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        Pae下調miR-106a-5p/PTEN對白血病細胞增殖、凋亡的影響

        2021-03-03 07:36:42張彥芬高大易媛媛趙榮偉
        現代免疫學 2021年1期
        關鍵詞:水平影響檢測

        張彥芬,高大,易媛媛,趙榮偉

        (1. 內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 血液科,呼和浩特 010050;2.內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 婦產科,呼和浩特 010050)

        白血病是兒童和青少年最常見的惡性血液系統(tǒng)疾病之一[1]。克隆性白血病細胞由于分化障礙,增殖失控,凋亡受阻等導致其在骨髓或其他造血組織中異常集聚,并浸潤其他組織和器官,同時抑制造血組織的正常功能。目前對白血病的主要治療方法有放療、化療和異基因造血干細胞移植等[2]。盡管化療和異體移植的聯合應用提高了療效,但化療藥物的副作用如導致心律不齊,加劇彌散性血管內凝血以及產生耐藥性等降低了疾病的治愈率[2]。因此,尋找更加安全有效的治療藥物迫在眉睫。丹皮酚(paeonol,Pae),又稱牡丹酚或芍藥醇,是牡丹根皮和徐長卿的主要活性成分,具有免疫調節(jié)和心腦血管保護等多種藥理作用[3]。有體外實驗表明,Pae可殺傷多種惡性腫瘤細胞[4],有可能成為惡性腫瘤治療藥物。孫國平等[5]發(fā)現,Pae可抑制白血病細胞增殖,但其對白血病細胞凋亡的影響尚未見報道,而它殺傷白血病細胞的機制仍不清楚。第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物(phosphatase and tension homologue deleted on chromosome 10,PTEN)作為抑癌基因,過表達可抑制白血病細胞的增殖、遷移和侵襲,促進細胞凋亡并導致細胞周期阻滯于G0/G1期[6-7]。miR-106a在多種白血病細胞系中表達上調,其在白血病發(fā)生、發(fā)展過程中可能發(fā)揮一定作用[8]。研究通過體外實驗探究Pae對白血病細胞增殖、凋亡的影響,進一步觀察Pae對miR-106a-5p和PTEN表達的影響,探究其作用機制,以期為白血病的臨床治療提供新方法和新思路。

        1 材料與方法

        1.1 實驗材料、試劑與儀器收集2016年1月至2017年1月于內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院血液科收治的初診白血病患者8例,經血象和骨髓病理活檢臨床確診。白血病細胞K562,購自中國科學院上海細胞庫;Pae試劑,購自上海譜振生物科技有限公司;RPMI 1640培養(yǎng)液,購自Hyclone公司;LipofectamineTM2000轉染試劑和TRIzol抽提試劑,購自Invitrogen公司??筸iR-106a-5p、miR-NC抗體、miR-106a-5p mimics、miR-NC、siPTEN和siNC,購自北京華大基因研究中心有限公司;雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒,購自Promega公司。MTT試劑、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、Annexin V-FITC/PI試劑盒、放射免疫沉淀實驗(radioimmunoprecipitation assay,RIPA)裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、PVDF膜、Western blotting洗滌液及封閉液,購自北京索萊寶科技有限公司。兔抗人PTEN、GAPDH、CyclinD1、Bcl-2、p21及Bax多克隆抗體,購自Santa Cruz公司;羊抗兔IgG-HRP,購自武漢博士德生物工程有限公司。凝膠成像系統(tǒng),來自伯樂生命醫(yī)學產品(上海)有限公司;熒光定量PCR儀,來自ABI公司;FCM,來自BD公司;酶標儀,來自AWARENESS TECHNOLOGY INC公司。

        1.2 細胞的培養(yǎng)、轉染與分組參照文獻[9]方法分離初診白血病患者原代白血病細胞。使用RPMI 1640培養(yǎng)液分別培養(yǎng)該原代白血病細胞及K562細胞。細胞培養(yǎng)條件為濕度95%,溫度37 ℃,CO2體積分數5%。當細胞鋪底率至約80%時,用胰蛋白酶消化后傳代。

        藥物處理:取對數生長期K562細胞,用RPMI 1640完全培養(yǎng)液調整密度,以2×105個/孔細胞密度接種于96孔板,于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。分別給予不同濃度的Pae溶液[5](0、15、30、60 mg/mL)處理,依次標記為Con組、Pae 15 mg/L組、30 mg/L組和60 mg/L組,培養(yǎng)24、48及72 h后,進行下一步研究。

