莊明亮 李劍飛 李志勇 王 志 牛慶生 陳東海 葛 蓬 張 發(fā)
(吉林省養(yǎng)蜂科學研究所,吉林 132108)
蜜蜂作為重要的傳粉昆蟲,具有巨大的生態(tài)價值和經濟價值[1-2]。其中,工蜂是蜂群中的主要組成部分,負責采集花粉花蜜、修造巢脾、哺喂幼蟲等除了生殖以外的所有任務。研究工蜂的營養(yǎng)代謝,尋求合理、均衡的蜜蜂飼糧,在蜂群無法獲得天然飼糧或者特殊環(huán)境中使用時,有利于工蜂的生長發(fā)育和延長工蜂的壽命,對于養(yǎng)蜂生產意義重大。
近年來,蜜蜂的營養(yǎng)研究取得了階段性進展,但主要集中在蜜蜂幼蟲發(fā)育時期的蛋白質[3-5]、維生素[6-7]、礦物質[8]等營養(yǎng)需要,缺少對成年工蜂營養(yǎng)的系統(tǒng)研究。蜂糧是成年工蜂的天然食糧,是蜜蜂從蜜源植物中采集的花粉混入花蜜和分泌物貯存在蜂巢中后發(fā)酵的不規(guī)則團狀物[9]。有研究表明,蜂糧中營養(yǎng)成分特別復雜,含碳水化合物、蛋白質、脂肪、維生素、類黃酮和類胡蘿卜素等[10-12],對維持蜂群正常的發(fā)育生長有著至關重要的作用[13-14]。
本試驗通過飼喂蜜蜂含有一定比例蜂糧、花粉、蔗糖粉的飼糧,與傳統(tǒng)的煉糖飼料進行對比,篩選出最優(yōu)配方的飼糧,通過液相色譜/質譜聯(lián)用技術(liquid chromatograph mass spectrometer,LC-MS)檢測其對幼年工蜂代謝圖譜的影響,通過主成分分析(principal component analysis,PCA)、偏最小二乘法判別分析(partial leastsquares discriminant analysis,PLS-DA)和正交偏最小二乘法-判別分析(orthogonal partial leastsquares-discriminant analysis, OPLS-DA),篩選對工蜂代謝影響的差異代謝物,并結合代謝通道數據庫京都基因和基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)探討代謝通路,發(fā)掘對蜜蜂生長發(fā)育和壽命起關鍵作用的營養(yǎng)因素,為合理配制工蜂飼糧提供理論基礎。
1.1.1 蜂群
試驗蜂群為吉林省養(yǎng)蜂科學研究所飼養(yǎng)的意大利蜜蜂(Apismelliferaligustica),蜜蜂群勢13足框,蜂子比為0.9,3.0張封蓋蜜脾、0.5張粉脾的健康蜂群。
1.1.2 試劑與原料
蜂糧(取自健康蜂群,現取現用)、花粉(雜花粉)、蜂蜜(7月蜂場自取波美度42°成熟椴樹蜜,保存于干燥通風的室內)、蔗糖粉(食品級研磨80目顆粒,廣西大新湘桂制糖有限公司)、甲醇(色譜純,上海筠安分析技術有限公司)、甲酸(色譜純,上海筠安分析技術有限公司)、乙腈(色譜純,上海筠安分析技術有限公司)、L-2-氯苯丙氨酸(色譜純,生工生物工程股份有限公司)等。
以蔗糖粉、蜂糧、蜂蜜和花粉為原料,按照一定比例混合配制5種飼糧。對照組飼糧:蔗糖粉和蜂蜜按3∶1比例進行充分揉搓,裝入飼糧盒5 g備用;試驗組A飼糧:蔗糖粉、蜂糧、蜂蜜按照6∶5∶1比例充分揉搓,裝入飼糧盒5 g備用;試驗組B飼糧:蔗糖粉、蜂糧、蜂蜜按照6∶3∶1比例充分揉搓,裝入飼糧盒5 g備用;試驗組C飼糧:蔗糖粉、花粉、蜂蜜按照6∶5∶1比例充分揉搓,裝入飼糧盒5 g備用;試驗組D飼糧:蔗糖粉、花粉、蜂蜜按照6∶3∶1比例充分揉搓,裝入飼糧盒5 g備用。飼糧盒為長方體(長×寬×高=15 cm×4 cm×3 cm),頂面用鐵紗,其余為木質結構。飼糧組成見表1。
表1 飼糧組成
