張彥芬，高大，易媛媛，趙榮偉

(1. 內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 血液科，呼和浩特 010050；2.內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 婦產科，呼和浩特 010050)

白血病是兒童和青少年最常見的惡性血液系統(tǒng)疾病之一[1]。克隆性白血病細胞由于分化障礙，增殖失控，凋亡受阻等導致其在骨髓或其他造血組織中異常集聚，并浸潤其他組織和器官，同時抑制造血組織的正常功能。目前對白血病的主要治療方法有放療、化療和異基因造血干細胞移植等[2]。盡管化療和異體移植的聯合應用提高了療效，但化療藥物的副作用如導致心律不齊，加劇彌散性血管內凝血以及產生耐藥性等降低了疾病的治愈率[2]。因此，尋找更加安全有效的治療藥物迫在眉睫。丹皮酚(paeonol，Pae)，又稱牡丹酚或芍藥醇，是牡丹根皮和徐長卿的主要活性成分，具有免疫調節(jié)和心腦血管保護等多種藥理作用[3]。有體外實驗表明，Pae可殺傷多種惡性腫瘤細胞[4]，有可能成為惡性腫瘤治療藥物。孫國平等[5]發(fā)現，Pae可抑制白血病細胞增殖，但其對白血病細胞凋亡的影響尚未見報道，而它殺傷白血病細胞的機制仍不清楚。第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物(phosphatase and tension homologue deleted on chromosome 10，PTEN)作為抑癌基因，過表達可抑制白血病細胞的增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡并導致細胞周期阻滯于G0/G1期[6-7]。miR-106a在多種白血病細胞系中表達上調，其在白血病發(fā)生、發(fā)展過程中可能發(fā)揮一定作用[8]。研究通過體外實驗探究Pae對白血病細胞增殖、凋亡的影響，進一步觀察Pae對miR-106a-5p和PTEN表達的影響，探究其作用機制，以期為白血病的臨床治療提供新方法和新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、試劑與儀器收集2016年1月至2017年1月于內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院血液科收治的初診白血病患者8例，經血象和骨髓病理活檢臨床確診。白血病細胞K562，購自中國科學院上海細胞庫；Pae試劑，購自上海譜振生物科技有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)液，購自Hyclone公司；LipofectamineTM2000轉染試劑和TRIzol抽提試劑，購自Invitrogen公司?？筸iR-106a-5p、miR-NC抗體、miR-106a-5p mimics、miR-NC、siPTEN和siNC，購自北京華大基因研究中心有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒，購自Promega公司。MTT試劑、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、Annexin V-FITC/PI試劑盒、放射免疫沉淀實驗(radioimmunoprecipitation assay，RIPA)裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、PVDF膜、Western blotting洗滌液及封閉液，購自北京索萊寶科技有限公司。兔抗人PTEN、GAPDH、CyclinD1、Bcl-2、p21及Bax多克隆抗體，購自Santa Cruz公司；羊抗兔IgG-HRP，購自武漢博士德生物工程有限公司。凝膠成像系統(tǒng)，來自伯樂生命醫(yī)學產品(上海)有限公司；熒光定量PCR儀，來自ABI公司；FCM，來自BD公司；酶標儀，來自AWARENESS TECHNOLOGY INC公司。

1.2 細胞的培養(yǎng)、轉染與分組參照文獻[9]方法分離初診白血病患者原代白血病細胞。使用RPMI 1640培養(yǎng)液分別培養(yǎng)該原代白血病細胞及K562細胞。細胞培養(yǎng)條件為濕度95%，溫度37 ℃，CO2體積分數5%。當細胞鋪底率至約80%時，用胰蛋白酶消化后傳代。

藥物處理：取對數生長期K562細胞，用RPMI 1640完全培養(yǎng)液調整密度，以2×105個/孔細胞密度接種于96孔板，于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。分別給予不同濃度的Pae溶液[5](0、15、30、60 mg/mL)處理，依次標記為Con組、Pae 15 mg/L組、30 mg/L組和60 mg/L組，培養(yǎng)24、48及72 h后，進行下一步研究。

