王可鑫 左麗君 陳 想 姜 寧 潘春媛 李凌巖 張愛忠

(黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江省寒區(qū)飼料資源高效利用與營養(yǎng)調控重點實驗室，大慶 163319)

近年來，舍飼養(yǎng)羊逐步走向現(xiàn)代集約化的道路。在現(xiàn)代化養(yǎng)羊生產中，由于早期斷奶、飼養(yǎng)環(huán)境及疾病等原因，羔羊易受細菌、病毒等病原體及脂多糖(LPS)等非病原體的侵襲，激發(fā)羔羊產生免疫應激導致腸黏膜形態(tài)結構發(fā)生改變、腸道黏膜屏障功能受到破壞，從而引起消化功能紊亂、生長遲滯、腹瀉等問題，給動物生產帶來重大經(jīng)濟損失[1-2]。添加飼用抗生素及改善畜舍環(huán)境等方法成為緩解免疫應激的主要措施。全球約73%的抗生素是用于動物疾病的預防和治療，但長期飼喂抗生素易引發(fā)細菌耐藥性且抗生素濫用會損傷機體胃腸道屏障功能，破壞菌群結構，導致腸道穩(wěn)態(tài)失衡[3]。

腸道健康發(fā)育是保障動物生長及發(fā)揮潛在生產性能的關鍵。腸道微生物在機體營養(yǎng)物質消化和腸道健康方面扮演著十分重要的角色。腸道微生物代謝產物短鏈脂肪酸主要包括乙酸、丙酸和丁酸。丁酸鈉(SB)在動物胃腸道內水解形成丁酸，不僅是宿主腸上皮細胞的首選能量代謝原料和細胞增殖分化的主要調控因子，而且還具有抗炎、抗腫瘤、調控基因表達、調節(jié)腸道菌群平衡、改善腸道功能等重要作用；在臨床上，丁酸也被認為是治療腸炎的潛在治療藥物[4-5]。據(jù)報道，在飼糧中添加包膜丁酸鈉(CSB)不僅可以提高反芻動物的生長性能[6],還可以促進腸道發(fā)育并改善腸道菌群的豐度[7]。有研究表明，CSB的添加可降低哺乳犢牛腹瀉，縮短斷奶持續(xù)時長[8]。Chang等[9]在飼糧中添加SB可以降低反芻動物體內LPS和促炎性細胞因子的含量，并減弱細胞凋亡途徑的活化，從而阻止乳腺細胞凋亡和維持乳腺健康。Górka等[10]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中外源SB的添加不僅會影響瘤胃的水解活性，而且對綿羊小腸發(fā)育也有積極影響。但是在免疫應激狀態(tài)下，CSB對羔羊腸道健康的影響還鮮見報道。因此，本研究擬從營養(yǎng)與免疫相結合的角度，探討CSB對LPS應激羔羊腸道免疫及組織形態(tài)的影響，為CSB緩解幼齡反芻動物細菌性疾病感染、維持羔羊腸道穩(wěn)態(tài)、減少或杜絕飼用抗生素的添加提供數(shù)據(jù)支持，為其緩解羔羊免疫應激提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用CSB中的SB含量為30%，由某進出口有限公司提供；055∶B5型大腸桿菌LPS(L2880)購自美國Sigma Chemical公司。

1.2 試驗設計

本試驗在黑龍江八一農墾大學動物科技學院動物試驗中心進行。試驗選用(42±1)日齡、平均體重為(11.79±0.54)kg的“德國美利奴×杜泊”斷奶公羔羊24只，按體重相近原則隨機分為4組：空白組(CON組)、LPS組、CSB2L組、CSB3L組，CON和LPS組飼喂基礎飼糧，CSB2L和CSB3L組在基礎飼糧中分別添加2和3 g/kg CSB，每組6個重復，每個重復1只羊。CON組在屠宰前3 h腹腔注射無菌生理鹽水，其余各組腹腔注射100 μg/kg BW 055∶B5型LPS。預試期7 d，正試期28 d。試驗期間于每日07:00和17:00飼喂等量的飼糧，羔羊自由飲水和采食。試驗第28天，從每組中選取3只羔羊進行屠宰。