試驗前準備空巢脾,放到繼箱里利用工蜂清理干凈。將清理干凈的巢脾放入巢箱中間位置,并用框式限王產卵器限制蜂王在此巢脾上產卵12 h,然后將蜂王取出,把產卵巢脾放入繼箱中,工蜂出房前1天放到34.5 ℃培養(yǎng)箱里,待工蜂出房,即1日齡工蜂。試驗抓取1日齡工蜂在室內常溫(25~29 ℃)飼養(yǎng),分為5組,模擬蜂王郵寄時飼喂工蜂情況,一次性補足上述5種人工飼糧。每組做3個平行。
1.4.1 蜜蜂死亡情況的觀察
每組飼糧盒內裝入30只1日齡的工蜂,放在室內常溫(25~29 ℃)飼養(yǎng)。每天定時觀察蜜蜂的死亡情況,作記錄并清理死蜂。
1.4.2 咽下腺重量測定和觀察
室內飼養(yǎng)對照組和試驗組A第1、3、5和7天后,每組取7只工蜂,剪下工蜂頭部用濃度75%的酒精進行表面消毒,并剪去觸角,用昆蟲針固定在蠟盤中間。在解剖顯微鏡下用小手術剪刀剪除復眼,然后用昆蟲針挑去咽下腺周圍的頭涎腺后,輕輕取出咽下腺。把剛解剖好的咽下腺用天平進行稱重。然后把咽下腺放在干凈的載破片上,滴1滴蒸餾水,讓咽下腺展開,置于顯微鏡下觀察顏色和飽滿程度。
1.4.3 代謝組學分析測定
1.4.3.1 樣品采集
對照組和試驗組A室內飼養(yǎng)7 d,取樣生命體征正常的蜜蜂(以能自由爬動為準),2只成年工蜂裝入1個2 mL離心管中,放入液氮中冷凍2 h轉入-80 ℃冰箱保存,每組6個重復。
1.4.3.2 樣本前處理
研磨整只蜜蜂,稱取30 mg,加入內標(L-2-氯苯丙氨酸,0.3 mg/mL;Lyso PC17∶0,0.01 mg/mL,均為甲醇配制)各20 μL和400 μL的甲醇∶水(體積比為4∶3);加入2個小鋼珠,在-20 ℃放置2 min預冷,加入研磨機(60 Hz,2 min);冰水浴中超聲提取10 min;-20 ℃靜置20 min;離心10 min(13 000 r/min,4 ℃),取300 μL上清液揮干,然后400 μL甲醇-水(體積比為1∶4)復溶,渦旋30 s,超聲2 min;離心10 min(13 000 r/min,4 ℃),用注射器吸取150 μL的上清液,使用0.22 μL的有機相針孔過濾器過濾后,轉移到LC進樣小瓶,-80 ℃下保存,直到進行LC-MS分析。
1.4.3.3 檢測條件
色譜條件:色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C-18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm),流速0.35 mL/min,柱溫45 ℃;流動相A為0.1%甲酸,流動相B為甲醇。流動相梯度洗脫程序見表2。
表2 流動相梯度洗脫程序
質譜條件:質譜采用電噴霧離子源(ESI),噴霧電壓正離子3 500 V負離子3 100 V,鞘氣體流速35 arb,輔助氣體流速10 arb,毛細管溫度320 ℃。
試驗數據通過預處理,利用代謝組學處理軟件Progenesis QI v2.3 軟件(Nonlinear Dynamics, Newcastle, UK)分析,利用PLS-DA、OPLS-DA得分圖和PLS-DA排序點圖驗證模型是否穩(wěn)定和出現過擬合現象,用變量投影重要度(variable importance in the projection,VIP)分析結合t檢驗來篩選差異代謝物。計算方法為R語言的Cor函數,其中Q2代表模型預測率,R2代表模型可解釋率,Q2>0.5表示模型具有較好的判別分析能力,Q2和R2越接近說明模型越穩(wěn)定可靠無過擬合現象?;诰_質量數、二級碎片以及同位素分布,使用KEGG、人類代謝組數據庫(the human metabolome database,HMDB)、Lipidmaps(v2.3)以及Metabolite Link(METLIN)數據庫并結合文獻進行定性。