細胞轉染：取對數生長期的白血病細胞K562，用RPMI 1640完全培養(yǎng)液調整細胞密度，以2×105個/孔接種于96孔板。當細胞鋪底率達60%時，用LipofectamineTM2000脂質體轉染技術將抗miR-106a-5p和抗miR-NC抗體分別轉染至K562細胞，依次命名為抗miR-106a-5p組和抗miR-NC組。將2組細胞置于培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)6 h，更換新鮮培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)，以待后續(xù)研究。按照上述轉染方法分別將miR-106a-5p mimics、miR-NC、siPTEN和siNC轉染至K562細胞，用30 mg/mL Pae溶液處理，并依次分為Pae+miR-106a-5p組、Pae+miR-NC組、Pae+siPTEN組和Pae+siNC組，培養(yǎng)24、48及72 h后進行后續(xù)研究。

1.3 qRT-PCR檢測用TRIzol試劑分別抽提各組K562細胞總RNA，檢測其純度；反轉錄為cDNA，進行qRT-PCR擴增。引物由北京華大基因研究中心有限公司合成，序列如下(表1)。miR-106a-5p和PTENmRNA的檢測分別以U6和GAPDH為內參，其相對表達量采用2-△△Ct法計算。

表1 引物序列

1.4 Western blotting檢測藥物處理或轉染后48 h，收集各組K562細胞，用RIPA裂解液裂解，提取總蛋白。通過BCA蛋白定量試劑盒調整蛋白濃度。沸水浴3～5 min使蛋白充分變性，冷卻至室溫備用。取30 μg變性蛋白，進行SDS-PAGE，結束后轉移至PVDF膜。用洗滌液洗膜，后用封閉液室溫封閉1 h。除去封閉液，加入抗PTEN、GAPDH、CyclinD1、Bcl-2、p21及Bax一抗(1∶1 000)，置側擺搖床4 ℃孵育過夜。洗滌液洗膜后，加入相應二抗(1∶1 000)室溫孵育2 h，化學發(fā)光法顯色。凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，分析目的條帶灰度值。

1.5 MTT法檢測取轉染及未轉染K562細胞，接種于96孔板，按照1.2分組給予不同劑量藥物處理，培養(yǎng)24、48及72 h后于每孔加入MTT溶液(20 μL/孔)；孵育4 h后，吸凈孔內液體，每孔加入150 μL DMSO，搖床均搖10 min至其完全溶解。酶標儀檢測光密度D(490 nm)。

1.6 FACS檢測取藥物處理或轉染48 h的各組K562細胞，胰蛋白酶消化，離心棄上清液后收集各組細胞，PBS漂洗2次。加入適量結合緩沖液重懸細胞，按照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書依次加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，混勻后FCM檢測細胞凋亡情況。

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1.7 雙熒光素酶報告基因實驗通過靶基因預測數據庫TargetScanHuman 7.1網站(http：//www.targetscan.org/vert_71/)預測miR-106a-5p的靶基因。查詢發(fā)現miR-106a-5p的5’端能與PTEN的3’UTR特異性結合，猜測PTEN是miR-106a-5p的靶基因。為驗證這一預測，構建野生型WT-PTEN和突變型MUT-PTEN的PTEN3’UTR熒光素酶報告基因載體。按1.2中LipofectamineTM2000脂質體轉染法將miR-106a-5p和miR-NC分別與WT-PTEN和MUT-PTEN共轉染至K562細胞，于細胞培養(yǎng)箱(濕度95%，溫度37 ℃，CO2體積分數5%)培養(yǎng)48 h。收集各組細胞，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書檢測各組細胞PTEN的表達。

2 結果

2.1 Pae對初診白血病患者原代白血病細胞增殖、凋亡的影響與Con組相比，Pae處理24 h后各組原代白血病細胞的增殖能力差異不顯著；與Con組相比，Pae處理48、72 h后各組白血病細胞增殖能力顯著下降(P<0.05，圖1A)。與Con組相比，Pae 15 mg/L組、30 mg/L組及60 mg/L組原代白血病細胞的凋亡率顯著升高(P<0.05，圖1B)。

注：A. Pae對初診白血病患者原代白血病細胞增殖能力的影響；B. Pae對初診白血病患者原代白血病細胞凋亡率的影響。與Con組比較，*P<0.05。圖1 Pae對初診白血病患者原代白血病細胞增殖和凋亡的影響