        細胞轉染:取對數生長期的白血病細胞K562,用RPMI 1640完全培養(yǎng)液調整細胞密度,以2×105個/孔接種于96孔板。當細胞鋪底率達60%時,用LipofectamineTM2000脂質體轉染技術將抗miR-106a-5p和抗miR-NC抗體分別轉染至K562細胞,依次命名為抗miR-106a-5p組和抗miR-NC組。將2組細胞置于培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)6 h,更換新鮮培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng),以待后續(xù)研究。按照上述轉染方法分別將miR-106a-5p mimics、miR-NC、siPTEN和siNC轉染至K562細胞,用30 mg/mL Pae溶液處理,并依次分為Pae+miR-106a-5p組、Pae+miR-NC組、Pae+siPTEN組和Pae+siNC組,培養(yǎng)24、48及72 h后進行后續(xù)研究。

        1.3 qRT-PCR檢測用TRIzol試劑分別抽提各組K562細胞總RNA,檢測其純度;反轉錄為cDNA,進行qRT-PCR擴增。引物由北京華大基因研究中心有限公司合成,序列如下(表1)。miR-106a-5p和PTENmRNA的檢測分別以U6和GAPDH為內參,其相對表達量采用2-△△Ct法計算。

        表1 引物序列

        1.4 Western blotting檢測藥物處理或轉染后48 h,收集各組K562細胞,用RIPA裂解液裂解,提取總蛋白。通過BCA蛋白定量試劑盒調整蛋白濃度。沸水浴3~5 min使蛋白充分變性,冷卻至室溫備用。取30 μg變性蛋白,進行SDS-PAGE,結束后轉移至PVDF膜。用洗滌液洗膜,后用封閉液室溫封閉1 h。除去封閉液,加入抗PTEN、GAPDH、CyclinD1、Bcl-2、p21及Bax一抗(1∶1 000),置側擺搖床4 ℃孵育過夜。洗滌液洗膜后,加入相應二抗(1∶1 000)室溫孵育2 h,化學發(fā)光法顯色。凝膠成像系統(tǒng)采集圖像,分析目的條帶灰度值。

        1.5 MTT法檢測取轉染及未轉染K562細胞,接種于96孔板,按照1.2分組給予不同劑量藥物處理,培養(yǎng)24、48及72 h后于每孔加入MTT溶液(20 μL/孔);孵育4 h后,吸凈孔內液體,每孔加入150 μL DMSO,搖床均搖10 min至其完全溶解。酶標儀檢測光密度D(490 nm)。

        1.6 FACS檢測取藥物處理或轉染48 h的各組K562細胞,胰蛋白酶消化,離心棄上清液后收集各組細胞,PBS漂洗2次。加入適量結合緩沖液重懸細胞,按照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書依次加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI,混勻后FCM檢測細胞凋亡情況。

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        1.7 雙熒光素酶報告基因實驗通過靶基因預測數據庫TargetScanHuman 7.1網站(http://www.targetscan.org/vert_71/)預測miR-106a-5p的靶基因。查詢發(fā)現miR-106a-5p的5’端能與PTEN的3’UTR特異性結合,猜測PTEN是miR-106a-5p的靶基因。為驗證這一預測,構建野生型WT-PTEN和突變型MUT-PTEN的PTEN3’UTR熒光素酶報告基因載體。按1.2中LipofectamineTM2000脂質體轉染法將miR-106a-5p和miR-NC分別與WT-PTEN和MUT-PTEN共轉染至K562細胞,于細胞培養(yǎng)箱(濕度95%,溫度37 ℃,CO2體積分數5%)培養(yǎng)48 h。收集各組細胞,按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書檢測各組細胞PTEN的表達。

        2 結果

        2.1 Pae對初診白血病患者原代白血病細胞增殖、凋亡的影響與Con組相比,Pae處理24 h后各組原代白血病細胞的增殖能力差異不顯著;與Con組相比,Pae處理48、72 h后各組白血病細胞增殖能力顯著下降(P<0.05,圖1A)。與Con組相比,Pae 15 mg/L組、30 mg/L組及60 mg/L組原代白血病細胞的凋亡率顯著升高(P<0.05,圖1B)。

        注:A. Pae對初診白血病患者原代白血病細胞增殖能力的影響;B. Pae對初診白血病患者原代白血病細胞凋亡率的影響。與Con組比較,*P<0.05。圖1 Pae對初診白血病患者原代白血病細胞增殖和凋亡的影響