1.3 試驗飼糧

為滿足斷奶羔羊的營養(yǎng)需要，按照《肉羊飼養(yǎng)標準》(NY/T 816—2004)配制不含抗生素的基礎飼糧，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

1.4 樣品采集

于試驗第28天，在羔羊屠宰前進行頸靜脈采血，室溫下3 000 r/min離心10 min，-80 ℃保存待測。沿腹部中線快速切開腹腔，用棉線結扎斷奶羔羊小腸和大腸交界處。取小腸組織中段，立即用冰磷酸鹽緩沖液沖洗3次。將腸道組織保存在4%多聚甲醛中，用于腸道組織形態(tài)分析。

1.5 指標測定及方法

1.5.1 生長性能

每天準確稱量羔羊的投喂量和剩料量，于試驗第28天對羔羊進行空腹稱重(LPS刺激前)，計算平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。計算公式為：

ADG=(末重-始重)/試驗天數(shù)；ADFI=總采食量/試驗天數(shù)；F/G=ADFI/ADG。

1.5.2 血清促炎性細胞因子

用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒測定血清中炎性細胞因子——腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-8(IL-8)和白細胞介素-10(IL-10)的含量，試劑盒由艾萊薩生物科技有限公司提供。用iMark酶標儀(Bio-Rad，美國)檢測在450 nm處的吸光度。

1.5.3 腸道通透性

按生產廠家提供的方法，用商品試劑盒(艾萊薩生物科技有限公司)測定血清中D-乳酸(DLA)含量和二胺氧化酶(DAO)活性。

1.5.4 腸道組織形態(tài)

為了確定腸道組織形態(tài)，將組織樣品脫水并用石蠟包埋，然后切成6 μm厚度，并用蘇木精和曙紅染色。使用光學顯微鏡系統(tǒng)(Olympus Corporation，日本)觀察組織切片。用ImagePro plus 6.0測定腸絨毛高度(絨毛頂端至絨毛與隱窩交界處)和隱窩深度(腸絨毛交界處至腸腺底部的垂直距離)，并計算絨毛高度/隱窩深度。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用SAS 9.2軟件的GLM程序進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Duncan氏法進行多重比較。試驗結果均以平均值±標準誤表示，P<0.05為差異顯著。

2 結 果

2.1 CSB對斷奶羔羊生長性能的影響

由表2可知，與CON組相比，飼糧中添加CSB可顯著提高斷奶羔羊的ADFI(P<0.05)，CSB3L組ADG顯著高于CON和LPS組(P<0.05)，CSB2L組ADG與其他各組無顯著差異(P>0.05)。各組間的F/G差異不顯著(P>0.05)。

表2 CSB對斷奶羔羊生長性能的影響

2.2 CSB對LPS刺激下斷奶羔羊血清炎性細胞因子含量的影響

由圖1可知，斷奶羔羊經(jīng)LPS刺激后，血清中TNF-α、IL-1β和IL-8含量顯著升高(P<0.05)。CSB2L和CSB3L組血清TNF-α和IL-1β含量均低于LPS組(P<0.05)，血清TNF-α含量顯著高于CON組(P<0.05)。CSB3L組血清IL-8含量顯著低于LPS組(P<0.05)，CSB2L組血清IL-8含量與各組差異均不顯著(P>0.05)。與CON組相比，LPS組血清中IL-10含量無顯著差異(P>0.05)，CSB2L和CSB3L組血清IL-10含量顯著高于LPS組(P<0.05)。CSB2L和CSB3L組間血清炎性因子含量無顯著差異(P>0.05)。

數(shù)據(jù)柱形標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2同。

2.3 CSB對LPS刺激下斷奶羔羊腸道通透性的影響

由圖2可知，斷奶羔羊血清中DLA含量和DAO活性在LPS刺激下顯著升高(P<0.05)。飼糧中添加2和3 g/kg CSB可顯著降低LPS注射后斷奶羔羊血清DLA含量和DAO活性(P<0.05)。CSB2L和CSB3L組間斷奶羔羊血清DLA含量和DAO活性差異不顯著(P>0.05)。

