可簡化衣藻葉綠體中表達(dá)載體構(gòu)建流程。

        1 材料和方法

        1.1 材料

        1.1.1 藻株、菌株和質(zhì)粒 萊茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii137c (mt)、質(zhì)粒 pCX16、pCX13、p228 由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)陳杏洲博士惠贈;大腸桿菌DH10β,質(zhì)粒pShuttle、pFAST-EGFP、pT-BASIC由湖北大學(xué)蔣思婧博士惠贈。

        1.1.2 酶、主要試劑和設(shè)備 BfuI 購自Thermo Scientific,LATaq酶、SolutionI 連接酶、T4DNA 聚合酶、質(zhì)粒抽提試劑盒、MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0、其他限制性內(nèi)切酶,購自 Takara 公司,X-gal、dNTP、硫酸卡那霉素(kana)、氨芐青霉素購自北京九州同業(yè)生物科技公司,壯觀霉素購自sigma公司,PCR引物(表1)由上海捷瑞生物工程有限公司合成,Biolistic PDS-1000/He基因槍購于Bio-Rad。

        1.2 方法

        1.2.1 DNA 克隆 質(zhì)粒提取參照OMEGA bio-tek 試劑盒說明書進(jìn)行,DNA片段克隆、重組質(zhì)粒鑒定等分子克隆操作參照Sambrook提供的方法進(jìn)行[7]。

        1.2.2 萊茵衣藻葉綠體轉(zhuǎn)化 根據(jù)文獻(xiàn)[8]描述的方法并適當(dāng)調(diào)整后,通過基因槍法將基因?qū)肴~綠體,即3μg載體質(zhì)粒pTBNK-EGFP(1μg/μl)和2μg 抗性質(zhì)粒p228(1 μg/μl)包被50μl(60 mg/mL)直徑為0.6μm金粉子彈,按壓力1100psi、真空度28英寸汞柱、目標(biāo)距離6cm轟擊衣藻,將轟擊后的衣藻在TAP平板上暗培養(yǎng)15~20h后刮下,涂布于5皿含100μg/mL壯觀霉素抗性TAP平板,培養(yǎng)兩周。

        1.2.3 葉綠體總DNA提取 衣藻葉綠體總DNA的抽提采用CTAB法[9]。

        1.2.4 萊茵衣藻的培養(yǎng) 將萊茵衣藻培養(yǎng)在TAP 液體培養(yǎng)基或含1%瓊脂糖的固體平板上,在22℃~24℃、連續(xù)光照(約100 μE/m2.sec-1)條件下培養(yǎng)[10]。

        2 結(jié)果

        2.1 衣藻葉綠體表達(dá)載體pTBNK的構(gòu)建

        以質(zhì)粒pCX16為模板,P1和P2為引物,LATaq酶PCR擴增5.7kb 同源臂上的2.0 kb 片段,回收PCR 產(chǎn)物后,用BamHI和SphI雙酶切并回收該2.0 kb片段,然后將酶切的片段插入pCX16 載體的BamHI 和SphI 酶切位點間,在pCX16 載體上引入NotI 酶切位點得到載體pCXN;EcoRI和SphI 雙酶切載體pCXN,回收pCXN 載體骨架5.7 kb 片段,并用T4DNA 聚合酶補平末端,將末端補平片段插入pT-BASIC 的EcoRV 酶切位點得到載體pTBN;以質(zhì)粒pShuttle 為模板、P3 和 P4 為引物,LATaq酶 PCR 擴增 1.2 kb kana 抗性基因片段,將該片段回收后,BglⅡ和HindⅢ雙酶切該片段,然后將酶切后的片段插入pCX13 載體的BglⅡ和HindⅢ酶切位點間獲得載體pCX13-kana;用BamHI 將 pCX13-kana 載體上 5’UTR-BfuI-kana-BfuILacO 部分序列-3’UTR 表達(dá)盒酶切下,T4 DNA 聚合酶補平末端,然后和NotI 酶切、T4DNA 聚合酶補平末端的pTBN 載體片段用SolutionI 連接酶進(jìn)行連結(jié),獲得衣藻葉綠體定向表達(dá)T載體pTBNK(圖1)。