由表3可知,各組蜜蜂在第1和2天時均沒有出現死亡;試驗組C和試驗組D均在第3天時出現死亡,在第5天時30只工蜂全部死亡;試驗組B在第3天時出現死亡,在第6天時30只工蜂全部死亡;對照組和試驗組A第1~5天時均沒有出現死亡,在第6和7天時試驗組A蜜蜂死亡數量均顯著低于對照組(P<0.05)。
表3 不同飼糧對蜜蜂死亡數量的影響
由表4可知,工蜂食用人工飼糧第1天時,對照組和試驗組A咽下腺平均重量差異不顯著(P>0.05);咽下腺顏色均為水白色;咽下腺小體飽滿度均為不飽滿。工蜂食用人工飼糧第3天時,對照組和試驗組A咽下腺平均重量差異不顯著(P>0.05);對照組咽下腺顏色為水白色,試驗組A咽下腺顏色為少數乳白色,多數水白色;咽下腺小體飽滿度均為不飽滿。工蜂食用人工飼糧第5天時,對照組和試驗組A咽下腺平均重量差異不顯著(P>0.05);對照組咽下腺顏色為少數乳白色,多數水白色;試驗組A咽下腺顏色為少數水白色,多數乳白色;對照組咽下腺小體飽滿度為不飽滿,試驗組A咽下腺小體飽滿度為較飽滿。工蜂食用人工飼糧第7天時,對照組和試驗組A咽下腺平均重量差異顯著(P<0.05);對照組咽下腺顏色為少數乳白色,多數水白色;試驗組A咽下腺顏色為全部乳白色;對照組咽下腺小體飽滿度為較飽滿,試驗組A咽下腺小體飽滿度為飽滿。
表4 不同飼糧對蜜蜂咽下腺發(fā)育的影響
由圖1可知,以基于LC-MS的代謝組學方法鑒別代謝物,總離子色譜圖沒有明顯的峰漂移,具有穩(wěn)定的保留時間。將提取出的數據矩陣進行單變量和多變量統(tǒng)計分析,通過t檢驗,設置閾值為VIP>1.0,差異倍數(FC)>2.0,篩選出429個差異代謝物,其中185個下調,244個上調。
圖1 對照組與試驗組A差異代謝物的火山圖
由圖2-A可知,每個點代表1個樣本,點與點的距離代表樣本之間的相似性,全部樣本均在95%的置信區(qū)間內,對照組與試驗組A能夠明顯區(qū)分(正方形代表對照組,三角形代表試驗組A)。
由圖2-B可知,在PCA模型的基礎上進一步探討不同飼糧對蜜蜂引起的代謝差異,找到差異代謝物,建立PLS-DA模型,對對照組和試驗組A重建模型,放大它們之間的差異,得到更好的分類效果。運用交叉驗證(cross validation)法對PLS-DA模型進行驗證,Q2均大于0.50,模型均穩(wěn)定可靠(Q2>0.50表示模型具有較好的判別分析能力)。
圖2 對照組與試驗組A代謝物PCA和PLS-DA得分圖
OPLS-DA得分圖見圖3-A,結合了正交信號矯正(OSC)和PLS-DA方法,減少噪音干擾,使重要變量得到凸顯,有利于差異代謝物的識別,OPLS-DA分析通過去除不相關的差異來篩選,能夠得到更準確的差異變量。對OPLS-DA模型分析,前3個有效主成分的R2X(cum)=0.628,R2Y(cum)=0.995,Q2(cum)=0.917,表明模型質量較好(正方形代表對照組,三角形代表試驗組A)。
為了判別模型是否過擬合,對模型進行排序驗證,見圖3-B。所有的Q2均在R2之下,并且Q2的回歸直線與y軸的交點均在y軸的負半軸(Q2<0),沒有過擬合現象,模型穩(wěn)定可靠有意義,可進行差異代謝物的分析。
2.4.1 差異代謝物鑒定
由表5可知,試驗組A與對照組的差異代謝物情況,利用代謝物的精確分子質量和二級質譜信息在KEGG、HMDB等數據庫搜索比對,進行鑒定指認,共指認出23個差異代謝物,包括氨基酸、維生素、糖類等,其中有10種代謝物上調,13種代謝物下調。
表5 對照組與試驗組A的差異代謝物
2.4.2 差異代謝物通路分析
由圖4可知,差異極顯著的通路有牛磺酸和亞?;撬嵘锖铣赏罚嚢彼峤到馔?、戊糖磷酸鹽代謝通路、戊糖和葡萄糖醛酸相互轉化通路(P<0.01);差異顯著的通路有氨基酸的生物合成通路,色氨酸代謝通路,碳代謝通路,丁酸代謝通路,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路,丙酮酸代謝通路(P<0.05)。
