盧盛勇 陳勝昌 張?zhí)咸?陸小蘿 李景上 李海霞

(貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025)

2020年7月1日起，我國開始在飼料中禁用抗生素，但飼用抗生素的禁用會降低動物的生長性能，使發(fā)病率上升，導(dǎo)致養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益降低。因此，急需開發(fā)飼料微生態(tài)制劑、天然植物提取物等安全飼料添加劑，以保障畜牧業(yè)的生產(chǎn)性能、減少養(yǎng)殖損失[1-2]。酸湯制作技術(shù)含量低，來源廣泛，價格低廉，其含有酵母菌、乳酸菌和醋酸菌等有益菌群及豐富的營養(yǎng)成分，具有吸收快、無殘留、無污染等特點，對調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡、預(yù)防消化道疾病和促進(jìn)機(jī)體健康有著不可忽視的作用[3-4]。鑒于目前有關(guān)于酸湯對斷奶仔豬生長性能等方面影響的研究較少，本試驗擬在飼糧中添加酸湯，研究其對斷奶仔豬生長性能、免疫性能、抗氧化性能及腸道微生物區(qū)系的影響，旨在為酸湯在斷奶仔豬生產(chǎn)中的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與設(shè)計

試驗選用31日齡、體重[(5.34±0.86)kg]相近、健康的復(fù)興豬斷奶仔豬45頭，隨機(jī)分為5組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)3頭。試驗Ⅰ組為對照組，飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組分別在基礎(chǔ)飼糧的基礎(chǔ)上添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的酸湯，進(jìn)行為期47 d的飼養(yǎng)試驗，其中預(yù)試期7 d，正試期40 d。

1.2 基礎(chǔ)飼糧與酸湯

基礎(chǔ)飼糧參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 65—2004配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。酸湯的制作方法：采用傳統(tǒng)制作豆腐所產(chǎn)生的液體部分，待其冷卻發(fā)酵變酸后，再將酸豆腐漿與已處理好的蘿卜菜(將蘿卜菜洗凈、切段，煮5 min撈出，并用自來水沖洗使其冷卻)共同放入密閉的罐子中，100 L豆腐漿放5 kg蘿卜菜，室溫發(fā)酵3 d，所測pH為4.0左右。對本試驗所使用的酸湯進(jìn)行高通量測序發(fā)現(xiàn)，酸湯中細(xì)菌種類較為豐富，其中隸屬于厚壁菌門的乳桿菌屬(Lactobacillus)在屬水平上占絕對優(yōu)勢。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3 樣品采集與測定

1.3.1 生長性能與腹瀉率

試驗期間每日記錄斷奶仔豬的采食量，分別于第1、20、40天08：00空腹稱重，計算平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。試驗期間每日記錄豬的腹瀉情況，計算腹瀉率。

ADFI(g/d)=總耗料量/試驗天數(shù)；ADG(g/d)=總增重/試驗天數(shù)；F/G= ADFI/ADG；腹瀉率(%)=[腹瀉頭數(shù)/(每組豬頭數(shù)×試驗天數(shù))]×100。

1.3.2 血清免疫指標(biāo)和抗氧化指標(biāo)

試驗結(jié)束當(dāng)天(正試期第40天)08:00，每個重復(fù)選3頭接近平均體重的斷奶仔豬，空腹前腔靜脈采血5 mL，3 000 r/min離心15 min，分離血清，用于檢測免疫指標(biāo)和抗氧化指標(biāo)。血清免疫指標(biāo)包括免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)含量，血清抗氧化指標(biāo)包括谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性與丙二醛(MDA)含量。上述指標(biāo)測定所用試劑盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.3 小腸形態(tài)

試驗結(jié)束時，分別從試驗Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ組中各選3頭仔豬進(jìn)行屠宰并采集小腸各段(包括十二指腸、空腸及回腸)各3 cm左右，生理鹽水清洗后固定于10%中性甲醛溶液中，制作石蠟切片，蘇木精-伊紅(HE)染色以檢測腸道形態(tài)，測量小腸各段(十二指腸、空腸、回腸)的絨毛高度(VH)和隱窩深度(CD)，計算絨隱比(VH/CD)。