2.2 Pae對白血病細胞K562增殖、凋亡的影響與Con組相比，Pae處理24 h后， K562細胞的增殖能力變化不顯著；Pae處理48和72 h后，各組K562細胞增殖能力顯著下降(P<0.05，圖2A)。與Con組相比，15 mg/L組K562細胞凋亡率[(6.51±0.13)%vs(14.06±0.60)%]顯著升高，CyclinD1[(0.79±0.00)vs(0.68±0.00)]和Bcl-2[(0.92±0.00)vs(0.76±0.00)]表達水平均顯著降低，p21[(0.21±0.00)vs(0.37±0.00)]和Bax[(0.16±0.00)vs(0.31±0.00)]表達水平均顯著升高；與Con組相比，30 mg/L組K562細胞凋亡率[(6.51±0.13)%vs(24.26±0.92)%]顯著升高，CyclinD1[(0.79±0.00)vs(0.46±0.00)]和Bcl-2[(0.92±0.00)vs(0.51±0.00)]表達水平均顯著降低，p21[(0.21±0.00)vs(0.57±0.00)]和Bax[(0.16±0.00)vs(0.47±0.00)]表達水平均顯著升高；與Con組相比，60 mg/L組K562細胞凋亡率[(6.51±0.13)%vs(28.66±0.18)%]顯著升高，CyclinD1[(0.79±0.00)vs(0.33±0.00)]和Bcl-2[(0.92±0.00)vs(0.36±0.00)]表達水平均顯著降低，p21[(0.21±0.00)vs(0.78±0.00)]和Bax[(0.16±0.00)vs(0.74±0.00)]表達水平均顯著升高。(均P<0.05， 圖2B～2E)

以上結果表明，Pae可抑制白血病細胞K562增殖，促進細胞凋亡，其抑制或促進程度與Pae的濃度存在一定劑量效應。

注：A. Pae對K562細胞增殖的影響；B～C. Pae對K562細胞凋亡的影響；D～E. Pae對K562細胞增殖、凋亡相關蛋白表達的影響。與Con組比較，*P<0.05 。圖2 Pae對K562細胞增殖、凋亡及相關蛋白表達的影響

2.3 Pae對白血病細胞K562miR-106a-5p、PTEN表達的影響與Con組相比，Pae 15 mg/L組[(1.21±0.00)vs(0.99±0.00)]、30 mg/L組[(1.21±0.00)vs(0.50±0.00)]及60 mg/L組[(1.21±0.00)vs(0.41±0.00)]miR-106a-5p的表達水平顯著降低；與Con組相比，Pae 15 mg/L組[(0.31±0.00)vs(0.47±0.00)]、30 mg/L組[(0.31±0.00)vs(0.75±0.00)]及60 mg/L組[(0.31±0.00)vs(0.83±0.00)]PTEN的表達水平顯著升高。(均P<0.05， 圖3A、3B)

以上結果表明，Pae可抑制白血病細胞K562miR-106a-5p的表達，促進PTEN的表達，其抑制或促進程度與Pae的濃度存在一定劑量效應。

以上結果表明，抑制miR-106a-5p表達可抑制白血病細胞K562的增殖，促進其凋亡并影響相關蛋白表達。

注：A. Pae對K562細胞miR-106a-5p mRNA表達的影響；B. Pae對K562細胞PTEN蛋白表達的影響。與Con組比較，*P<0.05。圖3 Pae對K562細胞 miR-106a-5p、PTEN表達的影響

注：A. miR-106a-5p mRNA相對表達量；B. 抑制miR-106a-5p表達對白血病細胞K562增殖的影響；C. 抑制miR-106a-5p表達對K562細胞凋亡的影響；D.抑制miR-106a-5p表達對K562細胞增殖、凋亡相關蛋白表達的影響。與抗miR-NC組比較，*P<0.05。圖4 抑制miR-106a-5p表達對白血病細胞K562增殖、凋亡及相關蛋白表達的影響

2.5 過表達miR-106a-5p對Pae作用下白血病細胞K562增殖、凋亡的影響與Con組相比，Pae組K562細胞miR-106a-5p表達水平顯著降低[(1.21±0.00)vs(0.48±0.00)，P<0.05]；與Pae+miR-NC組相比， Pae+miR-106a-5p組K562細胞miR-106a-5p表達水平顯著升高[(0.46±0.00)vs(0.79±0.00)，P<0.05]。(圖5A)