Taurine and hypotaurine metabolism:?;撬岷蛠喤;撬嵘锖铣?;Lysine degradation:賴氨酸降解;Pentose phosphate metabolism:戊糖磷酸鹽代謝;Pentose and glucuronate interconversions:戊糖和葡萄糖醛酸相互轉化;Biosynthesis of amino acids:氨基酸的生物合成;Tryptophan metabolism:色氨酸代謝;Carbon metabolism:碳代謝;Butanoate metabolism:丁酸代謝;Alanine, aspartate and glutamate metabolism:丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝;Pyruvate metabolism:丙酮酸代謝。
隨著人們對蜜蜂種質資源的重視,引入蜜蜂良種成為飼養(yǎng)管理的重要措施,其中長途郵寄蜂王引種又是目前最為常用方式。長途郵寄蜂王會裝入幾只陪嫁青年工蜂,再裝入煉糖飼糧,保證郵寄過程蜂王的安全,但通常會出現蜂王腹部收縮變小、延遲產卵的現象。蜜蜂營養(yǎng)對于蜜蜂正常生長、繁殖起著重要的作用,在日常飼養(yǎng)管理中通過補充蜂蜜和花粉來保證蜂群的生長和繁育[15],但在長途郵寄等特殊環(huán)境中如何保證蜜蜂存活和發(fā)育。本試驗通過陪嫁工蜂入手,通過不同配方的飼糧對比,找到既能保證工蜂長時間存活又能保證咽下腺發(fā)育的飼糧,這樣陪嫁青年工蜂就能分泌蜂王漿飼喂蜂王,保證蜂王的營養(yǎng)需求。然后利用代謝組學研究蜜蜂工蜂代謝規(guī)律,找到影響工蜂生長發(fā)育的關鍵營養(yǎng)因子。
根據工蜂在蜂群日常的飼糧,本試驗配制不同比例的蜂糧和花粉的人工飼糧,與僅含有蜂蜜和蔗糖的練糖飼糧對比。結果發(fā)現,最先出現蜜蜂死亡是試驗組C和D,出現在室內飼養(yǎng)的第3天,第5天時試驗組C和D蜜蜂全部死亡。試驗組B蜜蜂在第5和6天出現大量死亡,試驗組B的飼糧出現粘黏蜜蜂現象,這可能是導致蜜蜂出現大量死亡的原因。試驗組B、C、D蜜蜂在5 d內即全部死亡,存活時間短,無法滿足實際要求。7 d內試驗組A蜜蜂死亡數量最少,延長室內飼養(yǎng)時間發(fā)現A組蜜蜂存活時間更長且蜜蜂生命體征更活躍,表明試驗組A的飼糧更加適合蜜蜂,能夠保證蜜蜂在無法排泄的特殊環(huán)境中正常存活,存活時間能夠滿足全國范圍內的郵寄。Gregory[16]研究發(fā)現,用不同蛋白質水平的代用花粉對實驗室籠養(yǎng)蜜蜂進行壽命測定,得出蛋白質水平較高的代用花粉能提高工蜂存活率,本試驗結果與此相一致。
咽下腺是一對位于工蜂頭部的外分泌腺體,是合成、分泌蜂王漿的主要腺體,其分泌物是飼喂蜂王和幼蟲的主要食物,咽下腺的重量、顏色和飽滿度是評價其發(fā)育的重要指標,一般認為顏色乳白色、咽下腺小體飽滿是發(fā)育成熟的標識[17]。蜜蜂咽下腺的發(fā)育必須需要蛋白質,蜂王漿的多種生物活性成分也都與蛋白質有關。對能夠長時間存活的對照組和試驗組A蜜蜂,分別在食用飼糧第1、3、5、7天時進行咽下腺解剖稱重和觀察,咽下腺的重量在食用飼糧第7天時2組出現差異,試驗組A蜜蜂的咽下腺重量顯著大于對照組。咽下腺顏色在食用飼糧第3天時出現不同,試驗組A少數咽下腺小體為乳白色,而對照組咽下腺小體全部為水白色;第7天時試驗組A咽下腺小體全部為乳白色,對照組咽下腺小體只有少數乳白色。對照組和試驗組A咽下腺小體,食用飼糧第1和3天后均呈不飽滿狀態(tài),在食用飼糧第7天后A組咽下腺小體十分飽滿,對照組咽下腺小體還不是十分飽滿。通過對咽下腺稱重和顏色、飽滿度的觀察,表明試驗組A的蜜蜂在第7天時咽下腺基本發(fā)育成熟,試驗組A飼糧比對照組飼糧更有助于蜜蜂咽下腺的發(fā)育。