1.3.4 腸道微生物區(qū)系

試驗結(jié)束時，分別從試驗Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ組中選取3頭仔豬進(jìn)行屠宰，用事先滅菌的細(xì)線將盲腸兩端結(jié)扎，確保盲腸內(nèi)容物充足，剪下結(jié)扎的盲腸段，立刻轉(zhuǎn)入100 mL的無菌離心管中，置于-80 ℃冰箱保存，采用Illumina Miseq Regent V3 kit進(jìn)行測序。

1.3.5 生物信息分析

Miseq測序得到的PEreads首先根據(jù)barcode區(qū)分每個樣本，而后對序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾，再根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，拼接后的序列再次進(jìn)行質(zhì)控和過濾，最后得到優(yōu)化序列。將優(yōu)化序列進(jìn)行操作分類單元(OTU)聚類分析[5-6]和物種分類學(xué)分析，基于OTU聚類分析結(jié)果，對OTU進(jìn)行樣本內(nèi)的alpha多樣性分析和測序深度檢測。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

本試驗全部數(shù)據(jù)均采用Excel 2013進(jìn)行初步整理分析，應(yīng)用SAS 9.3軟件中的PROC GLM過程進(jìn)行統(tǒng)計分析。平均值的多重比較采用Duncan氏法進(jìn)行，差異顯著性水平定為P<0.05。試驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸湯對斷奶仔豬生長性能與腹瀉率的影響

由表2可知，試驗Ⅴ組的ADFI顯著高于試驗Ⅰ組(P<0.05)，其他組間ADFI差異不顯著(P>0.05)。試驗Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組的ADG顯著高于試驗Ⅰ組(P<0.05)，試驗Ⅴ組的ADG還顯著高于試驗Ⅱ、Ⅲ組(P<0.05)。各組的F/G差異不顯著(P>0.05)。試驗Ⅴ組的腹瀉率顯著低于試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ組(P<0.05)。

表2 酸湯對斷奶仔豬生長性能與腹瀉率的影響

2.2 酸湯對斷奶仔豬血清免疫指標(biāo)的影響

由表3可知，試驗Ⅴ組血清IgG含量顯著高于試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組(P<0.05)，試驗Ⅳ組血清IgG含量顯著高于試驗Ⅱ組(P<0.05)。各組間血清IgA、IgM含量差異不顯著(P>0.05)。

表3 酸湯對斷奶仔豬血清免疫指標(biāo)的影響

2.3 酸湯對斷奶仔豬血清抗氧化指標(biāo)的影響

由表4可知，試驗Ⅳ組血清GSH-Px活性最高，顯著高于其余各組(P<0.05)。試驗Ⅴ組血清SOD活性顯著高于試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組(P<0.05)；試驗Ⅳ組血清MDA含量顯著低于試驗Ⅰ、Ⅱ組(P<0.05)。

表4 酸湯對斷奶仔豬血清抗氧化指標(biāo)的影響

2.4 酸湯對斷奶仔豬小腸形態(tài)的影響

由表5可知，各組十二指腸絨毛高度差異不顯著(P>0.05)。試驗Ⅲ、Ⅴ組十二指腸、空腸和回腸隱窩深度與試驗Ⅰ組相比在整體上有降低趨勢，但差異不顯著(P>0.05)。相對于試驗Ⅰ組，試驗Ⅲ、Ⅴ組十二指腸和回腸絨隱比均有不同程度的增加，但差異不顯著(P>0.05)；試驗Ⅴ組空腸絨隱比顯著高于試驗Ⅰ組(P<0.05)。

表5 酸湯對斷奶仔豬小腸形態(tài)的影響

2.5 酸湯對斷奶仔豬腸道微生物區(qū)系的影響

2.5.1 alpha多樣性分析

由表6可知，各組的有效序列數(shù)均較高，在46 678～51 905；各組的覆蓋度(Coverage)也均在0.999以上，說明測序結(jié)果已基本覆蓋樣本的多樣性。試驗Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ組之間OTU數(shù)目差異不顯著(P>0.05)。試驗Ⅰ、Ⅲ組的Shannon指數(shù)顯著高于試驗Ⅴ組(P<0.05)；試驗Ⅴ組的Simpson指數(shù)最高，顯著高于試驗Ⅰ組(P<0.05)。Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)各組間差異不顯著(P>0.05)。

表6 alpha多樣性指數(shù)