圖2 CSB對LPS刺激下斷奶羔羊腸道通透性的影響

2.4 CSB對LPS刺激下斷奶羔羊腸道組織形態(tài)的影響

染色觀察各組斷奶羔羊小腸組織形態(tài)(圖3)，CON組腸黏膜形態(tài)結構完整且絨毛排列整齊；注射LPS后，十二指腸有輕微水腫，空腸和回腸絨毛排列紊亂，高矮不一，絨毛呈現(xiàn)出變短且略微腫脹、脫落現(xiàn)象；CSB2L和CSB3L組空腸和回腸絨毛形態(tài)較完整且排列整齊，腫脹程度降低，上皮輕度脫落。

圖3 斷奶羔羊小腸組織形態(tài)

盲腸和結腸形態(tài)如圖4所示，CON組腸組織整體結構正常，腸絨毛排列較整齊。LPS組盲腸部分腸絨毛上皮脫落，腺體排列紊亂，結腸絨毛略微脫落。CSB2L組盲腸和結腸有輕微水腫，CSB3L組盲腸和結腸絨毛上皮未見明顯脫落和水腫。

圖4 斷奶羔羊盲腸和結腸組織形態(tài)

由表3可知，與CON組相比，LPS刺激顯著降低了空腸和回腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度(P<0.05)，對十二指腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度無顯著影響(P>0.05)，且對小腸各腸段隱窩深度均無顯著影響(P>0.05)。與CON組相比，飼糧中添加CSB后，空腸和回腸絨毛高度降低和絨毛高度/隱窩深度降低均得到緩解(P<0.05)。CSB2L和CSB3L組十二指腸絨毛高度顯著高于CON組和LPS組(P<0.05)，CSB3L組回腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度顯著高于CON組(P<0.05)，而CSB2L組回腸絨毛高度、隱窩深度和絨毛高度/隱窩深度與CON組均無顯著差異(P>0.05)。

表3 CSB對LPS刺激下斷奶羔羊腸道組織形態(tài)的影響

3 討 論

SB作為一種飼料添加劑在動物飼糧中廣泛應用。熊海濤[11]研究發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加2 g/kg的SB可以提高仔豬的ADG和ADFI。邴新帥等[6]研究也證實，在飼糧中添加0.5%的CSB可以顯著提高羔羊的ADG。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加CSB可顯著提高羔羊的ADFI，且添加3 g/kg的CSB可顯著提高羔羊的ADG，但對F/G無顯著影響，這與上述結果基本一致。SB有一種脂臭味，而CSB可以掩蓋這種異味并促進動物采食量的增加，進而促進羔羊的生長發(fā)育。在轉錄組學水平上研究發(fā)現(xiàn)，丁酸可以促進綿羊小腸葡萄糖攝取和糖酵解途徑上調以及線粒體功能相關基因的表達[12]。丁酸可以促進營養(yǎng)物質在腸道的吸收，進而促進腸道營養(yǎng)物質代謝相關基因的表達，使羔羊的生長性能得到提高。

