熊云霞 張亞輝 李 平 吳綺雯 邱月琴 易宏波 肖 昊 蔣宗勇 王 麗

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，畜禽育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室茂名分中心，廣東省畜禽育種與營(yíng)養(yǎng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640)

豆粕是仔豬飼糧中植物蛋白質(zhì)的主要來(lái)源，但是豆粕中的蛋白質(zhì)成分主要是大分子蛋白質(zhì)，且含有許多抗?fàn)I養(yǎng)因子，如大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、胰蛋白酶抑制因子以及寡糖等[1]。斷奶仔豬對(duì)豆粕中大分子蛋白質(zhì)的消化能力差，且對(duì)其中的抗?fàn)I養(yǎng)因子敏感，易造成仔豬腹瀉，阻礙仔豬生長(zhǎng)，因此需要對(duì)豆粕進(jìn)行加工處理。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)益生菌發(fā)酵處理，不僅可以降低豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子的水平，還能改善飼糧的適口性，提高其他營(yíng)養(yǎng)成分的含量及飼糧養(yǎng)分的消化率[2-5]。且益生菌發(fā)酵飼料作為新型無(wú)抗飼料，具有綠色、安全、無(wú)殘留等特性。但是單一菌種發(fā)酵飼料無(wú)法兼顧飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和適口性[6]，因此，工業(yè)生產(chǎn)制備一般采用復(fù)合益生菌協(xié)同發(fā)酵，乳桿菌、芽孢桿菌和酵母菌為生產(chǎn)中的常用菌種。但菌種類別及比例、菌種添加量、發(fā)酵方法及設(shè)備、發(fā)酵飼糧的添加量、飼喂時(shí)間長(zhǎng)短、飼喂階段等方面在行業(yè)內(nèi)還沒(méi)有形成成熟一致的模式。因此，本研究選用課題組自制復(fù)合益生菌固態(tài)發(fā)酵豆粕等量替換無(wú)抗飼糧中的普通豆粕飼喂斷奶仔豬，進(jìn)一步探討該發(fā)酵豆粕對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能、腸道形態(tài)、吸收功能及腸道菌群的影響，為益生菌發(fā)酵飼糧在仔豬生產(chǎn)中的應(yīng)用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

豬源羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)為廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所豬營(yíng)養(yǎng)與飼料研究室自行分離鑒定保存，植物乳桿菌CGMCC1258(LactobacillusplantarumCGMCC1258)為上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院杭曉敏教授饋贈(zèng)，釀酒酵母菌CNM I-1079(SaccharomycescerevisiaeCNM I-1079)購(gòu)于安琪酵母有限公司，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)購(gòu)于廣州市微生物研究所，各菌種經(jīng)過(guò)平板涂布培養(yǎng)目檢及鏡檢正常后方可使用。羅伊氏乳桿菌、植物乳桿菌、釀酒酵母菌和枯草芽孢桿菌以1∶1∶1∶1的比例混合，總接種量為發(fā)酵體系質(zhì)量的10%，各菌種在發(fā)酵體系的終濃度為6.05×108CFU/mL，蒸餾水添加量為40%，控制發(fā)酵溫度在37～40 ℃，發(fā)酵時(shí)間為4 d，前48 h內(nèi)每隔2 h向發(fā)酵桶內(nèi)通入無(wú)菌空氣10 s，后48 h將發(fā)酵桶密封進(jìn)行厭氧發(fā)酵。發(fā)酵后，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)豆粕中的三氯乙酸(TCA)可溶性蛋白含量變?yōu)樵瓉?lái)的3.19倍，豆粕大分子蛋白質(zhì)被降解了56.30%，蛋白質(zhì)主要分布在26 ku以下。益生菌大量存活，平板涂布計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)每克干物質(zhì)發(fā)酵豆粕含芽孢桿菌6×105CFU、乳桿菌2×109CFU(包括植物乳桿菌和羅伊氏乳桿菌)、酵母菌5×106CFU。測(cè)定豆粕發(fā)酵后主要營(yíng)養(yǎng)成分含量變化結(jié)果見(jiàn)表1。發(fā)酵及檢測(cè)試驗(yàn)于2017年5月2日至2017年8月20日在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所微生物中試車間進(jìn)行。

