黎 夢 魏立民 陳 婷 何家建 習(xí)欠云 張 瑾 張永亮*

(1.嘉興學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，嘉興 314000；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，廣州 510642)

肥胖是體內(nèi)脂肪過度沉積的表現(xiàn)，與脂代謝紊亂密切相關(guān)。脂肪代謝的紊亂會引起脂肪細(xì)胞分泌因子的異常，炎癥因子的分泌隨之增高，從而引起機(jī)體的代謝疾病以及炎癥反應(yīng)[1]。肥胖人群中糖尿病、高血壓、高血脂、心腦血管疾病以及一些癌癥的發(fā)病率也顯著高于普通人群。因此，對脂肪代謝調(diào)控的研究有助于預(yù)防和治療肥胖及其引起的疾病。在畜禽生產(chǎn)中，肉品質(zhì)更是人們關(guān)注的問題。脂肪作為影響肉品質(zhì)的重要因素之一，其代謝調(diào)控的研究也可為肉品質(zhì)的控制提供依據(jù)[2]。

脂肪組織的發(fā)育及調(diào)控受遺傳、營養(yǎng)和環(huán)境等許多因素影響。核酸是一類具有生理生化功能的營養(yǎng)物質(zhì)，其對機(jī)體調(diào)節(jié)作用早已為人們所關(guān)注。在機(jī)體生長發(fā)育過程中，可利用外源核苷酸或核苷酸片段合成新的核苷酸供機(jī)體使用[3]。食品中的核苷酸有助于抗腹瀉和改善營養(yǎng)不良[4]?？诜囟ɑ虻腞NA可以調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，有助于增加小鼠骨骼肌發(fā)育[5]。減少飼糧中玉米RNA可以增加小鼠體重，單獨(dú)灌服特定的玉米miRNA可以顯著降低小鼠的增重[6]，研究也證實(shí)了玉米miRNA可通過調(diào)節(jié)動物基因的表達(dá)參與機(jī)體調(diào)節(jié)[6-7]。但植物源核酸對脂肪的調(diào)節(jié)仍鮮有報道。因此，探究植物源核酸對脂肪代謝的調(diào)節(jié)作用，對了解植物源核酸的作用機(jī)制以及通過核酸類制劑進(jìn)行疾病的治療或提高畜產(chǎn)品品質(zhì)等有積極意義。本試驗(yàn)通過給斷奶小鼠灌服玉米RNA，探究其對脂肪代謝的調(diào)節(jié)，及對小鼠脂肪沉積和生長的影響，為植物源核酸調(diào)控動物脂肪沉積影響因素的探索提供新證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼糧

選取20只28日齡斷奶的C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為2組，對照組灌服生理鹽水，試驗(yàn)組灌服玉米RNA(100 μg/d)，每組10個重復(fù)(公母各占1/2)，每個重復(fù)1只，單籠飼養(yǎng)，進(jìn)行12 h的光/暗循環(huán)。試驗(yàn)期4周。

每天提取3 g玉米的總RNA，將純化的100 μg玉米RNA溶于300 μL生理鹽水，并以300 μL生理鹽水為對照，于每天08:00進(jìn)行灌服。參考常規(guī)小鼠飼糧配方，將玉米淀粉代替飼糧中的玉米并保證飼糧與常規(guī)小鼠飼糧營養(yǎng)和能量均衡[7]，配制成低玉米RNA飼糧進(jìn)行飼喂，飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

試驗(yàn)結(jié)束后檢測小鼠抓握力，曠場試驗(yàn)檢測焦慮情況，使用核磁共振成像儀(上海紐邁電子科技有限公司，MesoQMR23-060H)測定小鼠的體組成及體成像，最后小鼠采用斷頸處死并按步驟采集樣品。

1.2 測定指標(biāo)及方法

1.2.1 生長性能測定

試驗(yàn)小鼠每周稱重(08:00，空腹)，計(jì)算每周及全期平均日增重；記錄喂料量和余料量，計(jì)算各階段及全期平均日采食量和累積采食量。

1.2.2 血清生化指標(biāo)測定

在試驗(yàn)結(jié)束時，每組10只小鼠分別采集全血，室溫傾斜靜止1 h，室溫條件下4 000 r/min離心10 min獲取血清，-20 ℃保存?zhèn)溆?。用全自動生化分析儀(美國貝克曼，AU5800)及中生北控試劑盒測定血清中總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、尿素(UREA)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量、白蛋白/球蛋白(A/G)及丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)活性。

