鄭乃盛，汪婷婷，袁向亮，沈立松

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院 檢驗科，上海 200082)

在惡性腫瘤治療中，調(diào)節(jié)免疫抑制途徑實現(xiàn)了主要突破。雖然免疫治療給腫瘤患者帶來了福音，但許多患者仍表現(xiàn)出耐藥。有數(shù)據(jù)顯示，免疫檢查點抑制劑治療在篩選的PD-L1陽性胃癌患者中的治療反應(yīng)率僅為22.2%[1]。腫瘤相關(guān)巨噬細胞(tumor associated macrophage，TAM)促使胃癌腫瘤微環(huán)境成為一個免疫抑制的中心，TAM富集部位T細胞浸潤的數(shù)量和功能都不足[2]，殺傷性免疫細胞的功能受到抑制[3-4]，這些也促進胃癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移[5]及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[6]。最重要的一點，TAM與胃癌細胞高表達PD-L1高度相關(guān)[7]。這一點提示，TAM與胃癌細胞發(fā)生免疫逃逸和免疫治療耐藥有一定聯(lián)系。近年來研究發(fā)現(xiàn)，TAM外泌體對多種腫瘤細胞的生長、轉(zhuǎn)移及耐藥有促進作用[8-10]，其中包括胃癌細胞[11-12]。外泌體是直徑為100 nm左右的細胞外囊泡，攜帶多種蛋白和核酸，發(fā)揮細胞間交流的生物學(xué)作用。綜上推測，TAM來源外泌體有促進胃癌細胞產(chǎn)生免疫抑制的潛力。因此，本研究探究TAM外泌體促進胃癌細胞的免疫抑制作用及其產(chǎn)生的原因。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑前胃癌(mouse forestomach carcinoma，MFC)小鼠MFC細胞購自國家實驗細胞資源共享平臺；THP-1人單核細胞系、BGC-823人胃腺癌細胞購自中國科學(xué)院細胞庫；DMEM、RPMI 1640、DMEM/F12培養(yǎng)液和FCS均購自Gibco公司。

1.2 M2型巨噬細胞體外模型的構(gòu)建采用頸部脫臼法處死615品系小鼠(小鼠購自西普爾-必凱實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院動物實驗中心)，取其股骨及脛骨并用注射器吸取DMEM培養(yǎng)液將骨內(nèi)細胞沖出，直至骨頭變白。收集沖出的細胞懸液，以450×g離心5 min，棄上清液。加入含濃度為 100 U/mL的巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF)、10%FCS的DMEM/F12培養(yǎng)液。每隔3 d換液1次，并補充M-CSF，去除未貼壁細胞，7 d后得到骨髓來源的巨噬細胞。細胞貼壁后，為誘導(dǎo)TAM即M2型巨噬細胞，加入含20 ng/mL IL-4和20 ng/mL IL-13的DMEM/F12完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。所得細胞即為M2型巨噬細胞(體外模擬的TAM)。

1.3 細胞外泌體的提取培養(yǎng)細胞48 h，將培養(yǎng)液換為DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細胞培養(yǎng)上清液，以300×g離心10 min去除細胞沉淀；收集上清液，以2 000×g離心10 min去除死細胞及大顆粒；收集上清液，以10 000×g離心30 min去除小的細胞碎片及大直徑囊泡；收集上清液，在超速離心機[型號：CP100WX (HITACHI公司)]中以100 000×g離心90 min得到沉淀。去除上清液，將沉淀用PBS重懸洗滌1次，再以100 000×g離心70 min，此時得到的沉淀絕大多數(shù)即為外泌體，將其重懸于100 μL PBS中。

1.4 外泌體直徑和電鏡鑒定直徑鑒定實驗：將分離得到的外泌體樣本送至上海交通大學(xué)分子納米創(chuàng)新轉(zhuǎn)化中心進行納米顆粒跟蹤分析鑒定[直徑檢測儀型號：Zetaview(Particle Metrix公司)]。電鏡鑒定實驗：將分離得到的外泌體樣本送至復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院透射電鏡平臺進行檢測[透射電鏡型號：CM120(Philips公司)]。

1.5 外泌體攝取實驗使用PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Kits(Sigma-Aldrich公司)對外泌體樣本進行染色示蹤，并使用Exosome Spin Columns (MW3000) (Invitrogen公司)結(jié)合、吸附未結(jié)合外泌體的染料，用含10%FCS的DMEM/F12培養(yǎng)液重懸并加入至胃癌細胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)24 h后固定、染核，在共聚焦顯微鏡下拍攝胃癌細胞攝取外泌體的情況。