2.5.2 稀釋曲線

采用對序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣的方法，以抽到的序列數(shù)與它們所能代表OTU數(shù)目構(gòu)建稀釋曲線，當(dāng)曲線趨向平坦時，說明測序數(shù)據(jù)量合理，更多的數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新的OTU，反之則表明繼續(xù)測序還可能產(chǎn)生較多新的OTU。從圖1可知，所有樣本的稀釋曲線趨向平坦，說明測序數(shù)據(jù)量已基本合理。

T1：試驗Ⅰ組 Trial group Ⅰ；T2：試驗Ⅲ組 Trial group Ⅲ；T3：試驗Ⅴ組 Trial group Ⅴ。下圖同 The same as below。

2.5.3 韋恩圖分析

韋恩圖可用于統(tǒng)計多個樣品中所獨有與共有的OTU數(shù)目，能夠比較直觀地表現(xiàn)樣品的OTU數(shù)目組成相似性及重疊情況。由圖2可知，3個組之間共有307個OTU，其中試驗Ⅰ組獨有3個OTU，試驗Ⅲ組獨有8個OTU，試驗Ⅴ組獨有19個OTU。

2.5.4 基于OTU的主成分分析(PCA)

通過分析不同樣品OTU(97%相似性)組成能夠反映樣品之間的差異和距離，PCA運用方差分解，將多組數(shù)據(jù)的差異反映在二維坐標(biāo)圖上，坐標(biāo)軸取能夠最大反映方差值的2個特征值。由圖3可知，試驗Ⅴ組相對試驗Ⅰ、Ⅲ組分散較遠(yuǎn)，相似性有較大差異。

圖3 PCA圖

2.5.5 仔豬腸道菌群結(jié)構(gòu)

由圖4可知，每個樣品中厚壁菌門(Firmicutes)都為其主要的門，相對豐度在63.48%～86.06%，其中以試驗Ⅴ組厚壁菌門的相對豐度最高。各組間擬桿菌門(Bacteroidetes)的相對豐度變化較大，在3.01%～30.80%，以試驗Ⅰ組的相對豐度最高，試驗Ⅴ組的相對豐度最低。試驗Ⅴ組變形菌門(Proteobacteria)的相對豐度最高，試驗Ⅰ、Ⅲ組變形菌門的相對豐度變化不大。

Firmicutes：厚壁菌門；Bacteroidetes；擬桿菌門；Proteobacteria；變形菌門；Tenericutes：無壁菌門；Actinobacteria：放線菌門；Spirochaetae：螺旋體門；Cyanobacteria：藍(lán)藻門；Fusobacteria：梭桿菌門；Unclassified：無法歸類。

由表7可知，在屬水平上，各組均以乳桿菌屬的相對豐度最高，其中試驗Ⅴ組乳桿菌屬的相對豐度顯著高于試驗Ⅰ、Ⅲ組(P<0.05)。試驗Ⅰ組普氏菌屬(Prevotella)的相對豐度顯著高于試驗Ⅲ、Ⅴ組(P<0.05)。試驗Ⅲ組瘤胃球菌屬(Ruminococcus)的相對豐度顯著高于試驗Ⅰ、Ⅴ組(P<0.05)。此外，試驗Ⅴ組糞桿菌屬(Faecalibacterium)的相對豐度顯著高于試驗Ⅰ、Ⅲ組(P<0.05)。各組埃希氏菌屬(Escherichia)、Leeia、Subdoligranulum、考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)的相對豐度差異不顯著(P>0.05)。

Others：其他；Turicibacter：蘇黎世桿菌屬；Solobacterium：單胞菌屬；Olsenella：歐陸森氏菌屬；Oscillospira：顫螺旋菌屬；Roseburia：羅斯氏菌屬；Actinicbacillus：放線桿菌屬；Streptococcus：鏈球菌屬；Corynebacterium：棒桿菌屬；Lachnospira：毛螺旋菌屬；Collinsella：柯林斯菌屬；Dorea：多爾氏菌屬；Anaerotruncus：厭氧棍狀菌屬；Blautia：布勞特氏菌屬；Ruminococcus：瘤胃球菌屬；Parabacteroides：副桿菌屬；Escherichia：埃希氏菌屬；Coprococcus：糞球菌屬；Faecalibacterium：糞桿菌屬；Alloprevotella：擬普雷沃菌屬；Phascolarctobacterium：考拉菌屬；Prevotella：普氏菌屬；Lactobacilus：乳桿菌屬；Unclassified：無法歸類。

