賀明，張穎婷，魏倩，阮昕，安曉飛，孫英剛

(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病理生理學(xué)系，細(xì)胞分化與凋亡教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200025；2.江蘇省中醫(yī)院 內(nèi)分泌科，南京 210029；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院 心血管二科，上海200092)

炎癥是機(jī)體組織受損或遭受有害物質(zhì)刺激后產(chǎn)生的一種適應(yīng)性反應(yīng)，與許多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1]。LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，是引起機(jī)體炎癥反應(yīng)和休克的關(guān)鍵介質(zhì)之一，可導(dǎo)致患者全身炎癥反應(yīng)并發(fā)展成多器官功能衰竭[2]。肝臟作為機(jī)體最主要的代謝器官，是過度炎癥反應(yīng)的主要受累臟器[3]。肝臟組織由多種細(xì)胞類型構(gòu)成，包括：肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)、肝源性巨噬細(xì)胞(Kupffer cell， KC)、肝臟相關(guān)淋巴細(xì)胞(Pit細(xì)胞)和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(sinusoidal endothelial cell， SEC)。肝臟中不同細(xì)胞間的相互作用在肝臟各種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，病理狀態(tài)下肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞可發(fā)生焦亡，釋放炎癥小體促進(jìn)HSC的活化和肝纖維化[5]。還有研究表明，在脂肪性肝病肝細(xì)胞中沉積的脂質(zhì)會(huì)引起肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞線粒體DNA釋放，KC中IL-33表達(dá)上調(diào)，加重組織炎癥損傷[6]。LPS引起肝細(xì)胞損傷的機(jī)制是其作用于KC，后者觸發(fā)炎癥反應(yīng)并大量釋放TNF-α和IL-6等促炎因子，誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷和凋亡[7]。

沉默信息調(diào)節(jié)因子2(silent information regulator 2， SIRT2)是一種高度保守的NAD+依賴性蛋白去乙?；福饕ㄎ挥诩?xì)胞質(zhì)[8]。在細(xì)胞處于有絲分裂不同階段或細(xì)胞受到不同刺激時(shí)，也可穿梭入核[9]。SIRT2 廣泛表達(dá)于腦、肝臟、肌肉和脂肪組織，其中在肝臟的表達(dá)量較高[10]。最近研究發(fā)現(xiàn)，在肥胖引起的炎癥反應(yīng)過程中，肝臟SIRT2蛋白表達(dá)量先增加后減少，同時(shí)氧化態(tài)SIRT2即酶活性受抑制的SIRT2表達(dá)量明顯增加，最終抑制SIRT2發(fā)揮正常功能[11]。而在其他炎癥反應(yīng)過程中，特別是LPS導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)中，SIRT2蛋白的表達(dá)變化機(jī)制及作用尚不清楚。

本研究通過動(dòng)物模型和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，探討LPS引起的肝臟炎癥損傷過程中肝細(xì)胞SIRT2的表達(dá)變化及作用。

1 材料與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57BL/6J小鼠，隨機(jī)分成2組(每組4～5只)，10～12周齡，雌性，體質(zhì)量20～25 g，飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部SPF級(jí)動(dòng)物房。小鼠自由飲食飲水，以每籠3～5 只分籠飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件：室溫18～26 ℃，日溫差≤3 ℃，相對(duì)濕度(40～60)%，晝夜明暗交替時(shí)間12 h/12 h。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)操作均經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和管理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系小鼠肝細(xì)胞系A(chǔ)ML12、單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7，購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心。使用含10% FCS、40 ng/mL地塞米松、10 μg/mL胰島素、5.5 μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白和5 ng/mL硒的 DMEM/F12 培養(yǎng)液培養(yǎng)AML12細(xì)胞系。使用含 10% FCS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7。細(xì)胞均置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2 方法

2.1 LPS誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷模型的構(gòu)建將C57BL/6J小鼠隨機(jī)分成2組：生理鹽水(normal saline, NS)組(n=5)和LPS組(n=4)。LPS組小鼠給予腹腔注射LPS，劑量為20 mg/kg；NS組注射等量NS。2組給藥后24 h，于小鼠球后靜脈取血并分離肝臟，稱量肝臟質(zhì)量，計(jì)算肝指數(shù)(liver index, LI)，LI=肝濕質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。