1.6 Western blotting向外泌體沉淀或6孔板細胞樣本中加入含有蛋白酶抑制劑的SDS裂解液100～200 μL，冰上裂解30 min，金屬浴100 ℃加熱10 min，最后進行BCA蛋白定量。向蛋白樣本中加入loading buffer，根據(jù)蛋白濃度進行調(diào)整，使每個樣本有一致的蛋白量，于10%SDS-PAGE上進行電泳，而后轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜并封閉，用相應(yīng)的一抗、二抗溶液孵育，并用Odyssey紅外成像系統(tǒng)(LI-COR Biosciences公司)掃描PVDF膜。本研究使用的一抗：抗PD-L1抗體(Abcam公司)，抗STAT1抗體(Abcam公司)，抗STAT3抗體(Abcam公司)，抗腫瘤易感基因(tumor suppressor gene 101, TSG101)抗體(Abcam公司)，抗β-actin抗體(CST公司)，抗CD63抗體(SBI公司)，抗熱休克蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)抗體(SBI公司)，抗CD81抗體(SBI公司),以上一抗稀釋比例均為1∶1 000。二抗：抗兔IgG (H+L) (DyLightTM680 Conjugate, CST公司)，抗鼠IgG (H+L) (DyLightTM800 4X PEG Conjugate, CST公司),以上二抗稀釋比例均為1∶15 000。

1.7 RT-PCR使用Direct-zol RNA提取試劑盒(ZYMO公司)提取細胞RNA，使用Prime Script RT Reagent(TaKaRa公司)反轉(zhuǎn)錄cDNA，根據(jù)Hieff qPCR SYBR Green Master Mix(YEASEN公司)說明書進行實時定量PCR，每個基因重復(fù)檢測3次，以GAPDH為內(nèi)參。

1.8 流式細胞術(shù)按照凋亡試劑盒Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit(Invitrogen公司)說明書進行操作，將5 μL Annexin V-FITC加入200 μL binding buffer懸浮的細胞懸液中孵育10 min，PBS洗滌后用200 μL binding buffer重懸，加入5 μL 7-氨基放線菌素D (7-amino-actinomycin D，7-AAD) 孵育5 min，最后加入250 μL PBS，使用BD FACS CANTO Ⅱ FCM(BD公司)進行流式細胞術(shù)分析。

1.9 天冬氨酸半胱氨酸特異性蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase, Caspase)-3/7熒光檢測T細胞殺傷實驗使用CD8a磁珠分選抗體(MACS公司)分離615品系小鼠脾臟細胞中的CD8+T細胞，并用1 μg/mL 抗CD3抗體(Biolegend公司)、1 μg/mL 抗CD28抗體(Biolegend公司)激活抗體和10 ng/mL IL-2(PeproTech公司)激活CD8+T細胞24 h，收集T細胞并計數(shù)，與胃癌細胞按照一定比例(T細胞∶MFC細胞分別為0∶1、5∶1、10∶1、20∶1)在96孔板中共培養(yǎng)一定時間(0、12、24和48 h)。按照凋亡檢測試劑盒Caspase-3/7 Green Detection Reagent(Invitrogen公司)說明書進行操作，將2.5 μL的凋亡試劑加入到1 mL含5%FCS的PBS中，稀釋至5 μmol/L。棄去共培養(yǎng)細胞上清液，加入5 μmol/L Caspase-3/7 Green Detection Reagent，37 ℃染色至少30 min。染色后直接于熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞綠色熒光染色情況。

1.10 MicroArray技術(shù)使用TRIzol裂解液(Invitrogen公司)裂解胃癌細胞MFC，細胞RNA的提取、芯片檢測及數(shù)據(jù)分析由上海伯豪生物技術(shù)有限公司完成。

2 結(jié)果

2.1 胃癌細胞攝取M2型巨噬細胞外泌體(M2 macrophages＇ exosome，M2e)的情況極化后的巨噬細胞主要有M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞2種極化分型，TAM在腫瘤微環(huán)境中主要以M2型巨噬細胞為主，高表達CD163及CD206等細胞表面分子。因此，體外實驗使用M2型巨噬細胞模擬TAM。鼠源和人源的原始單核細胞經(jīng)過M2型巨噬細胞誘導(dǎo)極化后，CD11b、F4/80陽性的小鼠骨髓來源巨噬細胞(bone marrow derived macrophage，BMDM)表面CD206增加；由人單核細胞系THP-1直接誘導(dǎo)的M2型巨噬細胞表面CD163、CD206增加(圖1A)。