表7 屬水平腸道菌群相對豐度

3 討 論

3.1 酸湯對斷奶仔豬生長性能的影響

酸湯中含有豐富的微生物、營養(yǎng)成分、有機(jī)酸及礦物質(zhì)，對調(diào)節(jié)仔豬腸道微生態(tài)平衡有著重要作用，其中的有機(jī)酸能促進(jìn)動物食欲，提高胃排空速率以及消化率，促進(jìn)礦物質(zhì)吸收，提高動物生長性能。Walsh等[7]、Guggenbuhl等[8]研究表明，在斷奶仔豬飼糧中添加酸化劑可以提高ADG、ADFI。Grilli等[9]研究表明，在飼糧中添加0.3%的有機(jī)酸可以顯著提高仔豬的ADG和末重。本試驗中，飼糧中添加酸湯能提高斷奶仔豬的ADFI、ADG，說明酸湯對提高斷奶仔豬的生長性能具有一定功效，這與Halas等[10]的研究結(jié)果相似。本試驗中試驗Ⅴ組的生長性能最好，這可能是因為試驗Ⅴ組飼糧中酸湯的添加量最大，改善了飼料的適口性，增加了采食量，同時能調(diào)節(jié)仔豬各方面生理機(jī)能。

3.2 酸湯對斷奶仔豬血清免疫指標(biāo)的影響

血清免疫球蛋白含量是反映動物機(jī)體免疫性能的重要指標(biāo)之一，血清中IgA、IgG、IgM含量的升高表明動物體免疫機(jī)能增強(qiáng)。Han等[11]用有機(jī)酸替代金霉素，結(jié)果顯示有機(jī)酸組血清IgA、IgG含量均高于金霉素組。Long等[12]的研究表明，復(fù)合有機(jī)酸替代抗生素可以提高斷奶仔豬血清IgA含量。Ahmed等[13]在斷奶仔豬飼糧中添加0.5%的純檸檬酸后發(fā)現(xiàn)血清IgG含量顯著高于阿普霉素組。He等[14]研究表明，檸檬酸、山梨酸等可以提高過氧化氫酶、溶菌酶等免疫相關(guān)基因的表達(dá)。本試驗中試驗Ⅴ組血清IgG含量顯著高于試驗Ⅰ組，這與上述研究結(jié)果相似，表明酸湯對仔豬的免疫機(jī)制有積極作用。

3.3 酸湯對斷奶仔豬血清抗氧化指標(biāo)的影響

動物血清中的抗氧化指標(biāo)能直接反映機(jī)體的健康狀況。張玲玲[15]在斷奶仔豬飼糧中添加有機(jī)酸和植物精油，試驗第28天，有機(jī)酸組血清SOD活性顯著高于對照組。郭驥[16]在泌乳母豬飼糧中添加乳酸、延胡索酸和檸檬酸組成的復(fù)合型酸化劑，發(fā)現(xiàn)復(fù)合型酸化劑組血清MDA含量顯著降低，血清SOD與GSH-Px活性顯著增加。劉文輝[17]發(fā)現(xiàn)復(fù)合酸化劑能顯著提高斷奶仔豬血清SOD、GSH-Px活性。本試驗中，試驗Ⅴ組斷奶仔豬血清SOD、GSH-Px活性顯著高于試驗Ⅰ組，且血清MDA含量顯著低于試驗Ⅰ組，與上述研究結(jié)果一致，表明在基礎(chǔ)飼糧中添加酸湯能夠有效提高斷奶仔豬的抗氧化能力。