在本試驗中，LPS注射后，斷奶羔羊表現(xiàn)出精神沉郁、站立不穩(wěn)、腹腔內腹水等情況。LPS是位于革蘭氏陰性菌細胞壁最外層的類脂多糖，可直接或間接誘導細胞凋亡調控機體免疫反應，當機體受到LPS等微生物抗原的刺激時會刺激體內巨噬細胞、單核細胞和內皮細胞釋放一系列細胞因子、氧自由基和組胺等炎性介質等引起炎癥反應，降低屏障功能[13-14]。經(jīng)典的LPS細胞因子級聯(lián)系統(tǒng)包括IL-1β和TNF-α等，TNF-α能夠激活中性粒細胞和淋巴細胞，是炎癥反應過程中出現(xiàn)最早、最重要的炎性介質，參與核轉錄因子-κB(NF-κB)的活化和程序性細胞凋亡過程，且與誘導型一氧化氮合成酶的上調有關，可促進一氧化氮的生成，在機體的免疫應答過程中發(fā)揮重要的作用[15-16]。IL-1β可由單核細胞和巨噬細胞釋放，在炎癥反應過程中IL-1β最初以前體形式產生，響應Toll樣受體配體，并通過炎性小體成熟進而調控炎癥[17]。IL-8是一種多細胞來源的細胞因子，在細胞的多種炎癥反應中起調節(jié)作用[18]。IL-10是由巨噬細胞分泌的一種抗炎細胞因子，能夠通過阻止NF-κB的活化來抑制其他炎性細胞因子的產生[19]。眾多研究表明，SB能夠緩解炎癥反應。Zhang等[20]研究表明，LPS應激可顯著升高肉雞血清IL-1β、IL-6和TNF-α含量，飼糧中補充SB可抑制血清中IL-6和TNF-α含量的升高。飼糧中補充SB可顯著降低葡聚糖硫酸鈉模型肉雞血清中IL-1β含量，升高IL-10含量[21]。有研究表明，大腸桿菌攻毒能夠顯著升高仔豬血清中促炎性細胞因子的水平，飼喂SB可以緩解這一現(xiàn)象[11]。SB能夠抑制LPS誘導的炎癥反應引起的促炎性細胞因子含量的升高[22-23]。本試驗結果顯示，LPS刺激能使斷奶羔羊血清中促炎性細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-8含量上升，CSB2L和CSB3L組能抑制血清TNF-α、IL-1β和IL-8含量上升，促進IL-10含量升高。這表明飼糧中添加CSB可緩解LPS激發(fā)斷奶羔羊產生的炎癥反應。原因可能是CSB水解的丁酸可以通過抑制LPS誘導的NF-κB通路的活性，進而抑制促炎性細胞因子的釋放緩解炎癥反應。

保持腸道的完整性和功能性是維持腸道發(fā)揮正常屏障功能的前提，小腸受到損傷會引起腸上皮細胞數(shù)量下降，腸道通透性增加。DLA主要是乳酸桿菌、大腸桿菌等腸道細菌的代謝和裂解產物。由于哺乳動物體內不具有直接分解DLA的D-乳酸脫氫酶，當機體發(fā)生嚴重創(chuàng)傷、感染后引起腸黏膜缺血缺氧時，DLA可在腸黏膜受損早期透過腸黏膜進入血門靜脈循環(huán)，引起DLA含量上升[24-25]。DAO是一種含有脫氨的腐胺和組胺的有較高活性細胞內酶，大約有95%存在于哺乳動物小腸黏膜和柱狀上皮細胞中，其活性與腸絨毛高度和黏膜細胞內核酸蛋白的合成有關，當腸黏膜屏障受損時，其進入血液和淋巴導致其在血液中的活性升高[26-28]。因此，檢測外周血中DLA含量和DAO活性可反映腸黏膜損傷、修復和通透性變化情況。有研究表明，適當濃度的丁酸鹽能夠保護單層細胞不被破壞，改善腸屏障的功能[29]。Zou等[21]研究發(fā)現(xiàn)，補充300 mg/kg SB可顯著降低葡聚糖硫酸鈉模型肉雞血清中DLA含量。本試驗結果顯示，LPS刺激可以使斷奶羔羊血清DLA含量和DAO活性上升，說明LPS刺激破壞了腸道屏障，但飼糧中添加CSB可以緩解腸道通透性的升高。這可能是由于SB可以通過促進小腸黏膜緊密連接蛋白的表達，抑制炎性細胞因子的表達，從而降低對腸道黏膜屏障的損傷。此外，有研究表明，SB可以通過與細胞表面的G蛋白偶聯(lián)受體結合激活調控免疫反應的信號轉導途徑維護腸道屏障功能[30]。本研究表明，CSB能夠降低LPS誘導的斷奶羔羊血清TNF-α和IL-1β的釋放，并進一步驗證了其可對腸道通透性的改變產生積極影響，然后通過染色從病理形態(tài)學角度探討了CSB對腸道形態(tài)的改善作用。