模擬TAM體外建立M2型巨噬細胞模型后，通過超速離心法分離M2型巨噬細胞培養(yǎng)上清液中的外泌體，并通過Western blotting鑒定外泌體中特異性標志蛋白HSP70、CD63、CD81、TSG101(圖1B)；用透射電鏡鑒定所分離的外泌體，其直徑為50～120 nm(圖1C)；用納米顆粒跟蹤分析所分離的外泌體，其直徑約為100 nm(圖1D)；最后使用標記后的外泌體與MFC細胞共培養(yǎng)，觀察細胞1 d后攝取外泌體的情況，結(jié)果顯示，熒光顯微鏡下MFC細胞1 d后攝取了大量的外泌體于細胞質(zhì)中(圖1E)。

注：A.體外構(gòu)建TAM即M2型巨噬細胞，并用流式細胞術(shù)鑒定其特征性膜蛋白, PMA為佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(phorbol 12-myristate 13-acetate)；B. Western blotting鑒定外泌體特征性蛋白；C. 透射電鏡鑒定所提取的外泌體樣本，bar值為500 nm；D.Zetaview鑒定外泌體樣本的直徑大??；E.PKH67熒光染色外泌體后，與MFC細胞共培養(yǎng)24 h，熒光顯微鏡下分析外泌體的攝取情況(×400)。圖1 M2e鑒定與攝取實驗

2.2 胃癌細胞攝取M2e后對T細胞殺傷功能的影響在機體內(nèi)對腫瘤起主要殺傷作用的是活化的CD8+T細胞。CD8+T細胞通過識別腫瘤細胞表面的特異性抗原，并通過共刺激分子活化T細胞，活化的T細胞分泌IFN-γ和顆粒酶，激活腫瘤細胞的凋亡途徑，使腫瘤細胞死亡。本研究考慮TAM外泌體可使胃癌細胞發(fā)生某些表型改變從而抑制CD8+T細胞的殺傷功能。從MFC細胞所屬的615品系小鼠脾臟中使用磁珠抗體分選出CD8+T細胞，用抗CD3+抗CD28共刺激分子激活抗體激活原始T細胞，并用流式細胞術(shù)檢測CD8+T細胞活化表面標志物CD69(圖2A)?；罨腃D8+T細胞與MFC細胞以20∶1的比例進行共培養(yǎng)，使用Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit 在24 h后測定凋亡情況。結(jié)果顯示，加入外泌體后MFC細胞Annexin V及7-AAD雙陰性比例升高(圖2B)，即TAM來源外泌體可以使MFC細胞在高比例的T細胞存在下存活比例增加，抵抗T細胞殺傷的能力增強。

同樣關(guān)于TAM外泌體共培養(yǎng)后的胃癌細胞對T細胞殺傷功能的影響，本研究用另外一種方法也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果?；罨腃D8+T細胞與MFC細胞以0∶1、5∶1、10∶1、20∶1的比例進行共培養(yǎng)后，使用Caspase-3/7 Green Detection Reagent在熒光顯微鏡下檢測MFC細胞的凋亡情況，并統(tǒng)計MFC細胞的存活比例。結(jié)果顯示，熒光顯微鏡同等放大倍數(shù)視野下可見，M2e使MFC細胞在CD8+T細胞殺傷作用下顯示凋亡的綠色熒光強度減弱，帶有綠色熒光的細胞數(shù)目減少(圖3A)；在高CD8+T細胞比例(T細胞∶MFC細胞=20∶1)下，M2e使MFC熒光陽性細胞的比例降低(圖3B)。說明M2e能使胃癌細胞抵抗活化的CD8+T細胞的殺傷作用，從而產(chǎn)生免疫逃逸。