        2.2 一步克隆構(gòu)建衣藻葉綠體表達(dá)載體pTBNK-EGFP

        以 pFAST-EGFP 為模板,P5 和 P6 為引物,LAtaqPCR擴增 EGFP 基因并回收該產(chǎn)物,BfuI 酶切 pTBNK 載體,連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH10β 感受態(tài)細(xì)胞,涂布于含氨芐青霉素(50μg/ml)和X-gal(30μg/ml)的LB固體平板上,避光培養(yǎng)12~14h 后觀察,挑顯藍(lán)色的菌落(圖2)進(jìn)行PCR鑒定(圖3)。經(jīng)鑒定,陽性克隆達(dá)100%,表明重組衣藻表達(dá)載體pTBNK-EGFP構(gòu)建成功。

        2.3 表達(dá)載體pTBNK-EGFP導(dǎo)入衣藻葉綠體

        pTBNK-EGFP 經(jīng)基因槍法轉(zhuǎn)化萊茵衣藻葉綠體后,經(jīng)100μg/mL壯觀霉素抗性篩選,共長出4個綠色單藻落,抽提野生型的葉綠體總DNA和第八次傳代的轉(zhuǎn)基因衣藻的葉綠體總 DNA 作為模板,以 P5 和 P6 為引物,PCR 擴增EGFP片段,結(jié)果顯示四個轉(zhuǎn)基因衣藻DNA樣本中均可以擴增出目的條帶而野生型DNA樣本無法成功擴增目的條帶(圖4),表明EGFP成功插入萊茵衣藻葉綠體。

        3 討論

        我們設(shè)計在載體克隆位點引入BfuI 酶切位點,該酶的特點是特異性識別5’-gtatcc-3’序列,并在該序列下游任意6 個堿基處對DNA 進(jìn)行切割,切割后形成粘性末端“T”,而LAtaqDNA 聚合酶擴增的目的片段帶“A”尾。這樣,可通過TA克隆將目的片段克隆到pTBNK。

        基于LacO重構(gòu)原理[11],在PCR 擴增目的片段的下游引物5’增加7bp的部分LacO序列(5’-CACAATT-3’),載體骨架上攜帶 13bp 的部分LacO序列(3’-AATTGTGAGCGCT-5’),載體片段和目的片段連接后,轉(zhuǎn)化到lac+的菌株感受態(tài)細(xì)胞,涂布于含X-gal的平板,完整的LacO序列會競爭性的吸附宿主菌表達(dá)的LacI 蛋白,使宿主菌的乳糖啟動子控制的β-半乳糖苷酶基因表達(dá)解抑制,表達(dá)β-半乳糖苷酶,分解X-gal使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色。因此,只有目的基因閱讀框正確插入克隆位點組成完整LacO序列才會使菌落顯藍(lán)色,而基因閱讀框反向插入或空載體,菌落均呈白色。統(tǒng)計顯示,EGFP基因克隆至該載體并轉(zhuǎn)化后,藍(lán)色菌落占總菌落數(shù)的50%~60%,而且藍(lán)色菌落均為閱讀框正確插入的重組子(圖3)。

        圖1 衣藻葉綠體定向表達(dá)T載體構(gòu)建流程圖

        圖2 藍(lán)白斑篩選重組子平板

        圖3 1:DNAmmaakkeerr 2Kpluuss IIII;2~2200:藍(lán)斑菌落PPCCRR擴增EEGGFFPP基因;2211~2255:白斑菌落PPCCRR擴增

        本實驗構(gòu)建衣藻葉綠體表達(dá)載體pTBNK,克隆效率高、篩選方法簡便、耗時短、成本低,而且不受酶切位點的影響,具備通用性,且重組子可通過藍(lán)白班篩選,優(yōu)于傳統(tǒng)的兩步法酶切構(gòu)建表達(dá)載體[7,11]。遺憾的是,本實驗中EGFP未表達(dá)。盡管如此,該構(gòu)建方法極大簡化外源基因插入萊茵衣藻葉綠體表達(dá)載體的步驟,載體構(gòu)建思路也可能適用于其他葉綠體表達(dá)載體的構(gòu)建。

        圖4 1:DNAmmaakkeerr 2Kpluuss IIII;2~5:轉(zhuǎn)基因衣藻抽提總DDNNAA作為模板PPCCRR 擴增EEGGFFPP 基因;6:野生型衣藻抽提總DDNNAA 作為模板PPCCRR擴增EEGGFFPP基因

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