有研究表明，在飼糧中添加CSB可降低壞死性結腸炎模型組肉雞腸道病變評分，能夠減輕肉雞壞死性腸炎[31]。Dou等[32]研究發(fā)現(xiàn)，口服丁酸鈉可減輕小鼠結腸炎的嚴重程度。在本試驗中，通過組織切片觀察可知LPS組回腸和盲腸絨毛脫落、水腫且伴有炎性細胞浸潤增加(如圖3黑色箭頭所示)。而CSB2L和CSB3L組腸絨毛損傷較輕，說明CSB能夠減輕LPS對腸黏膜的刺激，對腸絨毛的完整性起到一定的保護作用，使斷奶羔羊在應激情況下能夠緩解腸黏膜損傷。但是，從切片來看LPS刺激對回腸損傷更為嚴重，盲腸和結腸損傷較小。可能是由于LPS刺激時間較短或劑量較小。也可能是由于后腸道含有大量微生物，具有更有效的殺滅移位細菌的能力。此外，與小腸相比，結腸具有更高的電阻，對離子被動運動的滲透性較低[33]。先前有研究表明，一氧化氮合酶的基因表達沿著腸的縱軸存在差異性調節(jié)，其中在回腸中最為突出[34]。有報道表明，回腸對LPS更敏感，回腸細菌移位發(fā)病的閾值比結腸低[35-36]。

小腸的絨毛高度、隱窩深度及絨毛高度/隱窩深度是評價動物消化道對養(yǎng)分消化吸收的重要指標。腸絨毛高度越大表明腸上皮細胞發(fā)育越好，絨毛高度影響?zhàn)B分吸收能力的強弱，相反，隱窩深度越淺表明腸上皮細胞成熟率越高。絨毛高度/隱窩深度降低表明吸收功能受到損傷，進而導致腹瀉的可能性增加[37]。徐磊[38]研究發(fā)現(xiàn)，內源性LPS的產生可導致奶牛瘤胃和盲腸出現(xiàn)炎性損傷，上皮完整性遭到破壞。此外，有研究發(fā)現(xiàn)LPS刺激會引起腸道損傷，導致小腸絨毛高度下降，隱窩深度變大，二者比值下降[39-41]。短鏈脂肪酸已被證明可以為腸上皮細胞提供最直接、最有效的能量物質，促進腸上皮細胞分化和增殖，有效維持腸道形態(tài)。邴新帥[6]研究表明，飼糧中添加0.5%的CSB可以提高斷奶羔羊小腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度。Wang等[42]研究表明，飼喂SB提高了斷奶仔豬的空腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度。本試驗結果表明，飼喂CSB能夠抑制LPS刺激引起的小腸絨毛高度及絨毛高度/隱窩深度的降低，與上述報道結果相一致。因此，SB對腸黏膜的免疫屏障的保護作用對于減少機體炎癥反應的發(fā)生、維護機體免疫平衡起著重要的作用，可能原因如下：1)CSB在腸道內水解成丁酸，不僅可以為腸上皮細胞提供能量促進腸上皮細胞的增殖分化，而且作為營養(yǎng)活性物質可以促進腸上皮組織中生長因子的表達，促進小腸的成熟速度及腸上皮對營養(yǎng)物質的吸收。2)有研究表明，腸道內短鏈脂肪酸含量升高可下調消化道上皮中胰島素結合蛋白3的基因表達，進而促進胰島素樣生長因子1的表達量增加，可促進腸上皮細胞的生長[43]。3)SB能夠使細胞線粒體免受LPS刺激引起氧化應激造成的損傷，進而抑制腸上皮細胞凋亡速率，進而維護腸黏膜的完整性。4)丁酸抑制LPS與Toll樣受體結合，抑制炎性細胞因子產生。炎性細胞因子的釋放減少會導致小腸絨毛脫落和屏障功能受損程度降低[44]。此外，我們還需要進一步對腸道基因及腸道微生物的表達情況進行研究，以探討其機制。

4 結 論

飼糧中添加3 g/kg的CSB可顯著提高羔羊的ADG。添加2種劑量的CSB均可抑制LPS刺激引起的血清促炎性細胞因子含量的升高，改變腸道通透性，并在一定程度上改善腸道組織形態(tài)，減少腸道損傷，緩解應激并改善腸道健康。綜合來看，2和3 g/kg的CSB對LPS刺激下羔羊的影響基本一致。