2.3 M2e對胃癌細胞IFN通路的影響為了更進一步了解TAM外泌體對胃癌細胞產(chǎn)生T細胞殺傷抵抗的具體機制，需要分析出M2e對胃癌細胞的具體信號通路。本研究通過MicroArray技術(shù)分析與M2e共培養(yǎng)后的MFC細胞的通路變化情況，發(fā)現(xiàn)IFN通路是外泌體對MFC細胞激活最強的通路(圖4A)。通過RT-PCR對鼠源和人源M2e共培養(yǎng)后的胃癌細胞IFN通路相關(guān)基因進行驗證，發(fā)現(xiàn)在外泌體刺激下，IFN通路相關(guān)基因及IFN刺激基因表達都升高了(圖4B)。使用Western blotting分析IFN通路2種相關(guān)蛋白STAT1和STAT3，結(jié)果顯示，M2e刺激了這2種蛋白的表達(圖4C)。

2.4 胃癌細胞攝取M2e后對PD-L1表達的影響上述結(jié)果表明，M2e促進了IFN通路的激活。其中IFN-γ信號通路，可在多種腫瘤中促進腫瘤細胞的PD-L1表達[13]。那么IFN通路的激活，促使PD-L1表達增加，從而使T細胞功能受到抑制，這也可能是胃癌細胞抵抗CD8+T細胞殺傷的一個重要原因。本研究對這一猜想進行了驗證。RT-PCR結(jié)果顯示，與M2e共培養(yǎng)的胃癌細胞PD-L1基因表達水平升高(圖5A)。Western blotting結(jié)果顯示，與M2e共培養(yǎng)的胃癌細胞PD-L1整體蛋白表達水平升高(圖5B)。通過流式細胞術(shù)檢測也同樣發(fā)現(xiàn)，與M2e共培養(yǎng)的胃癌細胞PD-L1膜蛋白表達水平升高(圖5C)。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，M2e可促進胃癌細胞表達PD-L1，并與共培養(yǎng)外泌體的量呈正相關(guān)。

注：A. 流式細胞術(shù)鑒定小鼠脾臟中磁珠分選的CD8+T細胞及加入不同濃度IL-2、抗CD3激活抗體、抗CD28激活抗體活化后的CD8+T細胞；B.流式細胞術(shù)檢測MFC細胞與M2e共培養(yǎng)后，被活化CD8+T細胞殺傷的凋亡情況。圖2 流式細胞術(shù)檢測胃癌細胞攝取M2e后對T細胞殺傷功能的影響

注：A.熒光顯微鏡下觀察MFC細胞與M2e共培養(yǎng)后，被活化CD8+T細胞殺傷的凋亡情況(×100)；B.統(tǒng)計MFC細胞與M2e共培養(yǎng)后的MFC細胞被T細胞殺傷未被染成綠色熒光的細胞生存率。與MFC細胞比較，*P<0.05，**P<0.001。圖3 Caspase-3/7熒光檢測胃癌細胞攝取M2e后對T細胞殺傷功能的影響

注：A.MicroArray技術(shù)分析胃癌細胞攝取M2e后通路表達變化，其中IFN通路激活明顯；B.RT-PCR檢測胃癌細胞MFC、BGC-823與M2e共培養(yǎng)后IFN通路和IFN刺激基因的表達情況；C.Western blotting檢測MFC細胞與不同濃度M2e共培養(yǎng)后IFN通路相關(guān)蛋白STAT1和STAT3的表達情況。與MFC細胞比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與BGC-823比較，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。圖4 M2e對胃癌細胞IFN通路的影響

注：A.RT-PCR檢測IFN和M2e刺激下PD-L1基因的表達水平；B. Western blotting檢測MFC細胞與不同濃度M2e共培養(yǎng)后PD-L1的表達水平；C.流式細胞術(shù)檢測胃癌細胞MFC、BGC-823與不同濃度M2e共培養(yǎng)后PD-L1的表達水平。*P<0.05，**P<0.001；#P<0.05，##P<0.01 。圖5 M2e對PD-L1表達的影響

3 討論

本研究通過體外實驗建立M2型巨噬細胞模擬TAM，并提取外泌體與胃癌細胞共培養(yǎng)。結(jié)果顯示，M2e可被胃癌細胞大量攝取。攝取M2e的胃癌細胞與活化CD8+T細胞共培養(yǎng)，相比未攝取外泌體的胃癌細胞，攝取了M2e的胃癌細胞凋亡比例下降，其減弱了CD8+T細胞的殺傷作用。并且攝取了M2e的胃癌細胞IFN通路被激活，PD-L1的蛋白表達水平升高，這是胃癌細胞發(fā)生免疫逃逸的重要原因。