1.2.3 器官指數(shù)測定

小鼠頸部脫臼處死后，開腹分離完整干凈的脾臟、心臟、肝臟、肺臟、腎臟、皮下脂肪和附睪脂肪等組織，分別進(jìn)行稱重，計(jì)算器官指數(shù)：

器官指數(shù)(%)=(器官重量/體重)×100。

1.2.4 曠場試驗(yàn)

曠場試驗(yàn)箱為1個100 cm×100 cm×50 cm的箱體，箱底畫有25個相等的方格。曠場試驗(yàn)進(jìn)行3 min，將小鼠置于試驗(yàn)箱中央格內(nèi)，觀察并記錄其在總區(qū)域的活動距離、中心區(qū)域的活動距離、中心時間比、平均速度、位于中心次數(shù)和直立次數(shù)。

1.2.5 實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)測定

利用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取玉米RNA，Trizol裂解法提取動物RNA。參照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將1 μg RNA以10 μL體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，加40 μL水稀釋備用。采用熒光定量PCR儀(美國伯樂，CFX96)檢測附睪脂肪β-肌動蛋白(β-actin)、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白-α(C/EBP-α)、過氧化物酶體增殖劑激活受體-γ(PPAR-γ)、脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)、激素敏感脂酶(HSL)和脂肪酸合成酶(FAS)mRNA相對表達(dá)量，反應(yīng)體系為：cDNA 2 μL，10× Taq Polymerase Buffer 2 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)2 μL，上游引物(10 μmol/L)0.4 μL，下游引物(10 μmol/L)0.4 μL，Taq Polymerase(5 U/μL)0.5 μL，加ddH2O補(bǔ)到20 μL；反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性 95 ℃ 2 min；變性95 ℃ 15 s，退火15 s，延伸72 ℃ 40 s，40個循環(huán)；最后95 ℃ 1 min，退火 30 s，95 ℃ 30 s，繪制相應(yīng)的熔解曲線，反應(yīng)設(shè)立無模板反轉(zhuǎn)錄樣品為陰性對照(NTC)。以β-actin為內(nèi)參基因，按照2-△△Ct法計(jì)算目的基因mRNA相對表達(dá)量，引物信息見表2。

表2 qRT-PCR特異性引物

1.3 統(tǒng)計(jì)與分析

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0的one-way ANOVA程序進(jìn)行方差分析，2組間采用t檢驗(yàn)(t-test)進(jìn)行比較，使用GraphPad 6.0制圖，以P<0.05為顯著性標(biāo)準(zhǔn)，P<0.01為差異極顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米RNA對小鼠生長性能的影響

與對照組相比，在第1～2周，試驗(yàn)組小鼠累積采食量極顯著上調(diào)(P<0.01)，試驗(yàn)結(jié)束時保持一致(圖1-A)，平均日采食量無顯著變化(圖1-B，P>0.05)；在第2～4周，試驗(yàn)組小鼠的體重顯著低于對照組(圖1-C，P<0.05)，平均日增重有下降趨勢(圖1-D，P>0.05)。結(jié)果表明，灌服玉米RNA使小鼠增重減少。

*：P<0.05；**：P<0.01。下表同。

為探究玉米RNA對小鼠精神的影響，采用曠場試驗(yàn)檢測小鼠的自主行為和焦慮情況。如圖2所示，與對照組相比，灌服玉米RNA后，小鼠運(yùn)動距離、中央?yún)^(qū)域運(yùn)動距離和時間、進(jìn)入中心次數(shù)、速度和直立次數(shù)均無顯著差異(P>0.05)，提示玉米RNA對小鼠的自主行為活動和焦慮狀況無顯著影響，排除了產(chǎn)生焦慮對小鼠采食和能量代謝造成的影響而導(dǎo)致小鼠增重的減少。

圖2 玉米RNA對小鼠精神的影響

2.2 玉米RNA對小鼠血清生化指標(biāo)的影響

如圖3所示，與對照組相比，試驗(yàn)組血清ALB、TP、尿素含量、A/G、ALT活性無顯著差異(P>0.05)，提示玉米RNA對小鼠肝功能和蛋白質(zhì)代謝無明顯影響；試驗(yàn)組小鼠血清GLB含量顯著增加(P<0.05)，HDL-C、LDL-C和TC含量極顯著增加(P<0.01)，即玉米RNA提高小鼠血脂水平，提示脂肪代謝增強(qiáng)。