        2.2 Pae對白血病細胞K562增殖、凋亡的影響與Con組相比,Pae處理24 h后, K562細胞的增殖能力變化不顯著;Pae處理48和72 h后,各組K562細胞增殖能力顯著下降(P<0.05,圖2A)。與Con組相比,15 mg/L組K562細胞凋亡率[(6.51±0.13)%vs(14.06±0.60)%]顯著升高,CyclinD1[(0.79±0.00)vs(0.68±0.00)]和Bcl-2[(0.92±0.00)vs(0.76±0.00)]表達水平均顯著降低,p21[(0.21±0.00)vs(0.37±0.00)]和Bax[(0.16±0.00)vs(0.31±0.00)]表達水平均顯著升高;與Con組相比,30 mg/L組K562細胞凋亡率[(6.51±0.13)%vs(24.26±0.92)%]顯著升高,CyclinD1[(0.79±0.00)vs(0.46±0.00)]和Bcl-2[(0.92±0.00)vs(0.51±0.00)]表達水平均顯著降低,p21[(0.21±0.00)vs(0.57±0.00)]和Bax[(0.16±0.00)vs(0.47±0.00)]表達水平均顯著升高;與Con組相比,60 mg/L組K562細胞凋亡率[(6.51±0.13)%vs(28.66±0.18)%]顯著升高,CyclinD1[(0.79±0.00)vs(0.33±0.00)]和Bcl-2[(0.92±0.00)vs(0.36±0.00)]表達水平均顯著降低,p21[(0.21±0.00)vs(0.78±0.00)]和Bax[(0.16±0.00)vs(0.74±0.00)]表達水平均顯著升高。(均P<0.05, 圖2B~2E)

        以上結果表明,Pae可抑制白血病細胞K562增殖,促進細胞凋亡,其抑制或促進程度與Pae的濃度存在一定劑量效應。

        注:A. Pae對K562細胞增殖的影響;B~C. Pae對K562細胞凋亡的影響;D~E. Pae對K562細胞增殖、凋亡相關蛋白表達的影響。與Con組比較,*P<0.05 。圖2 Pae對K562細胞增殖、凋亡及相關蛋白表達的影響

        2.3 Pae對白血病細胞K562miR-106a-5p、PTEN表達的影響與Con組相比,Pae 15 mg/L組[(1.21±0.00)vs(0.99±0.00)]、30 mg/L組[(1.21±0.00)vs(0.50±0.00)]及60 mg/L組[(1.21±0.00)vs(0.41±0.00)]miR-106a-5p的表達水平顯著降低;與Con組相比,Pae 15 mg/L組[(0.31±0.00)vs(0.47±0.00)]、30 mg/L組[(0.31±0.00)vs(0.75±0.00)]及60 mg/L組[(0.31±0.00)vs(0.83±0.00)]PTEN的表達水平顯著升高。(均P<0.05, 圖3A、3B)

        以上結果表明,Pae可抑制白血病細胞K562miR-106a-5p的表達,促進PTEN的表達,其抑制或促進程度與Pae的濃度存在一定劑量效應。

        以上結果表明,抑制miR-106a-5p表達可抑制白血病細胞K562的增殖,促進其凋亡并影響相關蛋白表達。

        注:A. Pae對K562細胞miR-106a-5p mRNA表達的影響;B. Pae對K562細胞PTEN蛋白表達的影響。與Con組比較,*P<0.05。圖3 Pae對K562細胞 miR-106a-5p、PTEN表達的影響

        注:A. miR-106a-5p mRNA相對表達量;B. 抑制miR-106a-5p表達對白血病細胞K562增殖的影響;C. 抑制miR-106a-5p表達對K562細胞凋亡的影響;D.抑制miR-106a-5p表達對K562細胞增殖、凋亡相關蛋白表達的影響。與抗miR-NC組比較,*P<0.05。圖4 抑制miR-106a-5p表達對白血病細胞K562增殖、凋亡及相關蛋白表達的影響

        2.5 過表達miR-106a-5p對Pae作用下白血病細胞K562增殖、凋亡的影響與Con組相比,Pae組K562細胞miR-106a-5p表達水平顯著降低[(1.21±0.00)vs(0.48±0.00),P<0.05];與Pae+miR-NC組相比, Pae+miR-106a-5p組K562細胞miR-106a-5p表達水平顯著升高[(0.46±0.00)vs(0.79±0.00),P<0.05]。(圖5A)