2.2 肝損傷血清學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)離心收集肝素抗凝管中全血血清。通過ALT和AST試劑盒(96T)及LX-20 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)小鼠血清 ALT和AST水平。

2.3 肝臟組織病理學(xué)觀察用4%多聚甲醛固定小鼠肝臟組織，石蠟包埋，切片后進(jìn)行HE及TUNEL染色。用F4/80(1∶125)和SIRT2(1∶250)抗體孵育樣本，行免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry, IHC)染色，于顯微鏡下觀察。

不同染色觀察過程中，分別抓取 20 個(gè)視野，記錄TUNEL或F4/80染色陽性細(xì)胞數(shù)。

2.4 Western blotting檢測(cè)肝臟SIRT2蛋白的表達(dá)分離小鼠肝細(xì)胞和AML12細(xì)胞蛋白，進(jìn)行10% SDS-PAGE；將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至NC膜，用5%脫脂牛奶封閉后，加入抗SIRT2(1∶1 000)、cleaved Caspase-3(1∶500)和β-actin(1∶1 000)一抗孵育12 h；滴加抗IgG-HRP二抗(1∶2 000)，室溫孵育1 h。通過ImageQuant LAS4000mini化學(xué)發(fā)光成像儀顯影。

表1 real time-PCR引物序列

2.6 肝細(xì)胞增殖能力的檢測(cè)于96孔板中接種5×104個(gè)/孔AML12細(xì)胞，貼壁后分別用不同條件處理24 h。分別滴加CCK8試劑(10 μL/孔)培養(yǎng)2 h，使用LX-20 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)肝細(xì)胞增殖情況。

3 結(jié)果

3.1 LPS誘導(dǎo)小鼠肝臟急性炎癥反應(yīng)分別腹腔注射C57BL/6J小鼠NS或LPS。24 h后，相較于NS組， LPS組小鼠LI顯著增加(P<0.05，圖1B)，但肝質(zhì)量變化不顯著(P>0.05, 圖1A)。肝組織HE染色結(jié)果顯示，相較于NS組，LPS組小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)紊亂，有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和靜脈竇充血(圖1C)。進(jìn)一步的F4/80 IHC染色結(jié)果顯示，相較于NS組，LPS組小鼠肝組織內(nèi)巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P<0.01，圖1D、1E)。此外，real time-PCR 結(jié)果表明，LPS組小鼠肝組織中IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于NS組(P<0.001，圖1F)。以上結(jié)果表明，LPS可成功誘導(dǎo)小鼠肝臟急性炎癥反應(yīng)。

注：A. 肝臟質(zhì)量；B. LI；C. 肝臟組織HE染色結(jié)果(×200)；D. 肝臟組織F4/80 IHC染色結(jié)果(×200)；E. F4/80陽性細(xì)胞半定量結(jié)果； F. real time-PCR檢測(cè)肝臟組織IL-6 mRNA表達(dá)情況。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖1 LPS誘導(dǎo)小鼠肝臟急性炎癥反應(yīng)情況

3.2 LPS誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷和肝細(xì)胞凋亡相較于NS組，LPS組小鼠血清ALT和AST水平顯著升高(均P<0.05，圖2A、2B)，提示小鼠發(fā)生明顯肝細(xì)胞損傷。進(jìn)一步的TUNEL染色結(jié)果顯示，LPS組小鼠肝臟組織中TUNEL陽性肝細(xì)胞數(shù)顯著多于對(duì)照組(P<0.001，圖2C、2D)，提示LPS可致肝細(xì)胞凋亡。

3.3 LPS抑制小鼠肝細(xì)胞SIRT2mRNA及蛋白的表達(dá)IHC染色發(fā)現(xiàn)，LPS刺激后小鼠肝細(xì)胞中SIRT2蛋白的表達(dá)量明顯下降(圖2E)。進(jìn)一步的real time-PCR和Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，LPS顯著下調(diào)小鼠肝細(xì)胞SIRT2 mRNA及蛋白表達(dá)水平(P<0.01，圖2F、2G)。