Pae作用24 h后，Con組、Pae組、Pae+miR-NC組和Pae+miR-106a-5p組K562細胞增殖能力無顯著變化(P>0.05)，48和72 h后，Pae組K562細胞增殖能力顯著低于Con組，Pae+miR-106a-5p組增殖能力顯著高于Pae+miR-NC組(均P<0.05，圖5B)。與Con組相比，Pae組K562細胞凋亡率顯著增加[(6.51±0.13)%vs(24.26±0.92)%]，CyclinD1和Bcl-2的表達水平顯著降低[(0.79±0.00)vs(0.46±0.00)、(0.92±0.00)vs(0.51±0.00)]，p21和Bax的表達水平顯著升高[(0.21±0.00)vs(0.77±0.00)、(0.16±0.00)vs(0.67±0.00)](均P<0.05，圖5C、5D)。與Pae+miR-NC組相比，Pae+miR-106a-5p組K562細胞凋亡率顯著下降[(24.00±0.38)%vs(15.69±0.76)%]，CyclinD1和Bcl-2的表達水平顯著升高[(0.37±0.00)vs(0.64±0.00)、(0.33±0.00)vs(0.62±0.00)]，p21和Bax的表達水平顯著降低[(0.78±0.00)vs(0.41±0.00)、(0.68±0.00)vs(0.40±0.00)](均P<0.05，圖5C、5D)。以上結果表明，過表達miR-106a-5p可顯著逆轉Pae對白血病細胞K562的增殖抑制和凋亡促進作用。

注：A. miR-106a-5p相對表達量；B. 過表達miR-106a-5p可逆轉Pae對K562細胞增殖的抑制作用；C. 過表達miR-106a-5p可逆轉Pae對K562細胞凋亡的促進作用；D. 過表達miR-106a-5p對Pae作用下K562細胞增殖、凋亡相關蛋白表達的影響。與Con組比較，*P<0.05；與Pae+miR-NC組比較，#P<0.05。圖5 過表達miR-106a-5p可逆轉Pae對白血病細胞K562增殖、凋亡的影響

2.6 miR-106a-5p靶向PTENmiR-106a-5p與PTEN3’UTR存在特異性結合位點(圖6A)。與miR-NC+WT-PTEN共轉染組比較，miR-106a-5p mimics+WT-PTEN共轉染組K562細胞熒光素酶活性顯著降低[(1.10±0.00)vs(0.41±0.00)，P<0.05，圖6B]。與miR-NC+MUT-PTEN共轉染組比較，miR-106a-5p mimics+MUT-PTEN共轉染組K562細胞熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學意義[(1.09±0.00)vs(1.09±0.00)，P>0.05, 圖6B]。與miR-NC組相比，miR-106a-5p組K562細胞PTEN表達水平顯著降低[(0.39±0.00)vs(0.07±0.00)]；與抗miR-NC組相比，抗miR-106a-5p組K562細胞PTEN表達水平顯著升高[(0.41±0.00)vs(0.82±0.00)]。(均P<0.05，圖6C)

以上結果表明，在K562細胞中，miR-106a-5p可負調控PTEN的表達。

注：A. PTEN的3’UTR含miR-106a-5p的互補核苷酸序列；B. 雙熒光素酶報告基因實驗；C. miR-106a-5p調控PTEN的表達。與miR-NC組比較，*P<0.05；與抗miR-NC組比較，#P<0.05。圖6 miR-106a-5p靶向調控PTEN的表達

2.7 抑制PTEN表達對Pae作用下白血病細胞K562增殖、凋亡的影響Pae作用24 h后，Con組、Pae組、Pae+siNC組和Pae+siPTEN組K562細胞增殖能力變化差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；48、72 h后，Pae組細胞增殖能力顯著低于Con組，Pae+siPTEN組細胞增殖能力顯著高于Pae+siNC組(均P<0.05，圖7A)。

與Con組比較，Pae組細胞凋亡率顯著升高[(6.51±0.13)%vs(24.26±0.92)%]，CyclinD1和Bcl-2表達水平顯著降低[(0.79±0.00)vs(0.46±0.00)、(0.92±0.00)vs(0.51±0.00)]，PTEN、p21和Bax表達水平顯著升高[(0.31±0.00)vs(0.74±0.00)、(0.21±0.00)vs(0.74±0.00)和(0.16±0.00)vs(0.67±0.00)]；與Pae+siNC組比較，Pae+siPTEN組K562細胞凋亡率顯著降低[(24.37±1.17)%vs(12.80±0.26)%]，CyclinD1和Bcl-2表達水平顯著升高[(0.47±0.00)vs(0.64±0.00)、(0.51±0.00)vs(0.69±0.00)]，PTEN、p21和Bax表達水平顯著降低[(0.82±0.00)vs(0.58±0.00)、(0.73±0.00)vs(0.49±0.00)、(0.68±0.00)vs(0.39±0.00)]。(均P<0.05，圖7B～7C)

