司華哲 馮培祥 王 卓 南韋肖 金春愛 姜桂苗 趙付偉 李光玉 劉晗璐*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所，長春 130112；2.國家膠類中藥工程技術(shù)研究中心，東阿阿膠股份有限公司，東阿 252201)

我國的毛驢養(yǎng)殖歷史悠久，存欄量曾長期居于世界首位[1]。但隨著農(nóng)業(yè)機械化的程度不斷提高，毛驢役用價值的喪失導致其存欄量不斷下降，據(jù)國家統(tǒng)計局《2018年中國統(tǒng)計年鑒》顯示，從1998年到2016年，我國毛驢存欄量從955.8萬頭持續(xù)下降至259.3萬頭，以年均6.5%的速度在不斷萎縮。近年來，隨著全民保健意識的增強，毛驢的皮、肉和奶的商用化價值持續(xù)走高，供需矛盾進一步加劇[2]。對比傳統(tǒng)的養(yǎng)殖，規(guī)?；B(yǎng)殖可更好地滿足原料品質(zhì)的均一性，但同時也加大毛驢感染性或傳染性疾病的發(fā)生風險[3]。一個基于49個規(guī)模化驢場腹瀉病的調(diào)查顯示，驢駒腹瀉的發(fā)病率約為23.1%[4]，而幼齡驢駒免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，常規(guī)的抗生素治療對驢駒腹瀉治療效果甚微[5]。目前，微生態(tài)制劑作為一種潛在的抗生素替代品受到愈來愈多的飼料企業(yè)和養(yǎng)殖戶的關(guān)注，微生態(tài)制劑不僅可以提高動物的生長性能，且對維持動物腸道菌群平衡效果良好[6-7]。目前研究以豬、雞等單胃動物或牛、羊等反芻動物居多[8-10]，但在毛驢上的相關(guān)研究較少。我國已將地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)納入《中國飼料添加劑品種目錄(2013)》中，地衣芽孢桿菌可以分泌多種淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶，這些酶可將宿主自身難以消化的飼料成分分解，再次被宿主吸收利用，提高動物飼糧利用率[11-12]。地衣芽孢桿菌在豬、家禽及水產(chǎn)動物的養(yǎng)殖上已廣泛應(yīng)用。李寧等[13]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加0.15%的地衣芽孢桿菌可提高仔豬的抗氧化能力、免疫力和生長性能。袁慧坤[14]在北京鴨上同樣發(fā)現(xiàn)飼糧添加1×106CFU/g地衣芽孢桿菌可有效改善北京鴨的生長性能和免疫指標。楊帆[15]和李曉斌[16]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加1×109CFU/g枯草芽孢桿菌可顯著提高馬駒的體增重。因此，本試驗旨在研究飼糧添加地衣芽孢桿菌對黑毛驢生長性能、血清生化指標及直腸菌群多樣性的影響，以期為地衣芽孢桿菌在驢駒生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗菌種

試驗用地衣芽孢桿菌是本實驗室前期從健康成年驢盲腸中分離鑒定保藏的。經(jīng)凍干后，復蘇并使用MRS培養(yǎng)基計數(shù)，按1×109CFU/g添加量(參考楊帆[15]和李曉斌[16]在馬駒上的試驗結(jié)果)逐級稀釋到精料補充料中。

1.2 試驗設(shè)計及飼養(yǎng)管理

選取4～7月齡體況良好的雌性驢駒10頭，平均體重(111.80±15.69)kg，隨機分為2組，每組5個重復，每個重復1頭。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗組在基礎(chǔ)飼糧中添加1×109CFU/g地衣芽孢桿菌。預試期7 d，正試期60 d。

本研究動物飼養(yǎng)試驗于2018年10月10日至2018年12月10日山東省聊城市東阿縣黑毛驢繁育中心進行。每頭每天10：00和16：30各飼喂1次，先精后粗，精料補充料添加量固定為初始體重的1.3%，粗飼料自由采食，自由飲水。精料補充料組成及營養(yǎng)水平見表1。粗飼料為豆秸，其營養(yǎng)水平為：粗蛋白質(zhì)(CP)8.75%，粗脂肪(EE)1.17%，有機物(OM)90.03%，中性洗滌纖維(NDF)72.75%，酸性洗滌纖維(ADF)54.63%，鈣(Ca)1.26%，磷(P)0.17%，消化能7.61 MJ/kg[消化能計算參照NRC(2007)[17]馬營養(yǎng)需要]。

表1 精料補充料組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))

1.3 樣品采集

試驗第45天，晨飼前麻醉動物，頸靜脈采血10 mL，3 500×g、4 ℃離心10 min，收集血清，-20 ℃保存，用于后續(xù)血清相關(guān)指標的測定。試驗第50天，通過直腸采集內(nèi)容物5 g用于微生物總DNA的提取。試驗樣品的檢測在吉林省長春市中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所進行

