陳冰霞，張夢欣，韓孟伊，張杰森，李勇森，金晨曦，齊艷偉

(1.廣州醫(yī)科大學 第三臨床學院，廣州 511436；2.廣州醫(yī)科大學 病原生物學與免疫學教研室，廣州 511436)

據(jù)WHO報告，2017年全球約有2.19億瘧疾病例，大多發(fā)生于撒哈拉以南地區(qū)，病死率高，我國經(jīng)過積極的瘧疾消除工作，近幾十年來瘧疾得到了良好的控制[1]。但境外輸入性瘧疾成為主要來源，輸入性病例不斷上升[2]。NK細胞已被證實可抵抗病毒和細胞內(nèi)寄生微生物感染[3]，B細胞介導的特異性免疫應答和體液免疫應答可保護機體[4-5]，二者均分泌多種細胞因子如IFN-γ、IL-10和IL-2來抵抗感染[6-7]。

青蒿素類藥物是治療瘧疾的首選藥物，但其有一定的免疫抑制作用[8]，副作用明顯，如蕁麻疹等[9]，且有些蟲株出現(xiàn)了耐藥性。由于瘧原蟲逃避機體免疫作用的途徑較多[10]，也給疫苗研發(fā)帶來了挑戰(zhàn)。本研究探討約氏瘧原蟲感染中NK細胞、B細胞及其表達的細胞因子的作用，旨在為闡明約氏瘧原蟲的耐藥機制和瘧疾疫苗的研發(fā)提供新方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 6～8周齡SPF級雌性C57BL/6小鼠購于廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心，飼養(yǎng)于廣州醫(yī)科大學實驗動物中心；約氏瘧原蟲(Plasmodiumyoelii)NSM株由廈門大學蘇新專博士和李劍博士惠贈。

1.1.2 試劑 Hanks液、紅細胞裂解液、PBS購于生工生物工程(上海)股份有限公司；FCS、RPMI 1640基礎培養(yǎng)液購于ThermoFisher Scientific 公司；別藻藍蛋白(allophycocyanin，APC)-Cy7標記的抗小鼠CD19、PB450標記的抗小鼠CD3、藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)-Cy7標記的抗小鼠NK1.1、FITC標記的抗小鼠IFN-γ、PE標記的抗小鼠IL-12、APC標記的抗小鼠IL-10流式抗體購于Biolegend公司。

1.1.3 實驗儀器 CytoFLEX FCM購自Beckman Coulter公司。

1.2 方法

1.2.1 感染模型的建立 取凍存的約氏瘧原蟲NSM株，注射到6～8周齡SPF級雌性C57BL/6小鼠腹腔進行瘧原蟲復蘇。當復蘇蟲株的小鼠原蟲率達8%左右時，精確統(tǒng)計原蟲率和小鼠此時的紅細胞密度。將10只6～8周齡雌性小鼠隨機分為感染組和正常組(5只/組)。經(jīng)尾靜脈向感染組小鼠注射106個瘧原蟲(稀釋到100 μL生理鹽水中)，正常組小鼠同時給予等量生理鹽水。

1.2.2 標本采集 感染后第8天，頸椎脫臼處死2組小鼠，用75%的乙醇進行浸泡，剪開小鼠腹部皮膚及腹膜，鈍性無菌分離小鼠脾臟。

1.2.3 脾細胞懸液制備 將分離的脾臟置于篩網(wǎng)中(200目)，加入1 mL Hanks液，用注射器內(nèi)芯研磨并收集脾臟研磨液，將細胞懸液轉移至離心管，離心(600×g，5 min，4 ℃)，棄上清液后加入10 mL Hanks液重懸細胞，離心，棄上清液，用Hanks液洗滌脾細胞2次。正常組小鼠脾細胞加入5 mL紅細胞裂解液，感染組小鼠脾細胞加入10 mL紅細胞裂解液，于室溫下放置5 min后分別向各管加入5 mL Hanks液終止紅細胞裂解，離心，棄上清液。加入5 mL Hanks液重懸脾細胞，離心(600×g，5 min，4 ℃)，棄上清液。用4 mL 含5%FCS的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸上述操作所得的細胞沉淀，置于200目篩網(wǎng)濾過至15 mL離心管，于血細胞計數(shù)板計算并記錄細胞密度。