3.4 酸湯對斷奶仔豬小腸形態(tài)的影響

仔豬的腸道形態(tài)特別是絨毛長度以及隱窩深度是影響仔豬生長性能與腸道健康的重要指標(biāo)[18]。小腸絨毛的主要作用是吸收營養(yǎng)物質(zhì)，絨毛高度增加能使小腸與營養(yǎng)物質(zhì)的接觸范圍擴(kuò)大，絨毛越長，機(jī)體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收功能越強(qiáng)[19]。由于非常時期，豬成本價格太高，本試驗只屠宰了試驗Ⅰ組(未添加酸湯組)、試驗Ⅲ組(酸湯添加量中間組)和試驗Ⅴ組(酸湯添加量最高組)的試驗豬，結(jié)果顯示：添加酸湯的試驗Ⅲ組和試驗Ⅴ組小腸絨毛高度以及絨隱比均比試驗Ⅰ組提高，隱窩深度均有所降低，且試驗Ⅴ組空腸絨隱比顯著高于試驗Ⅰ組，說明酸湯對斷奶仔豬的小腸發(fā)育產(chǎn)生了有利影響，這可能是因為酸湯中豐富的微生物以及有機(jī)酸對仔豬腸道內(nèi)環(huán)境起到了改善作用。H?gberg等[20]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)飼糧中益生菌數(shù)量升高時，斷奶仔豬腸道內(nèi)pH顯著降低，揮發(fā)性脂肪酸含量增加。Risley等[21]在仔豬飼糧中添加1.5%的檸檬酸，胃內(nèi)容物pH由4.07降到3.82，說明酸湯中有機(jī)酸也可以通過降低仔豬腸道pH以及直接作用于細(xì)菌等2種途徑對腸道內(nèi)環(huán)境進(jìn)行改善，促進(jìn)腸道發(fā)育。

3.5 酸湯對斷奶仔豬腸道微生物區(qū)系的影響

腸道微生物區(qū)系的穩(wěn)定直接影響著動物機(jī)體的健康，若微生物區(qū)系紊亂會導(dǎo)致動物機(jī)體免疫性能降低，引起多種疾病的發(fā)生[22]。反映alpha多樣性的指標(biāo)有Ace指數(shù)[23]、Shannon指數(shù)[24]、Chao1指數(shù)[25]與Simpson指數(shù)[26]等，其中前面3個指數(shù)越大，最后1個指數(shù)越小，說明樣品中的物種越豐富。本試驗中，各組的Ace指數(shù)與Chao1指數(shù)差異不顯著，而試驗Ⅰ組的Shannon指數(shù)最高，顯著高于試驗Ⅴ組，試驗Ⅴ組的Simpson指數(shù)最高，顯著高于試驗Ⅰ組。上述結(jié)果表明酸湯能降低斷奶仔豬腸道微生物群落多樣性，這可能是由于酸湯添加在飼糧中降低了腸道pH以及酸湯中有益菌群的活動對仔豬腸道的有害菌起到了抑制作用。這與姚繼明等[27]和汪海峰等[28]在斷奶仔豬飼糧中添加復(fù)合有機(jī)酸對其腸道微生物菌群的影響結(jié)果相似。

本試驗通過高通量測序發(fā)現(xiàn)，在門水平上，各組主要以厚壁菌門、擬桿菌門以及變形菌門為優(yōu)勢菌門，這與Whitehead等[29]的報道一致。Owens等[30]、Ai-Kassi等[31]研究表明，有等機(jī)酸可降低消化道pH，破壞革蘭氏陰性菌的繁殖，抑制有害菌的發(fā)酵。本試驗中所測3組樣品中厚壁菌門的相對豐度在63.48%～86.06%，擬桿菌門的相對豐度在3.01%～30.80%，且添加酸湯有增加厚壁菌門相對豐度、降低擬桿菌門相對豐度的趨勢。Barnes等[32]、曹志華等[33]研究發(fā)現(xiàn)，酸化劑能促進(jìn)乳酸菌的增殖，同時其代謝產(chǎn)物乳酸能阻止大腸桿菌、沙門氏菌等的增殖，且乳酸菌能產(chǎn)生對沙門氏菌有殺滅作用的過氧化氫。飼糧中添加2.0%酸湯的試驗Ⅴ組的乳桿菌屬相對豐度顯著高于未添加酸湯的試驗Ⅰ組，表明在基礎(chǔ)飼糧中添加酸湯可改善斷奶仔豬腸道菌群結(jié)構(gòu)，有利于腸道有益菌的增殖，這與李小飛等[34]將微生態(tài)制劑應(yīng)用于斷奶仔豬飼糧所得效果一致。

4 結(jié) 論

飼糧中添加酸湯能提高斷奶仔豬的生長性能、免疫機(jī)能和抗氧化能力，能提高空腸絨隱比，有利于小腸形態(tài)發(fā)育；基于OTU的PCA發(fā)現(xiàn)飼糧糧中添加酸湯一定程度上改變了斷奶仔豬盲腸菌群結(jié)構(gòu)。