可見，抑制PTEN表達可顯著逆轉Pae對白血病細胞K562的增殖抑制和凋亡促進作用。

3 討論

近年來，隨著對中藥研究的不斷深入，Pae的抗腫瘤活性被不斷揭示。Pae在體內外均具有抑制前列腺癌細胞生長的作用[10]，其還可誘導卵巢癌細胞的凋亡[11]。Pae與阿奇霉素的聯合應用可抑制乳腺癌細胞增殖并促進腫瘤細胞凋亡[12]。Pae還可通過下調MMP-2和MMP-9蛋白表達，抑制人胃癌BGC823細胞生長、遷移和侵襲[13]。研究首先鑒定其對白血病患者原代白血病細胞的影響，結果顯示Pae呈濃度依賴性地抑制細胞增殖，促進細胞凋亡。隨后，以白血病細胞K562為研究對象的進一步功能研究發(fā)現，Pae呈濃度依賴性地抑制K562細胞增殖，促進細胞凋亡，這與孫國平等[5]的研究結果相一致。同時，qRT-PCR和Western blotting檢測結果顯示，Pae呈濃度依賴性地抑制CyclinD1和Bcl-2表達，促進p21和Bax表達，與其抗增殖、促凋亡作用吻合。此外，Pae呈濃度依賴性地抑制miR-106a-5p表達，促進PTEN表達。研究結果提示，Pae對白血病細胞的增殖抑制作用和凋亡促進作用可能與調控miR-106a-5p和PTEN表達有關。

注：A. 抑制PTEN表達可逆轉Pae對K562細胞增殖的抑制作用；B. 抑制PTEN表達可逆轉Pae對K562細胞凋亡的促進作用；C. 抑制PTEN表達對Pae作用下K562細胞增殖、凋亡相關蛋白表達的影響。與Con組比較，*P<0.05；與Pae+siNC組比較，#P<0.05。圖7 抑制PTEN表達可逆轉Pae對白血病細胞K562增殖、凋亡及相關蛋白表達的影響

miR-106a-5p為miR-17家族成員。大量研究表明，miR-106a-5p在胃癌[14]、結腸癌[15]等多種腫瘤組織和細胞中異常低表達，參與調控腫瘤的發(fā)生發(fā)展。例如，miR-106a-5p通過靶向PAK5抑制腎癌細胞的遷移和侵襲[16]，還可靶向HMGA2抑制骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲[17]。張文娟[18]通過基因芯片技術證實，抗腫瘤藥物DMC可使慢性粒細胞白血病細胞中miR-106a-5p表達下調，證明miRNA在白血病的發(fā)展中發(fā)揮重要作用。研究顯示，抑制miR-106a-5p表達后，K562細胞的增殖能力顯著降低，凋亡率顯著增加，CyclinD1和Bcl-2的表達顯著降低，p21和Bax的表達顯著增加，與Pae對白血病細胞的作用一致。以上研究結果提示，Pae通過下調miR-106a-5p表達抑制白血病細胞增殖，促進其凋亡，而也有類似研究證明miR-106a-5p在不同腫瘤中發(fā)揮不同作用。

PTEN是最早發(fā)現的具有雙特異磷酸酶活性的抑癌基因。有研究表明，急性髓細胞白血病和急性淋巴細胞白血病中PTEN表達均顯著下調[19-20]。慢性淋巴細胞白血病中PTEN的低表達可能與miR-26a和miR-214的異常表達有關[21]。miR-21還可通過調控PTEN/AKT信號通路抑制白血病細胞K562的增殖和遷移[22]。雙熒光素酶報告基因實驗和Western blotting檢測結果顯示，PTEN是miR-106a-5p的靶基因，miR-106a-5p可負調控PTEN的表達。由此提示，miR-106a-5p/PTEN信號通路在Pae針對白血病細胞增殖和凋亡的調控中發(fā)揮一定作用。為進一步證明Pae是通過下調miR-106a-5p/PTEN軸調控K562細胞增殖及凋亡的，將miR-106a-5p mimics或siPTEN轉染至K562細胞，隨后用Pae處理，研究發(fā)現過表達miR-106a-5p或抑制PTEN表達可逆轉Pae對白血病細胞增殖、凋亡的影響。以上研究結果提示，Pae通過miR-106a-5p/PTEN軸參與調控白血病細胞的增殖和凋亡。然而，除miR-106a-5p/PTEN軸外，還可能存在其他調控途徑，這些問題將是進一步研究的重點。

綜上所述，Pae可通過下調miR-106a-5p/PTEN信號通路蛋白抑制白血病細胞的增殖，促進其凋亡，這為白血病的臨床治療提供了新的方法和思路。