王星果 盧 建,2* 關(guān)樹勇 曲 亮 孫平江 郭 軍 胡玉萍 竇套存 馬 猛 李永峰 王克華**

(1.江蘇省家禽科學(xué)研究所，揚州 225125；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，南京 210095；3.江蘇峪口禽業(yè)有限公司，宿遷 223733)

隨著我國蛋雞市場日趨飽和，蛋雞業(yè)正在從數(shù)量增長模式向質(zhì)量提高模式轉(zhuǎn)變，這就需要對蛋雞的生產(chǎn)性能作進一步改善。影響蛋雞生產(chǎn)性能的因素復(fù)雜，其中營養(yǎng)水平是一個很重要的因素，營養(yǎng)水平過低或過高都會影響蛋雞的健康，降低蛋雞的生產(chǎn)效益[1]。對蛋雞的營養(yǎng)調(diào)控可以從能量[2]、蛋白質(zhì)[3]、維生素[4]和礦物質(zhì)[5]水平等方面進行，其中能量水平的調(diào)控以往不夠重視，但隨著科學(xué)研究的深入，人們越來越認識到能量水平對蛋雞的生長發(fā)育及生產(chǎn)性能有著重要影響[6]。再加上對節(jié)約飼糧成本的考慮，人們更加重視能量水平對蛋雞生長和生產(chǎn)的調(diào)控[7]，其中對育成期蛋雞能量水平進行調(diào)控是其中的一個方向。

肝臟作為雞物質(zhì)代謝特別是脂質(zhì)代謝的主要器官，攝入的能量物質(zhì)主要在肝臟中進行代謝，肝臟對育成期蛋雞的能量調(diào)控起著關(guān)鍵作用。miRNA是近年來研究較熱的一類小分子物質(zhì)，其通過靶向調(diào)控功能基因的表達進而調(diào)控各種生物過程，在肝臟中也發(fā)揮了重要作用，特別是對肝臟代謝[8-10]。因此，研究雞肝臟miRNA特別是育成期蛋雞能量調(diào)控后肝臟miRNA具有重要意義，且目前尚無其表達譜的相關(guān)研究，對此進行研究很有必要。有關(guān)育成期蛋雞能量調(diào)控的研究集中在對調(diào)控后蛋雞的表觀特征進行闡述，如呂秋鳳等[11]用4種不同能量水平的飼糧飼喂育成期蛋雞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高能組可顯著提高蛋雞的體重；張李俊等[12]用3種不同能量水平的飼糧飼喂育成期蛋雞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)中高能組蛋雞的體重顯著高于低能組，產(chǎn)蛋率也高于低能組；李娜等[13]用5種不同能量水平的飼糧飼喂育成期蛋雞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)次高能組蛋雞的體重和屠宰性能均顯著高于低能組。研究也發(fā)現(xiàn)，miRNA在雞肝臟代謝中發(fā)揮了重要作用，如miR-122通過負調(diào)控靶基因脂肪酸結(jié)合蛋白5(FABP5)、脯氨酰羥化酶alpha亞基(P4HA1)和泛酰巰基乙胺酶1(VNN1)等對肝臟代謝起調(diào)控作用[14-16]；miR-33通過靶向抑制基因脂肪量和肥胖相關(guān)蛋白(FTO)、肉毒堿氧辛基轉(zhuǎn)移酶(CROT)等的表達進而對肝臟代謝起調(diào)控作用[17-18]。有關(guān)雞miRNA表達譜的研究很少，如性成熟啟動前后下丘腦miRNA表達譜、皮質(zhì)酮處理的雛雞法氏囊miRNA表達譜、經(jīng)選育的肉雞胸肌miRNA表達譜研究[19-21]。