1.2.4 FCM檢測細胞亞群 將細胞濃度調(diào)整為每孔100 μL中含有1.5×106個細胞，加入200 μL PBS洗滌1次，離心，棄上清液，每孔加100 μL PBS進行重懸。按照說明書用量將適量流式抗體加入細胞懸液中，渦旋振蕩15 s以混合抗體和細胞；4 ℃避光孵育30 min后用2 mL PBS緩沖液終止染色，離心(600×g，5 min)，棄上清液后重復洗滌細胞1次；最后使用250 μL上機液重懸細胞。使用FCM對染色細胞進行檢測，并用CytExpert軟件分析檢測結果。

2 結果

2.1 B細胞、NK細胞在約氏瘧原蟲感染小鼠脾臟中的百分比分離感染組和正常組小鼠脾臟，制備單細胞懸液。通過FCM檢測B細胞(CD3-CD19+)、NK細胞(CD19-CD3-NK1.1+)的百分比含量。結果顯示，感染組小鼠脾臟B細胞百分比[(60.36±3.43)%]高于正常組[(54.41±1.67)%，P<0.05]；感染組和正常組小鼠脾臟NK細胞百分比分別為(2.62±0.21)%、(3.90±2.02)%，二者差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。(圖1)

注：A.各組小鼠脾臟B細胞百分比；B.各組小鼠脾臟NK細胞百分比。圖1 B細胞、NK細胞在感染組和正常組小鼠脾臟中的百分比

2.2 IFN-γ在約氏瘧原蟲感染小鼠脾臟B細胞、NK細胞中的表達分離感染組和正常組小鼠脾臟，制備單細胞懸液。通過細胞表面分子染色，檢測IFN-γ在B細胞和NK細胞中的表達情況。結果顯示，感染組和正常組小鼠脾臟B細胞表達IFN-γ的百分比分別為(0.16±0.03)%、(0.13±0.03)%，二者差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。感染組和正常組小鼠脾臟NK細胞表達IFN-γ的百分比分別為(49.42±4.03)%、(53.31±9.43)%，二者差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。(圖2)

2.3 IL-12在約氏瘧原蟲感染小鼠脾臟B細胞、NK細胞中的表達分離感染組和正常組小鼠脾臟，制備單細胞懸液。通過細胞表面分子染色，檢測IL-12在B細胞和NK細胞中的表達情況。結果顯示，感染組小鼠B細胞表達IL-12的百分比[(0.70±0.10)%]較正常組[(0.43±0.02)%]明顯升高(P<0.01)。感染組和正常組小鼠NK細胞表達IL-12的百分比分別為(4.06±1.64)%、(4.35±1.31)%，二者差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。(圖3)

圖2 IFN-γ在各組小鼠脾臟B細胞、NK細胞中表達的流式圖圖3 IL-12在各組小鼠脾臟B細胞、NK細胞中表達的流式圖

2.4 IL-10在約氏瘧原蟲感染小鼠脾臟B細胞、NK細胞中的表達分離感染組和正常組小鼠脾臟，制備單細胞懸液。通過細胞表面分子染色，檢測IL-10在B細胞和NK細胞中的表達情況。結果顯示，感染組和正常組小鼠B細胞表達IL-10的百分比分別為(1.19±0.36)%、(0.70±0.31)%，二者差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。感染組小鼠NK細胞表達IL-10的百分比[(6.88±0.97)%]較正常組[(4.89±0.43)%]明顯升高(P<0.05)。(圖4)