腫瘤微環(huán)境中的腫瘤細胞和腫瘤基質(zhì)細胞等都傾向于表達PD-L1等免疫檢查點的抑制性配體，從而導(dǎo)致T細胞的功能衰竭。于是本研究著眼于PD-L1表達可能是腫瘤微環(huán)境中各細胞間的交流所導(dǎo)致的最終結(jié)果來探究T細胞功能喪失的原因。本研究分離了M2e，與胃癌細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)M2e能使胃癌細胞減弱活化CD8+T細胞的殺傷作用，CD8+T細胞是消除腫瘤的主力，而恢復(fù)T細胞殺傷腫瘤細胞的功能是免疫檢查點抑制劑治療的核心理念，如果T細胞的殺傷功能被抑制，那么免疫檢查點抑制劑治療耐藥則會出現(xiàn)。通過MicroArray技術(shù)分析M2e對胃癌細胞通路的激活情況，結(jié)果顯示，M2e對胃癌細胞IFN通路有較強的刺激作用，并且應(yīng)對病毒侵襲的STAT1通路信號最強。IFN可激活免疫細胞的細胞因子，IFN信號通路啟動后活化下游JAK-STAT效應(yīng)信號通路，激活胞內(nèi)一系列干擾素刺激基因(interferon-stimulated gene，ISG)表達。PD-L1是一種ISG，由IFN信號通路中的STAT1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄[14]。本研究對PD-L1分子表達上調(diào)也進行了驗證，IFN-γ和M2e都可使PD-L1表達增加。PD-L1能與T細胞表面的PD-1結(jié)合，這也是T細胞殺傷功能減弱的一個重要原因。所以對于腫瘤細胞來說，IFN并非單純的一個誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)激活的細胞因子。有研究則發(fā)現(xiàn)，IFN在黑色素瘤等腫瘤細胞中持續(xù)激活信號，可使腫瘤細胞發(fā)生免疫治療耐藥[15]。TAM表達PD-L1并且通過多種途徑參與形成免疫抑制性腫瘤微環(huán)境，針對TAM的治療與針對腫瘤細胞的治療方案聯(lián)合起來，可以進一步提高免疫檢查點抑制劑治療腫瘤的效果[13，16]。

IFN通常具有免疫激活作用，但多項研究發(fā)現(xiàn)，IFN信號有助于形成免疫抑制的腫瘤微環(huán)境，并誘導(dǎo)免疫檢查點抑制劑治療耐藥[17-18]。免疫細胞IFN的產(chǎn)生可以使PD-L1等ISG在腫瘤微環(huán)境中表達，導(dǎo)致T細胞功能障礙，這種現(xiàn)象會誘導(dǎo)免疫檢查點抑制劑治療產(chǎn)生適應(yīng)性耐藥[19-20]。在纖維肉瘤模型中發(fā)現(xiàn)，T細胞產(chǎn)生過多的IFN-γ，促進腫瘤免疫抑制微環(huán)境的形成和腫瘤的生長[21]。在抗PD-1治療反應(yīng)預(yù)測相關(guān)性研究中，與IFN通路相關(guān)的ISG如PD-L1、IDO1、CXCL9等也被列入預(yù)測標志物當(dāng)中[22]。所以IFN信號通路對于腫瘤具有雙重作用，過多的IFN和長時間的IFN通路激活會促進腫瘤生長。本研究則發(fā)現(xiàn)，TAM的外泌體可以激活胃癌細胞的IFN通路，而TAM在腫瘤組織中一直存在，通過外泌體的形式源源不斷地使腫瘤細胞IFN通路被激活，這便是免疫檢查點抑制劑耐藥的一個重要原因。由于TAM外泌體內(nèi)的物質(zhì)復(fù)雜多樣，其對胃癌細胞產(chǎn)生的影響不止IFN信號通路激活一個層面。TAM外泌體導(dǎo)致胃癌細胞IFN通路激活而產(chǎn)生免疫逃逸的機制尚不明確，以及是否有其他方式協(xié)助腫瘤免疫逃逸，亟待深入研究。

腫瘤微環(huán)境中TAM等細胞與腫瘤細胞之間的細胞交流，包括通過外泌體是腫瘤免疫檢查點抑制劑治療產(chǎn)生耐藥的一種重要方式。本研究證實了M2e對胃癌細胞的免疫逃逸具有一定作用，解釋了TAM在促進腫瘤進展中免疫逃逸的重要意義，這為靶向TAM與腫瘤細胞間交流的治療提供了新思路。