本課題組前期研究了育成期能量攝入量對蛋雞體重和產(chǎn)蛋性能的影響，使用4種不同能量水平飼糧飼喂育成期蛋雞，發(fā)現(xiàn)12～21周齡時不同能量組之間蛋雞的體重始終保持極顯著差異，高能組>中高能組>中低能組>低能組；能量水平越高，開產(chǎn)日齡越早，低能組、中低能組和中高能組集中在22周齡開產(chǎn)，高能組在21周齡開產(chǎn)，且高能組的開產(chǎn)日齡極顯著早于其他各組；不同能量組43周齡時的產(chǎn)蛋數(shù)也有差異，高能組顯著高于其他各組；但尚未進行miRNA相關(guān)研究。本研究選取高能組和低能組飼糧飼喂育成期蛋雞，并對其肝臟miRNA進行高通量測序，分析其表達譜，對其靶基因進行預(yù)測和功能研究，為探明肝臟miRNA在高能飼糧對蛋雞生產(chǎn)性狀的調(diào)控中所起的作用，進而為改善蛋雞生產(chǎn)性狀打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理

以江蘇省家禽科學(xué)研究所選育的如皋黃雞蛋雞為試驗動物。選取體重相近的9周齡母雞160只，隨機分成2個組，每組8個重復(fù)，每個重復(fù)10只雞，分別定量飼喂代謝能水平為10.88(低能組)和12.14 MJ/kg(高能組)的飼糧。前8周常規(guī)飼養(yǎng)，18周齡后自由采食相同營養(yǎng)水平的標準飼糧，試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1，以粉料形式分9～18周齡和19～20周齡2個階段配制及飼喂。蛋雞的采食量、能量攝入量及體重見表2，以平均值表示，使用SPSS 19.0軟件中的t檢驗進行顯著性分析。9～16周齡在育成雞舍4層階梯籠內(nèi)飼養(yǎng)(5只/籠)，17周齡起在產(chǎn)蛋雞舍3層階梯籠內(nèi)飼養(yǎng)(1只/籠)。整個試驗期間，所有雞只自由飲水，常規(guī)光照和免疫。

表1 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))

表2 蛋雞的采食量、能量攝入量及體重

1.2 樣品采集與small RNA測序

于20周齡時，每個重復(fù)隨機選取1只蛋雞，稱重后每組選取最接近平均體重的3只，屠宰后取肝臟組織，放入液氮保存。

采用TRIzol提取肝臟組織總RNA，使用Agilent 2100毛細管電泳檢測RNA質(zhì)量，采用Illumina的Truseq small RNA樣品準備試劑盒構(gòu)建small RNA文庫，PCR擴增富集，加上測序接頭和Index部分，并通過凝膠電泳純化，利用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit對文庫進行定量，Illumina Hiseq平臺上機測序。

1.3 miRNA序列分析

測序得到的原始數(shù)據(jù)去除接頭后進行質(zhì)量過濾，得到純凈序列，對序列長度在18 nt以上的純凈序列進行去重處理后，得到唯一序列，使用Bowtie程序?qū)⒓儍粜蛄泻臀ㄒ恍蛄信c雞基因組比對，能比對上的序列進行后續(xù)分析。

將后續(xù)分析序列與miRBase中的已知miRNA成熟序列和前體序列進行比對，對比對上的序列進行注釋并以各相應(yīng)成熟miRNA為單位統(tǒng)計表達量。剩余序列與雞基因組中其余非編碼RNA(rRNA、snRNA、snoRNA、tRNA)進行比對并注釋。

對注釋到已知miRNA的序列表達量進行標準化，采用DESeq分析表達差異miRNA，按照表達量倍數(shù)差異(fold change)>2.0或<0.5和表達差異顯著性P<0.05篩選出差異表達miRNA。根據(jù)前期鑒定的高能組和低能組肝臟差異表達基因，以高能組上調(diào)miRNA對應(yīng)下調(diào)基因，下調(diào)miRNA對應(yīng)上調(diào)基因，以差異表達基因mRNA的3′UTR序列為目標序列，應(yīng)用miRanda軟件對差異表達miRNA進行靶基因和靶位點預(yù)測。采用超幾何分布對差異表達miRNA的靶基因進行基因本體論(gene ontology，GO)功能和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信號通路富集分析。

2 結(jié) 果

2.1 蛋雞肝臟small RNA測序質(zhì)量分析

2組蛋雞肝臟small RNA經(jīng)過高通量測序，得到原始序列，結(jié)果見表3。從表中可以看出，6個樣品測得的原始序列均在千萬以上，而純凈序列/原始序列很高，集中在83%～89%，說明低質(zhì)量的序列較少，測序效果較好。高能組與低能組相比，原始序列和純凈序列的數(shù)量均相當，說明2組測序質(zhì)量相近。