圖3 玉米RNA對小鼠血清生化指標(biāo)的影響

2.3 玉米RNA對小鼠脂肪沉積的影響

如圖4所示，與對照組相比，試驗(yàn)組小鼠相對肌肉含量極顯著增加(P<0.01)，檢測小鼠的肌肉抓握力，并無顯著差異(P>0.05)，表明灌服玉米RNA對肌肉力量無顯著影響。試驗(yàn)組小鼠相對脂肪含量下降，并對小鼠進(jìn)行體成像分析發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組小鼠相對脂肪含量明顯減少，且附睪脂肪指數(shù)顯著降低(P<0.05)，提示玉米RNA減少小鼠脂肪沉積。

圖4 玉米RNA對小鼠脂肪沉積的影響

2.4 玉米RNA對小鼠脂肪相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量的影響

如圖5所示，與對照組相比，玉米RNA能極顯著上調(diào)脂肪合成基因C/EBP-α、FASmRNA相對表達(dá)量(P<0.01)及顯著上調(diào)PPAR-γ mRNA相對表達(dá)量(P<0.05)；同時顯著上調(diào)脂肪分解基因ATGL和HSLmRNA相對表達(dá)量(P<0.05)。結(jié)果表明玉米RNA能同時增加小鼠脂肪合成代謝和分解代謝。

圖5 玉米RNA對小鼠脂肪相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量的影響

3 討 論

脂肪的合成與分解始終處于一種動態(tài)的平衡狀態(tài)，脂肪合成的同時也發(fā)生脂解作用，共同調(diào)節(jié)脂肪代謝。這個過程受到許多關(guān)鍵基因的調(diào)節(jié)，PPAR-γ、FAS和C/EBP-α等是參與脂肪細(xì)胞分化和脂肪酸合成關(guān)鍵的促進(jìn)因子，是成脂標(biāo)志性基因[8]；ATGL和HSL是負(fù)責(zé)分解脂肪組織中TG釋放游離脂肪酸的關(guān)鍵酶[9]。試驗(yàn)結(jié)果顯示，玉米RNA促進(jìn)附睪脂肪C/EBP-α、PPAR-γ、FAS、HSL和ATGLmRNA相對表達(dá)量，即同時促進(jìn)機(jī)體脂肪的分解代謝和合成代謝。在白色脂肪中，脂質(zhì)的合成與分解效率直接呈正相關(guān)[10]。在脂肪細(xì)胞分化早期和中期階段，脂肪合成相關(guān)基因PPAR-γ、LPL和FAS等的表達(dá)量依次明顯增高，細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)合成加速，且HSL和ATGL的表達(dá)也會隨之提高，細(xì)胞內(nèi)脂肪分解也開始變得活躍[11]。通過節(jié)食或鍛煉使體重下降，其HSL表達(dá)也隨之下降，脂肪分解減少[12]。特異性敲除小鼠脂肪細(xì)胞的ATGL基因，在抑制脂解和降低血脂的同時，與脂肪合成相關(guān)基因表達(dá)也受到抑制[13]。當(dāng)脂肪積累超出負(fù)荷，脂質(zhì)分解會增加，引起游離脂肪酸升高、高甘油三酯血癥，使人體糖脂代謝紊亂。因此在脂肪細(xì)胞減少脂質(zhì)合成的同時，減少脂解更有利于維持更健康的能量代謝平衡。相應(yīng)地，灌服玉米RNA促進(jìn)脂解增加，同時適當(dāng)?shù)拇龠M(jìn)脂質(zhì)合成增加，更有利于維持機(jī)體脂代謝的平衡。