        Pae作用24 h后,Con組、Pae組、Pae+miR-NC組和Pae+miR-106a-5p組K562細胞增殖能力無顯著變化(P>0.05),48和72 h后,Pae組K562細胞增殖能力顯著低于Con組,Pae+miR-106a-5p組增殖能力顯著高于Pae+miR-NC組(均P<0.05,圖5B)。與Con組相比,Pae組K562細胞凋亡率顯著增加[(6.51±0.13)%vs(24.26±0.92)%],CyclinD1和Bcl-2的表達水平顯著降低[(0.79±0.00)vs(0.46±0.00)、(0.92±0.00)vs(0.51±0.00)],p21和Bax的表達水平顯著升高[(0.21±0.00)vs(0.77±0.00)、(0.16±0.00)vs(0.67±0.00)](均P<0.05,圖5C、5D)。與Pae+miR-NC組相比,Pae+miR-106a-5p組K562細胞凋亡率顯著下降[(24.00±0.38)%vs(15.69±0.76)%],CyclinD1和Bcl-2的表達水平顯著升高[(0.37±0.00)vs(0.64±0.00)、(0.33±0.00)vs(0.62±0.00)],p21和Bax的表達水平顯著降低[(0.78±0.00)vs(0.41±0.00)、(0.68±0.00)vs(0.40±0.00)](均P<0.05,圖5C、5D)。以上結果表明,過表達miR-106a-5p可顯著逆轉Pae對白血病細胞K562的增殖抑制和凋亡促進作用。

        注:A. miR-106a-5p相對表達量;B. 過表達miR-106a-5p可逆轉Pae對K562細胞增殖的抑制作用;C. 過表達miR-106a-5p可逆轉Pae對K562細胞凋亡的促進作用;D. 過表達miR-106a-5p對Pae作用下K562細胞增殖、凋亡相關蛋白表達的影響。與Con組比較,*P<0.05;與Pae+miR-NC組比較,#P<0.05。圖5 過表達miR-106a-5p可逆轉Pae對白血病細胞K562增殖、凋亡的影響

        2.6 miR-106a-5p靶向PTENmiR-106a-5p與PTEN3’UTR存在特異性結合位點(圖6A)。與miR-NC+WT-PTEN共轉染組比較,miR-106a-5p mimics+WT-PTEN共轉染組K562細胞熒光素酶活性顯著降低[(1.10±0.00)vs(0.41±0.00),P<0.05,圖6B]。與miR-NC+MUT-PTEN共轉染組比較,miR-106a-5p mimics+MUT-PTEN共轉染組K562細胞熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學意義[(1.09±0.00)vs(1.09±0.00),P>0.05, 圖6B]。與miR-NC組相比,miR-106a-5p組K562細胞PTEN表達水平顯著降低[(0.39±0.00)vs(0.07±0.00)];與抗miR-NC組相比,抗miR-106a-5p組K562細胞PTEN表達水平顯著升高[(0.41±0.00)vs(0.82±0.00)]。(均P<0.05,圖6C)

        以上結果表明,在K562細胞中,miR-106a-5p可負調控PTEN的表達。

        注:A. PTEN的3’UTR含miR-106a-5p的互補核苷酸序列;B. 雙熒光素酶報告基因實驗;C. miR-106a-5p調控PTEN的表達。與miR-NC組比較,*P<0.05;與抗miR-NC組比較,#P<0.05。圖6 miR-106a-5p靶向調控PTEN的表達

        2.7 抑制PTEN表達對Pae作用下白血病細胞K562增殖、凋亡的影響Pae作用24 h后,Con組、Pae組、Pae+siNC組和Pae+siPTEN組K562細胞增殖能力變化差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);48、72 h后,Pae組細胞增殖能力顯著低于Con組,Pae+siPTEN組細胞增殖能力顯著高于Pae+siNC組(均P<0.05,圖7A)。

        與Con組比較,Pae組細胞凋亡率顯著升高[(6.51±0.13)%vs(24.26±0.92)%],CyclinD1和Bcl-2表達水平顯著降低[(0.79±0.00)vs(0.46±0.00)、(0.92±0.00)vs(0.51±0.00)],PTEN、p21和Bax表達水平顯著升高[(0.31±0.00)vs(0.74±0.00)、(0.21±0.00)vs(0.74±0.00)和(0.16±0.00)vs(0.67±0.00)];與Pae+siNC組比較,Pae+siPTEN組K562細胞凋亡率顯著降低[(24.37±1.17)%vs(12.80±0.26)%],CyclinD1和Bcl-2表達水平顯著升高[(0.47±0.00)vs(0.64±0.00)、(0.51±0.00)vs(0.69±0.00)],PTEN、p21和Bax表達水平顯著降低[(0.82±0.00)vs(0.58±0.00)、(0.73±0.00)vs(0.49±0.00)、(0.68±0.00)vs(0.39±0.00)]。(均P<0.05,圖7B~7C)