表3 測序數(shù)據(jù)初步分析

2.2 蛋雞肝臟miRNA鑒定

將各樣品純凈序列去重后的唯一序列與雞參考基因組比對，比對上的序列再與miRBase中的miRNA及前體作比對，對其進行注釋，得到每個樣品注釋到的miRNA及前體，結(jié)果見表4。從表中可以看出，6個樣品能注釋到的miRNA均超過300個，占miRBase中已鑒定的雞miRNA的近1/3。從前體結(jié)果可見每個樣品鑒定出的miRNA有少部分定位在同一個前體上。各樣品注釋到miRNA的純凈序列占全部純凈序列的比例都在50%左右。表5顯示了注釋到各非編碼RNA的純凈序列情況，幾種主要的非編碼RNA中，miRNA比其他非編碼RNA多1～3個數(shù)量級。以上結(jié)果表明，miRNA在雞肝臟中數(shù)量及含量都很多，說明其具有重要的作用。

表4 miRNA數(shù)據(jù)統(tǒng)計

表5 非編碼RNA純凈序列統(tǒng)計

2.3 高能飼糧對蛋雞肝臟miRNA表達量的影響

將高能組和低能組樣品中鑒定出的miRNA表達量進行比較分析，篩選出差異表達miRNA，結(jié)果見表6。從表中可以看出，與低能組相比，高能組有2個上調(diào)miRNA(miR-1684a-3p和miR-1682)，6個下調(diào)miRNA(miR-15a、miR-203a、miR-144-5p、miR-19b-3p、miR-29c-3p和miR-29a-3p)。其中miR-1684a-3p差異最明顯，相差了200多倍，而miR-1682在低能組中未檢測出，其可能在高能組具有特殊作用。

表6 差異表達miRNA

2.4 肝臟差異表達miRNA靶基因預(yù)測

課題組前期鑒定出高能組和低能組肝臟差異表達基因188個，其中高能組上調(diào)82個，下調(diào)106個，對高能組和低能組差異表達的8個miRNA運用miRanda進行差異表達基因的靶基因預(yù)測，共預(yù)測出41個潛在靶基因，結(jié)果見表7。由表可以看出，其中miR-15a預(yù)測出的靶基因最多，為26個，而miR-1682預(yù)測出的靶基因最少，為3個。miR-29c-3p與miR-29a-3p由于只有末尾差1個堿基，其種子序列相同，故其預(yù)測靶基因也相同。

表7 差異表達miRNA靶基因預(yù)測

2.5 肝臟差異表達miRNA靶基因功能分析

2.5.1 GO功能富集分析

對高能組和低能組差異表達miRNA的預(yù)測差異表達靶基因進行GO功能富集分析，發(fā)現(xiàn)有192個顯著富集的GO功能，其中147個富集在生物過程(biological process, BP)，11個富集在細胞組分(cellular component, CC)，36個富集在分子功能(molecular function, MF)。圖1顯示了富集最顯著的20個GO功能，其中富集較多的是免疫系統(tǒng)過程正調(diào)控和分子功能正調(diào)控，涉及的基因有整合素亞基beta3(ITGB3)、RAB7B RAS癌基因家族成員(RAB7B)、甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白2(IGFBP2)、淋巴細胞抗原96(LY96)(免疫系統(tǒng)過程正調(diào)控)和RAB7B、鳥苷酸環(huán)化酶激活物1A(GUCA1A)、RasGEF結(jié)構(gòu)域家族成員1C(RASGEF1C)、G蛋白信號調(diào)節(jié)因子6(RGS6)、印度hedgehog信號分子(IHH)、ARFGEF家族成員3(ARFGEF3)、高遷移率組核小體結(jié)合結(jié)構(gòu)域3(HMGN3)、谷氧還蛋白(GLRX)(分子功能正調(diào)控)，分別是5和8個，占總差異表達基因的12.2%和19.5%，說明它們是較為重要的GO功能。