3.4 體外LPS刺激不影響肝細(xì)胞系凋亡及SIRT2表達(dá)分別接種適量AML12細(xì)胞于96、12和6孔板，經(jīng)16 h貼壁培養(yǎng)后，將LPS按0.0、0.5、1.0 mg/L質(zhì)量濃度梯度處理AML12細(xì)胞。24 h后的CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度LPS對(duì)AML12細(xì)胞的增殖能力并無顯著影響(P>0.05, 圖3A)；同時(shí)real time-PCR和Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度LPS對(duì)AML12細(xì)胞SIRT2 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)也無顯著影響(P>0.05, 圖3B、3C)。這些結(jié)果與動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果完全不同。

3.5 LPS通過巨噬細(xì)胞抑制AML12SIRT2表達(dá)由于在體條件下小鼠肝臟中存在多種細(xì)胞的相互作用，而體外培養(yǎng)肝細(xì)胞系缺乏這種相互作用。因此，筆者提出假設(shè)：LPS對(duì)肝細(xì)胞凋亡及SIRT2表達(dá)的調(diào)控之所以存在體內(nèi)外差異，可能是在體條件下LPS通過影響其他類型細(xì)胞下調(diào)了肝細(xì)胞SIRT2的表達(dá)并促進(jìn)其凋亡。LPS的主要靶細(xì)胞是巨噬細(xì)胞，因此，研究分別使用0.0、0.5、1.0 mg/L質(zhì)量濃度梯度LPS刺激小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7 6 h。離心、收集上清液再混合新鮮培養(yǎng)液處理AML12細(xì)胞24 h后(圖4A)，提取AML12細(xì)胞的RNA和蛋白質(zhì)。real time-PCR和Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，1.0 mg/L LPS刺激后，RAW264.7細(xì)胞上清液可顯著下調(diào)AML12細(xì)胞SIRT2 mRNA(P<0.05，圖4B)和蛋白(圖4C)表達(dá)水平，這與在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

注：A. 血清ALT檢測(cè)結(jié)果；B. 血清AST檢測(cè)結(jié)果；C. 肝臟組織TUNEL IHC染色結(jié)果(×200，紅色箭頭所指為TUNEL陽性細(xì)胞)；D. TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)半定量結(jié)果；E. 肝臟組織SIRT2 IHC染色結(jié)果(×200)；F. real-time PCR檢測(cè)肝臟組織SIRT2 mRNA表達(dá)情況；G. Western blotting檢測(cè)肝臟組織SIRT2蛋白表達(dá)情況。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖2 LPS對(duì)小鼠肝細(xì)胞損傷、凋亡及SIRT2表達(dá)的影響

注：A. CCK8檢測(cè)結(jié)果；B. real time-PCR檢測(cè)SIRT2 mRNA表達(dá)情況；C. Western blotting檢測(cè)SIRT2蛋白表達(dá)情況。圖3 LPS對(duì)肝細(xì)胞系A(chǔ)ML12增殖及SIRT2表達(dá)的影響

注： A. LPS作用下RAW 264.7和AML12相互作用關(guān)系實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證流程圖；B. real time-PCR檢測(cè)SIRT2 mRNA表達(dá)情況；C. Western blotting檢測(cè)不同濃度LPS處理RAW264.7細(xì)胞6 h后其上清液刺激AML12細(xì)胞24 h SIRT2蛋白的表達(dá)情況。*P<0.05。圖4 巨噬細(xì)胞對(duì)LPS作用下肝細(xì)胞SIRT2表達(dá)的影響