        可見,抑制PTEN表達可顯著逆轉Pae對白血病細胞K562的增殖抑制和凋亡促進作用。

        3 討論

        近年來,隨著對中藥研究的不斷深入,Pae的抗腫瘤活性被不斷揭示。Pae在體內外均具有抑制前列腺癌細胞生長的作用[10],其還可誘導卵巢癌細胞的凋亡[11]。Pae與阿奇霉素的聯合應用可抑制乳腺癌細胞增殖并促進腫瘤細胞凋亡[12]。Pae還可通過下調MMP-2和MMP-9蛋白表達,抑制人胃癌BGC823細胞生長、遷移和侵襲[13]。研究首先鑒定其對白血病患者原代白血病細胞的影響,結果顯示Pae呈濃度依賴性地抑制細胞增殖,促進細胞凋亡。隨后,以白血病細胞K562為研究對象的進一步功能研究發(fā)現,Pae呈濃度依賴性地抑制K562細胞增殖,促進細胞凋亡,這與孫國平等[5]的研究結果相一致。同時,qRT-PCR和Western blotting檢測結果顯示,Pae呈濃度依賴性地抑制CyclinD1和Bcl-2表達,促進p21和Bax表達,與其抗增殖、促凋亡作用吻合。此外,Pae呈濃度依賴性地抑制miR-106a-5p表達,促進PTEN表達。研究結果提示,Pae對白血病細胞的增殖抑制作用和凋亡促進作用可能與調控miR-106a-5p和PTEN表達有關。

        注:A. 抑制PTEN表達可逆轉Pae對K562細胞增殖的抑制作用;B. 抑制PTEN表達可逆轉Pae對K562細胞凋亡的促進作用;C. 抑制PTEN表達對Pae作用下K562細胞增殖、凋亡相關蛋白表達的影響。與Con組比較,*P<0.05;與Pae+siNC組比較,#P<0.05。圖7 抑制PTEN表達可逆轉Pae對白血病細胞K562增殖、凋亡及相關蛋白表達的影響

        miR-106a-5p為miR-17家族成員。大量研究表明,miR-106a-5p在胃癌[14]、結腸癌[15]等多種腫瘤組織和細胞中異常低表達,參與調控腫瘤的發(fā)生發(fā)展。例如,miR-106a-5p通過靶向PAK5抑制腎癌細胞的遷移和侵襲[16],還可靶向HMGA2抑制骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲[17]。張文娟[18]通過基因芯片技術證實,抗腫瘤藥物DMC可使慢性粒細胞白血病細胞中miR-106a-5p表達下調,證明miRNA在白血病的發(fā)展中發(fā)揮重要作用。研究顯示,抑制miR-106a-5p表達后,K562細胞的增殖能力顯著降低,凋亡率顯著增加,CyclinD1和Bcl-2的表達顯著降低,p21和Bax的表達顯著增加,與Pae對白血病細胞的作用一致。以上研究結果提示,Pae通過下調miR-106a-5p表達抑制白血病細胞增殖,促進其凋亡,而也有類似研究證明miR-106a-5p在不同腫瘤中發(fā)揮不同作用。

        PTEN是最早發(fā)現的具有雙特異磷酸酶活性的抑癌基因。有研究表明,急性髓細胞白血病和急性淋巴細胞白血病中PTEN表達均顯著下調[19-20]。慢性淋巴細胞白血病中PTEN的低表達可能與miR-26a和miR-214的異常表達有關[21]。miR-21還可通過調控PTEN/AKT信號通路抑制白血病細胞K562的增殖和遷移[22]。雙熒光素酶報告基因實驗和Western blotting檢測結果顯示,PTEN是miR-106a-5p的靶基因,miR-106a-5p可負調控PTEN的表達。由此提示,miR-106a-5p/PTEN信號通路在Pae針對白血病細胞增殖和凋亡的調控中發(fā)揮一定作用。為進一步證明Pae是通過下調miR-106a-5p/PTEN軸調控K562細胞增殖及凋亡的,將miR-106a-5p mimics或siPTEN轉染至K562細胞,隨后用Pae處理,研究發(fā)現過表達miR-106a-5p或抑制PTEN表達可逆轉Pae對白血病細胞增殖、凋亡的影響。以上研究結果提示,Pae通過miR-106a-5p/PTEN軸參與調控白血病細胞的增殖和凋亡。然而,除miR-106a-5p/PTEN軸外,還可能存在其他調控途徑,這些問題將是進一步研究的重點。

        綜上所述,Pae可通過下調miR-106a-5p/PTEN信號通路蛋白抑制白血病細胞的增殖,促進其凋亡,這為白血病的臨床治療提供了新的方法和思路。

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