圖1 差異表達miRNA預(yù)測差異表達靶基因GO富集分析：富集最顯著的20個功能

2.5.2 KEGG信號通路富集分析

對高能組和低能組差異表達miRNA的預(yù)測差異表達靶基因進行KEGG信號通路富集分析，發(fā)現(xiàn)有4個顯著富集的KEGG信號通路。表8顯示了顯著富集的KEGG信號通路及其涉及的基因，其中脂肪酸延長、非不飽和脂肪酸生物合成與脂質(zhì)代謝相關(guān)，吞噬體與免疫相關(guān)，光轉(zhuǎn)導(dǎo)與視覺相關(guān)，提示差異表達miRNA可能影響這幾個信號通路。

表8 差異表達miRNA預(yù)測差異表達靶基因KEGG富集分析

3 討 論

測序是現(xiàn)今運用廣泛的組學(xué)技術(shù)，且隨著技術(shù)的不斷進步，數(shù)據(jù)的容量和質(zhì)量都有了很大提高，現(xiàn)在常用的small RNA測序數(shù)據(jù)量一般都在一千萬以上原始序列[19,22]，本研究small RNA測序所得原始序列就在10 000 000以上。同時本研究的測序數(shù)據(jù)質(zhì)量較高，能比對上miRNA的序列比例較高，且比其他非編碼RNA所占比例多1～3個數(shù)量級。結(jié)果表明，本研究miRNA測序所得數(shù)據(jù)質(zhì)量較高，后期分析結(jié)果較準確，置信度更高。

在對差異表達miRNA進行分析的過程中，本試驗發(fā)現(xiàn)上調(diào)的2個miRNA(miR-1682和miR-1684a-3p)在低能組無表達或痕量表達，提示它們在能量攝入量對肝臟的影響中發(fā)揮了很重要的作用，而這2個miRNA暫無功能研究報道，因此有必要進行更深入的研究。

使用本課題組前期鑒定的低能組和高能組肝臟差異表達基因作為候選基因進行差異表達miRNA的靶基因預(yù)測，可將有效靶基因的范圍大大縮小，陽性率也更高，其他研究者也有運用此方法的良好例子(差異表達miRNA與差異表達基因聯(lián)合分析)[23-26]。miR-15a的預(yù)測靶基因數(shù)最多，提示其可能在能量攝入量對肝臟的影響中作用更明顯。

在GO功能富集分析中，富集較多的主要是與免疫和分子功能調(diào)控相關(guān)的功能，說明miRNA是通過調(diào)控免疫和分子功能相關(guān)的基因進而調(diào)控這些過程的。之前本課題組分析育成期高能和低能飼糧飼喂的蛋雞肝臟中差異表達基因的GO功能，也發(fā)現(xiàn)富集較多的有免疫相關(guān)功能，提示免疫相關(guān)過程受miRNA調(diào)控更多。由此表明，能量攝入量能直接或間接影響蛋雞的免疫功能。

在KEGG信號通路富集分析中，也發(fā)現(xiàn)了與免疫相關(guān)的信號通路顯著富集——吞噬體，吞噬體在動物細胞內(nèi)起到抗原呈遞、降解以及激活免疫的作用，是免疫過程中十分重要的環(huán)節(jié)[27-28]。吞噬體也能受到外界環(huán)境的影響，如洋蔥伯克氏菌感染能延遲吞噬體成熟[29]。推測能量攝入量的差異通過影響miRNA的表達進而影響蛋雞肝臟的吞噬體等免疫相關(guān)信號通路。除免疫相關(guān)信號通路，本試驗還發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)代謝相關(guān)信號通路顯著富集，這與Agrawal等[30]使用高能飼糧飼喂奶牛，KEGG分析發(fā)現(xiàn)血液白細胞中差異表達基因顯著富集在不飽和脂肪酸氧化磷酸化以及Toll樣受體信號通路的結(jié)果類似。這提示miRNA主要影響免疫和脂質(zhì)代謝相關(guān)信號通路。

4 結(jié) 論

綜上所述，對育成期蛋雞進行高能飼糧飼喂可通過調(diào)控miR-15a等幾個miRNA上調(diào)或下調(diào)肝臟中免疫和脂質(zhì)代謝相關(guān)靶基因的表達，最終調(diào)控蛋雞的免疫和脂質(zhì)代謝，并影響生產(chǎn)性能。