圖4 IL-10在各組小鼠脾臟B細胞、NK細胞中表達的流式圖

3 討論

脾臟是人體中最大的外周免疫器官，為固有免疫和特異性免疫發(fā)揮作用的共同場所。B細胞可通過分泌抗體和激活CD4+T細胞來發(fā)揮免疫效應，是機體免疫系統(tǒng)的重要組成成分。而B細胞家族成員中的調(diào)節(jié)性B細胞可分泌IL-35、IL-10等細胞因子，發(fā)揮免疫抑制作用[11]。NK細胞是固有免疫細胞的一種，可識別抗原成分，發(fā)揮自然殺傷作用。感染約氏瘧原蟲后，小鼠脾臟B細胞明顯增加，而NK細胞減少，這提示機體感染約氏瘧原蟲后，體液免疫已發(fā)揮作用，而NK細胞介導的固有免疫過程可能還未起作用。

IFN-γ是Ⅱ型IFN，可以激活巨噬細胞的功能和增強NK細胞的殺傷作用[12]。同時其是促炎細胞因子的一種，能促進炎癥反應過程[13]。也有研究發(fā)現(xiàn)，NK細胞分泌的IFN-γ在惡性瘧原蟲感染中發(fā)揮一定的作用[14-15]。在本研究中，小鼠感染約氏瘧原蟲后，脾臟B細胞和NK細胞表達IFN-γ的水平下降，但與正常組沒有明顯的統(tǒng)計學差異，這提示感染瘧原蟲后，機體在一定程度上并不是通過上調(diào)IFN-γ的表達水平來抵抗瘧原蟲感染的。

IL-12是機體內(nèi)重要的細胞因子，主要由激活的免疫細胞產(chǎn)生，可驅動Th1對抗細胞內(nèi)細菌或原蟲的特異性免疫應答[16]，調(diào)節(jié)Th1/Th2的比值，增強Th1的作用[17]。另外，IL-12的存在，可以增強NK細胞對惡性瘧原蟲感染紅細胞的細胞毒性作用[18]。在本研究中，小鼠感染約氏瘧原蟲后，脾臟B細胞表達IL-12的水平升高，這提示機體可能通過上調(diào)B細胞表達IL-12的水平來發(fā)揮免疫作用。

IL-10為抗炎細胞因子的一種，可由多種免疫細胞產(chǎn)生，如CD4+T細胞、CD8+T細胞和B細胞等。同時人和鼠的NK細胞也可在各種外來病原微生物的刺激下產(chǎn)生IL-10[19-20]。其可以促進Th0向Th2轉化，同時抑制Th1反應[21]。另外，也有研究發(fā)現(xiàn)，IL-10在感染約氏瘧原蟲小鼠的免疫調(diào)節(jié)功能中不起主要作用[22]。在本研究中，小鼠感染約氏瘧原蟲后，脾臟NK細胞表達IL-10的水平明顯升高，而B細胞表達IL-10的水平?jīng)]有升高，這提示小鼠感染約氏瘧原蟲后，可能通過上調(diào)NK細胞表達IL-10的水平來發(fā)揮一定的負性調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，本研究結果表明，C57BL/6小鼠感染約氏瘧原蟲后脾臟B細胞和NK細胞及其細胞因子均發(fā)生變化，但變化趨勢不同。目前，關于瘧原蟲感染后機體免疫功能變化的研究結論不一，有研究發(fā)現(xiàn)，在瘧原蟲感染中，機體巨噬細胞被激活，產(chǎn)生IL-12促進NK細胞表達IFN-γ，IFN-γ又作用于巨噬細胞，激活T細胞發(fā)揮免疫保護作用[23]。此外，瘧原蟲感染機體免疫抑制的機制尚無定論，機體感染瘧原蟲后不僅可以抑制一些免疫細胞的功能，如DC和T細胞等[24]，而且可上調(diào)轉化生長因子β1和IL-10表達，起一定抑制作用[25]。本研究結果提示，機體在抗約氏瘧原蟲感染中，NK細胞不但沒有發(fā)揮比較大的免疫保護作用，而且可能通過上調(diào)IL-10的表達水平來發(fā)揮一定的免疫抑制作用，而B細胞則通過上調(diào)IL-12的表達水平來激活NK細胞、T細胞功能發(fā)揮免疫保護作用。本研究結果可為進一步探討約氏瘧原蟲對青蒿琥酯的耐藥機制提供一定參考，且對瘧疾免疫疫苗的研發(fā)具有一定意義。