1.4 指標的測定及方法

1.4.1 生長性能的測定

試驗第1、15、30、45、60天晨飼前稱量動物體重，計算平均日增重(average daily gain，ADG)和總增重(total weight gain，TWG)。每隔3 d對每頭驢精飼料補充料和粗飼料的投食量和剩食量進行記錄，用于精確計算試驗期間每頭驢的干物質(zhì)采食量(dry matter intake，DMI)和料重比(feed/gain，F(xiàn)/G)。

1.4.2 飼糧營養(yǎng)成分測定

飼糧的干物質(zhì)(DM)含量采用GB/T 6435—2014方法測定；粗蛋白質(zhì)含量參照GB/T 6432—2018采用凱氏定氮法測定；粗脂肪含量參照GB/T 6433—2006采用索氏抽提法測定；中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量參照GB/T 20806—2006采用范氏(Van Soest)纖維分析法測定；鈣含量參照GB/T 6436—2018采用乙二胺四乙酸(EDTA)絡(luò)合滴定法測定；磷含量參照GB/T 6437—2018采用釩鉬酸銨比色法測定。

血清甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、葡萄糖(glucose，GLU)、尿素(urea，UREA)、總蛋白(total proteins，TP)、白蛋白(albumin，ALB)含量及丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspertate aminotransferase，AST)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性均使用Beckman AU 480全自動生化分析儀測定，試劑盒采購于中生北控生物科技有限公司。球蛋白(globulin，GLOB)含量采用TP與ALB含量的差值表示。血清免疫球蛋白A(immunoglobulin A，IgA)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)和免疫球蛋白M(immunoglobulin M，IgM)含量均使用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)測定。

1.4.4 微生物總DNA的提取

直腸內(nèi)容物使用Fast DNA spin kit for feces試劑盒[安諾倫(北京)生物科技有限公司]進行微生物總DNA提取。提取后的DNA送到北京諾禾致源公司使用MiSeq測序平臺對細菌基因組的16S rRNA V3～V4區(qū)進行測序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)使用Excel 2013整理后采用SPSS 22.0軟件中獨立樣本t檢驗(independent-samplesttest)進行均值的差異性檢驗，以P<0.05為差異顯著。微生物測序結(jié)果通過Flash v1.3.0軟件融合雙末端序列。采用Prinseq-lite 0.19.5軟件截掉質(zhì)量低的數(shù)據(jù)，按照97%相似性將序列聚類操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)。OTU聚類采用的軟件為Uclust v1.1.579，采用RDP classifier軟件進行物種分類。使用QIIME 1.9.0軟件對菌群進行α多樣性分析、主坐標分析(PCoA)和Adonis分析[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧添加地衣芽孢桿菌對黑毛驢生長性能影響

如表2所示，對照組和試驗組第15、30、45和60天體重均無顯著差異(P>0.05)，對照組和試驗組的總增重、平均日增重、干物質(zhì)采食量和料重比也無顯著差異(P>0.05)。

表2 飼糧添加地衣芽孢桿菌對黑毛驢生長性能影響

2.2 飼糧添加地衣芽孢桿菌對黑毛驢血清生化指標的影響

如表3所示，對照組的血清ALB含量顯著高于試驗組(P<0.05)，對照組和試驗組的血清TP和GLOB含量無顯著差異(P>0.05)。對照組和試驗組的肝功相關(guān)指標(血清ALP、ALT、AST、LDH活性)和脂肪代謝相關(guān)指標(血清TG、HDL-C、LDL-C、TC含量)均無顯著差異(P>0.05)。試驗組的血清GLU和UREA含量較對照組有所降低，但無顯著差異(P>0.05)。試驗組的血清IgG含量顯著高于對照組(P<0.05)，對照組和試驗組的血清IgA和IgM含量無顯著差異(P>0.05)。

表3 飼糧添加地衣芽孢桿菌對黑毛驢血清生化指標影響

2.3 飼糧添加地衣芽孢桿菌對黑毛驢直腸菌群多樣性的影響

如表4所示，對照組和試驗組的覆蓋度指數(shù)均高于0.995，說明測序深度足夠，結(jié)果可呈現(xiàn)99.5%以上的菌群組成。試驗組的香農(nóng)(Shannon)和辛普森(Simpson)指數(shù)均高于對照組，但差異不顯著(P>0.05)。對照組的Chao1和ACE指數(shù)均高于試驗組，但差異不顯著(P>0.05)。這表明飼糧添加地衣芽孢桿菌對黑毛驢直腸內(nèi)容物菌群α多樣性無顯著影響。

表4 飼糧添加地衣芽孢桿菌對黑毛驢直腸內(nèi)容物菌群α多樣性的影響

飼糧添加地衣芽孢桿菌對黑毛驢直腸微生物組成門水平相對豐度的影響如圖1所示，2組中相對豐度較高的前3種細菌門分別為厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門。其中，試驗組的擬桿菌門和螺旋體門相對豐度明顯高于對照組，而對照組中2個重復的變形菌門相對豐度高達36.46%～48.45%，這表明飼糧添加地衣芽孢桿菌會提高黑毛驢的擬桿菌門和螺旋體門相對豐度，可能會抑制變形菌門相對豐度。

Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅰ3、Ⅰ4、Ⅰ5為對照組的5個重復，Ⅱ1、Ⅱ2、Ⅱ3、Ⅱ4、Ⅱ5為試驗組的5個重復。圖2同。

飼糧添加地衣芽孢桿菌對黑毛驢直腸微生物組成屬水平相對豐度的影響如圖2所示，對照組中的變形菌門相對豐度較高的2個重復，其不動桿菌屬相對豐度亦較高，達34.35%～48.12%。2組中其他相對豐度較高的細菌分別為土壤芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、未鑒定梭菌目、未鑒定瘤胃球菌科。

圖2 屬水平相對豐度

如圖3所示，PCoA顯示，2個坐標軸相加已解釋77.75%的變量組成。結(jié)合圖中所示和Adonis分析結(jié)果(P=0.078)，均表明飼糧添加地衣芽孢桿菌對黑毛驢直腸內(nèi)容物細菌組成無顯著影響。

圖3 主坐標分析圖

3 討 論

本試驗中，飼糧添加1×109CFU/g地衣芽孢桿菌對黑毛驢生長性能并無顯著影響，這與楊帆[15]、李曉斌[16]在馬駒上的研究結(jié)果并不一致，原因可能是本試驗養(yǎng)殖試驗處于冬季，黑毛驢飼養(yǎng)于室外，溫度較低。研究發(fā)現(xiàn)，冷應(yīng)激會導致動物營養(yǎng)物質(zhì)消化率的降低[19]，且低溫環(huán)境下動物采食的飼糧優(yōu)先用于產(chǎn)熱維持體溫，這對動物的生長性能影響較大[20]。綜合前人和本試驗研究結(jié)果，低溫環(huán)境飼養(yǎng)下的黑毛驢，益生菌的添加水平需要增高，才可獲得與常溫條件相似的促生長性能，但這一推測仍需進一步的試驗驗證。

本試驗中，試驗組的血清IgG含量顯著高于對照組，這與郭軍蕊[21]、Elzey等[22]在其他動物上的試驗結(jié)果一致。IgG約占血清免疫球蛋白總含量的75%，是機體最主要的抗感染球蛋白，其含量可以表示免疫功能的強弱[14]，這一指標的升高可為地衣芽孢桿菌對驢駒腹瀉的預防起到重要作用。

已有大量研究證明添加益生菌可以改善動物腸道菌群組成及促進腸道健康[23-25]。本試驗中，黑毛驢直腸內(nèi)容物門水平下優(yōu)勢細菌組成與Liu等[26]在驢糞便中的研究結(jié)果類似。但Liu等[26]研究發(fā)現(xiàn)，細菌屬水平上優(yōu)勢微生物分別是艾克曼菌屬、Sporobacter和密螺旋體屬，這與本試驗結(jié)果并不一致。原因可能是Liu等[26]試驗采集的是排出的糞便，與本試驗直腸采集的內(nèi)容物環(huán)境有一定差異，此外，動物的飼糧和養(yǎng)殖環(huán)境均會對直腸微生物組成造成影響[27]。本試驗中，優(yōu)勢的微生物菌屬有土壤芽孢桿菌和鏈球菌屬，這些細菌都被大量的發(fā)現(xiàn)于土壤與環(huán)境中[28]，直腸位于消化道末端，這為外界細菌在直腸內(nèi)的定植帶來了機會[29]。對照組2個重復的直腸內(nèi)不動桿菌屬相對豐度較高，且不動桿菌屬可引起動物胃腸炎的發(fā)生[30]，試驗組并未發(fā)現(xiàn)這樣的個體，這也從側(cè)面證明了地衣芽孢桿菌可在一定程度上維持腸道穩(wěn)態(tài)。對照組動物直腸微生物組成中，鏈球菌屬和不動桿菌屬相對豐度較高，這類條件致病菌的存在提示我們，驢駒的規(guī)?；曫B(yǎng)所面臨的腹瀉疾病與動物腸道健康息息相關(guān)。飼糧添加地衣芽孢桿菌提高了擬桿菌門相對豐度，擬桿菌門的細菌主要對類固醇、膽汁酸及多糖起代謝作用，從而促進多糖的吸收以及蛋白質(zhì)的合成[31]。飼糧添加地衣芽孢桿菌并未顯著改變黑毛驢直腸微生物組成，Zhou等[32]和Wang等[33]在獺兔上研究均發(fā)現(xiàn)，益生菌的添加對其小腸菌群結(jié)構(gòu)組成的影響效果優(yōu)于大腸。這可能與單胃草食類動物發(fā)達的盲腸和結(jié)腸結(jié)構(gòu)與豐富的微生物組成有關(guān)。

4 結(jié) 論

飼糧添加地衣芽孢桿菌并未顯著提高黑毛驢的生長性能和顯著影響黑毛驢直腸細菌組成，但提高了黑毛驢血清IgG的含量，同時降低其直腸內(nèi)容物中不動桿菌屬相對豐度，對動物的腸道健康有積極作用。