3.3.1 氨基酸代謝
本研究結果顯示,對照組和試驗組A鑒定出7種氨基酸差異顯著,其中4種氨基酸含量上升,3種氨基酸含量下降。試驗組A脯氨酸含量比對照組上升。白小瓊等[18]研究表明,脯氨酸在蜜蜂的生長發(fā)育中起重要作用,約占蜜蜂氨基酸總需求量的50%。試驗組A?;撬岷勘葘φ战M上升,通過進一步對代謝通路分析發(fā)現牛磺酸和亞?;撬嵘锖铣赏凡町悩O顯著。?;撬崾且环N含硫氨基酸,是重要的氨基酸,具有促進大腦發(fā)育、調節(jié)神經傳導和參與膽鹽代謝等功能[19],而且是蜂王漿中重要的氨基酸。牛磺酸含量上升表明試驗組A的飼糧更加有利于蜜蜂咽下腺的發(fā)育,可能是咽下腺發(fā)育成熟導致分泌蜂王漿所致。試驗組A賴磺酸含量比對照組下降,通過進一步對代謝通路分析發(fā)現賴氨酸降解通路出現差異。賴氨酸是蜜蜂體內的一種必需氨基酸,賴氨酸碳骨架分解后會形成乙酰-輔酶A(CoA),以調節(jié)體內的脂肪酸合成異常,為脂質的合成提供前體物質[20]。氨基酸代謝在蜜蜂生長發(fā)育、提高免疫力、脂肪代謝等方面起到重要作用。
3.3.2 維生素代謝
本試驗中維生素檢測出差異的有維生素B2、維生素B4和維生素B5,試驗組A比對照組含量均上升。維生素B2是自然界廣泛分布的維生素,它參與構成各種黃素酶的輔基,在生物氧化過程中作為遞氫體,與糖、蛋白質和脂肪代謝密切相關。蜂糧中含有豐富的維生素,試驗組A蜜蜂7 d內死亡數量最少,且壽命比對照組蜜蜂長。廖春華等[21]研究表明,維生素B2對中華蜜蜂工蜂的壽命有影響,工蜂的平均壽命隨著維生素B2添加量的升高而增加。維生素B2參與了蜜蜂體內的生物氧化,提高蜜蜂體內糖、蛋白質和脂肪的代謝能力,有利于蜜蜂個體的生長發(fā)育和延長蜜蜂個體的壽命。維生素B4在體內代謝中參與形成多種重要的中間物質,如ATP、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)等,是DNA和RNA的重要組成部分。維生素B5主要以CoA形式參與糖、脂、蛋白質代謝。雷春紅[22]研究表明,維生素B5可促進進蜜蜂的生長發(fā)育,增強機體抗氧化能力。
3.3.3 有毒物質代謝
差異代謝物中共鑒別指認出4種有毒代謝成分,分別是磷酸三乙酯、巴比妥酸、胡椒堿、野百合堿,這4種成分含量試驗組A比對照組均下降。磷酸三乙酯在高劑量下產生一種麻醉現象和顯著的肌肉松弛。胡椒堿屬中毒類物質,大鼠的經口半致死劑量514 mg/kg。野百合堿屬高毒類物質,大鼠的經口半致死劑量71 mg/kg。試驗組A的有毒代謝產物含量比對照組均下降,可能是導致試驗組A的蜜蜂壽命比對照組蜜蜂壽命長的原因,具體內部機理需要進一步研究。
3.3.4 能量代謝
試驗組A比對照組的肌苷含量上升。肌苷是機體內ATP、CoA、DNA和RNA的組成部分,參與機體的物質代謝和能量代謝。張鑫蕊等[23]研究表明,肌苷能提高肉雞體內ATP的水平,可轉化為多種核苷酸,參與蛋白質的合成并能提高各種酶的活性,刺激機體產生抗體。肌苷對蜜蜂的生長發(fā)育及代謝的影響目前還未見報道。
① 由蔗糖、蜂糧、蜂蜜按照6∶5∶1比例制成的人工飼糧,在模擬郵寄環(huán)境中可提高蜜蜂存活率和壽命,而且有利于蜜蜂咽下腺的發(fā)育,因此在郵寄環(huán)境中可代替常用的煉糖飼料。
② 采用LC-MS檢測飼喂試驗組A和對照組飼糧的7日齡工蜂,共篩選鑒定23種差異代謝物,主要包括脯氨酸、牛磺酸、賴磺酸、維生素B2、肌苷等,主要涉及?;撬岷蛠喤;撬嵘锖铣赏贰①嚢彼峤到馔?、能量代謝等通路。