核酸吸收、分布、代謝和清除的差異性以及不同的飲食攝入都會導(dǎo)致發(fā)揮作用的核酸攝入濃度的不同。研究表明，小腸RNA可酶解產(chǎn)生單獨(dú)一種核苷酸、核苷和堿基的產(chǎn)物，灌服40 μg小腸RNA能修復(fù)輻射造成的腸腺損傷[14]。飼喂80 μg大米RNA能顯著提高小鼠血清中的MIR168a的含量，并抑制靶基因低密度脂蛋白受體的表達(dá)；單獨(dú)灌服3×10-10mol MIR168a能抑制小鼠肝臟低密度脂蛋白受體的表達(dá)，增加料重比[15]。用金銀花熬制成水(MIR2911約6×10-13mol/g，濃度為1.2×10-10mol/L)飼喂小鼠能恢復(fù)因流感病毒造成的體重減輕[16]。本試驗(yàn)每天灌服3 g玉米提取的100 μg RNA，證實(shí)玉米RNA可以調(diào)節(jié)脂肪代謝，可作為控制脂肪沉積的有效成分。因此，推測在正常生理狀態(tài)下，玉米RNA可以減少小鼠增重，合理控制體重；過度肥胖時，一定劑量范圍內(nèi)增加玉米RNA能減少脂肪沉積，減少體重。體重變化會涉及多方面的代謝及生理生化的調(diào)節(jié)，包括消化生理、器官形態(tài)及血液生化指標(biāo)等[17]。試驗(yàn)組小鼠增重顯著減少，呈現(xiàn)持續(xù)平穩(wěn)的增長狀態(tài)，平均日采食量和平均日增重?zé)o顯著差異，表明其對攝食及消化吸收無顯著影響；心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和胃的器官指數(shù)無明顯異常；曠場試驗(yàn)顯示小鼠未出現(xiàn)焦慮狀況，且血清生化指標(biāo)顯示小鼠的血清ALB、TP含量、A/G和ALT活性無顯著差異，即小鼠肝功能正常，血清尿素含量無異常，即蛋白質(zhì)代謝正常，表明玉米RNA對小鼠無明顯有害影響。血清中HDL-C、LDL-C和TC含量顯著增加，即脂代謝增強(qiáng)，體組成、體成像和附睪脂肪指數(shù)結(jié)果顯示小鼠相對肌肉含量顯著增加，內(nèi)臟脂肪沉積明顯減少。這些結(jié)果表明玉米RNA對小鼠無明顯有害影響，能增強(qiáng)機(jī)體脂肪代謝，減少脂肪沉積。

RNA進(jìn)入腸道可被各種酶降解為單核苷酸，最終被腸道內(nèi)的堿性磷酸酶和核苷酸酶水解為核苷和磷酸，部分核苷可在核苷酶的作用下被進(jìn)一步降解為游離的嘌呤或嘧啶堿基，供機(jī)體利用[18]。進(jìn)入機(jī)體的核苷酸如腺嘌呤核苷酸(AMP)能刺激AMP激活的蛋白激酶(AMPK)調(diào)控能量和底物代謝，并通過刺激產(chǎn)生ATP抑制脂肪沉積[19]。不同的核苷酸對不同的脂肪組織功能不同，0.1%復(fù)合核苷酸能降低肝臟脂肪含量同時提高肌肉脂肪含量[20]。此外，RNA寡核苷酸藥物已被開發(fā)為藥物針進(jìn)行疾病治療?？诜?0 mg/kg特異性靶向Forkhead box O1(Foxo-1)的2’-O-甲基修飾的反義RNA寡核苷酸，可以顯著抑制Foxo-1基因的表達(dá)及肌肉的重量[5]。玉米mRNA可能通過降解產(chǎn)生的短片段核酸或核苷酸調(diào)節(jié)脂肪的沉積。

RNA中的許多非編碼RNA具有一定的穩(wěn)定性，如siRNA[21]和miRNA[21]等具有2’-O-甲基化修飾，circRNA具有穩(wěn)定的閉環(huán)結(jié)構(gòu)[22]，利于其吸收并發(fā)揮作用。動物miRNA廣泛參與脂肪代謝的調(diào)節(jié)[23]。Sun等[24]報道lncRNA對脂肪代謝的調(diào)控作用，后有研究進(jìn)一步挖掘和分析豬的9個組織，發(fā)現(xiàn)了147個脂肪circRNA[25]，表明這些非編碼RNA可能參與脂肪代謝的調(diào)控。研究表明，植物源功能性核酸miRNA可以跨界調(diào)節(jié)動物的生理過程[15-16]，且在豬的包括脂肪在內(nèi)的12個組織中檢測到的18個玉米miRNA，均有不同程度的表達(dá)[26]，提示玉米功能性RNA有可能被機(jī)體吸收調(diào)節(jié)脂肪的沉積。這些植物來源功能性RNA對于脂肪的調(diào)節(jié)有待進(jìn)一步研究。盡管外源性RNA跨界調(diào)控作用仍然存在爭議[27]，研究存在極大的挑戰(zhàn)，但是外源核酸通訊仍是目前研究的一個新的重要領(lǐng)域，具有廣闊的前景。這一領(lǐng)域的突破進(jìn)展將對于人類疾病和生活的影響具有重要的意義。

4 結(jié) 論

綜上所述，玉米RNA在不影響小鼠正常生長的情況下能提高脂肪合成基因FAS、C/EBP-α、PPAR-γ和脂肪分解基因ATGL、HSL的mRNA相對表達(dá)量，增強(qiáng)機(jī)體脂肪代謝；脂肪分解作用大于合成作用，使脂肪沉積減少，增重減少。