3.6SIRT2敲減有助于LPS對(duì)AML12肝細(xì)胞增殖的抑制及凋亡的促進(jìn)LPS通過巨噬細(xì)胞抑制肝細(xì)胞SIRT2的表達(dá)，提示SIRT2可能在肝細(xì)胞損傷中發(fā)揮一定作用。利用siRNA技術(shù)，課題組在AML12細(xì)胞中有效敲減SIRT2的表達(dá)(P<0.001，圖5A)。分別使用0.0、0.5、1.0 mg/L質(zhì)量濃度梯度的LPS刺激處理后AML12細(xì)胞(AML12 siSIRT2)和對(duì)照細(xì)胞(AML12 siNC)24 h。CCK8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，siNC組細(xì)胞的增殖能力不受LPS濃度影響，但LPS可顯著抑制SIRT2敲減AML12細(xì)胞的增殖(P<0.05，圖5B)。Western blotting檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1.0 mg/L LPS作用下，SIRT2敲減可明顯增加凋亡標(biāo)志蛋白cleaved Caspase3的表達(dá)(圖5C)。以上結(jié)果提示，SIRT2分子在LPS導(dǎo)致的肝損傷中發(fā)揮重要作用。

注： A. real time-PCR和Western blotting檢測(cè)siRNA敲減SIRT2的效率；B. siNC和siSIRT2AML12經(jīng)不同濃度LPS刺激24 h后的CCK8檢測(cè)結(jié)果；C. Western blotting檢測(cè)siNC和siSIRT2AML12經(jīng)1.0 mg/L LPS刺激24 h后cleaved Caspase3及SIRT2蛋白的表達(dá)水平。*P<0.05， **P<0.001。圖5 AML12細(xì)胞中SIRT2的敲減對(duì)LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞增殖、凋亡的影響

4 討論

LPS是引起炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因素，可誘導(dǎo)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞等合成和釋放各種細(xì)胞因子，介導(dǎo)內(nèi)毒素性休克及多臟器功能衰竭的發(fā)生發(fā)展[7]。由于肝腸在解剖結(jié)構(gòu)上聯(lián)系緊密，多種感染性疾病的致病菌和毒素首先累及的器官是肝臟[12]。

LPS造成肝臟組織損傷的機(jī)制十分復(fù)雜。LPS可結(jié)合巨噬細(xì)胞表面的TLR復(fù)合物激活經(jīng)典的LPS通路，誘導(dǎo)IκBα和p65磷酸化，磷酸化的p65入核促進(jìn)炎性因子相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[13]。同時(shí)，LPS可誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生過度的氧化應(yīng)激，導(dǎo)致活性氧類的過量產(chǎn)生并激活Keap1-Nrf2信號(hào)通路[14]。此外，LPS也可通過刺激免疫細(xì)胞釋放細(xì)胞因子損傷肝臟組織[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS可誘導(dǎo)小鼠肝臟炎癥反應(yīng)和肝細(xì)胞凋亡，同時(shí)肝細(xì)胞中SIRT2蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)。但矛盾的是，體外研究并沒有觀察到類似現(xiàn)象，即LPS無法直接影響AML12肝細(xì)胞增殖，且對(duì)SIRT2的表達(dá)沒有影響?；诟闻K中多細(xì)胞間相互作用在臟器病理生理學(xué)中發(fā)揮重要作用，研究以小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7(已知的LPS靶細(xì)胞)為研究對(duì)象，經(jīng)共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LPS刺激RAW264.7后的細(xì)胞上清液可顯著抑制AML12肝細(xì)胞中SIRT2的表達(dá)(P<0.05， 圖4B、4C)。同時(shí)，敲減SIRT2的AML12細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后發(fā)生顯著的增殖抑制(P<0.05)和凋亡促進(jìn)。以上結(jié)果提示，LPS可通過作用于肝臟巨噬細(xì)胞下調(diào)肝細(xì)胞SIRT2的表達(dá)，而SIRT2表達(dá)的減少可增加LPS對(duì)肝細(xì)胞增殖的抑制(圖5B)，誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)LPS導(dǎo)致的肝損傷。本研究是對(duì)LPS引起的急性肝臟損傷作用機(jī)制的新探索。由于是體外研究，故LPS對(duì)SIRT2表達(dá)的影響(圖4)是否在小鼠及人體中也發(fā)揮同樣的作用有待進(jìn)一步研究。