表1 豆粕及發(fā)酵豆粕的營(yíng)養(yǎng)成分含量(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理

選取初始體重為(7.49±0.04)kg的21日齡“杜×長(zhǎng)×大”三元雜交斷奶仔豬72頭，隨機(jī)分為2組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)6頭仔豬(公母各占1/2)。對(duì)照組(CON組)飼喂玉米-豆粕型無(wú)抗飼糧(含9%豆粕)，發(fā)酵豆粕組(FSBM組)飼喂使用發(fā)酵豆粕等量替代對(duì)照組飼糧中豆粕的試驗(yàn)飼糧。試驗(yàn)期14 d。

仔豬運(yùn)至試驗(yàn)基地后，立即進(jìn)行稱重分組，打耳標(biāo)，飲水添加抗應(yīng)激電解液，緩解斷奶與運(yùn)輸應(yīng)激，每欄配有2個(gè)乳頭式飲水器和1個(gè)料槽，圈舍為高床漏縫地板，豬舍溫度控制在25 ℃左右。試驗(yàn)飼糧為粉料，參照NRC(2012)營(yíng)養(yǎng)需要配制，飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表2，飼糧中未添加任何抗生素。所有試驗(yàn)豬自由采食和飲水。按豬場(chǎng)要求進(jìn)行常規(guī)的免疫與驅(qū)蟲(chóng)保健。飼養(yǎng)試驗(yàn)于2017年9月6日至2017年9月20日在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所試驗(yàn)場(chǎng)進(jìn)行。

表2 飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3 樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每個(gè)重復(fù)選取1頭最接近該組平均體重的仔豬進(jìn)行屠宰，頸動(dòng)脈放血處死后迅速打開(kāi)腹腔，無(wú)菌結(jié)扎胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸，置于冰盒內(nèi)備用。取近端十二指腸、中段空腸、遠(yuǎn)端回腸腸段約1.5 cm組織樣品，直接置于4%多聚甲醛，室溫固定過(guò)夜，用于制作腸道組織蘇木精-伊紅染色切片。取近端十二指腸、中段空腸、遠(yuǎn)端回腸腸段剪開(kāi)，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗內(nèi)容物后，玻片輕輕刮取腸內(nèi)壁黏膜樣品分裝于1.5 mL離心管中，液氮速凍，-80 ℃冷凍，用于基因表達(dá)熒光定量分析。取盲腸內(nèi)容物于無(wú)菌凍存管，用于16S rRNA測(cè)序。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1 生長(zhǎng)性能測(cè)定

在試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)以個(gè)體為單位對(duì)所有試驗(yàn)豬進(jìn)行空腹稱重，試驗(yàn)過(guò)程中準(zhǔn)確記錄每個(gè)欄的采食量，記錄豬只的腹瀉情況，以計(jì)算平均日增重、平均日采食量、料重比和腹瀉率。

平均日采食量=試驗(yàn)期采食量/(試驗(yàn)天數(shù)×仔豬頭數(shù))；平均日增重=試驗(yàn)期增重/試驗(yàn)天數(shù)；料重比=平均日采食量/平均日增重；腹瀉率(%)=[總腹瀉頭數(shù)/(仔豬頭數(shù)×試驗(yàn)天數(shù))]×100。

1.4.2 腸道組織形態(tài)觀察

取近端十二指腸、中段空腸、遠(yuǎn)端回腸腸段約1.5 cm組織樣品，直接置于4%多聚甲醛中室溫固定過(guò)夜。從固定液中取出樣品，經(jīng)修塊和組織脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、蘇木精-伊紅染色、脫水、中性樹(shù)膠封片等步驟后成片，Nikon Eclipse E100-DS-U3顯微鏡成像系統(tǒng)(Nikon，日本)觀察采集圖像，使用Pannoramic Viewer軟件(版本1.15.3.35149)進(jìn)行腸道絨毛高度、隱窩深度的測(cè)量，每張片隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察測(cè)量。

1.4.3 腸道黏膜組織中吸收相關(guān)基因表達(dá)測(cè)定

樣品在液氮下充分研磨為粉末，用總RNA提取試劑盒(Invitrogen，Carlsbad，美國(guó))提取組織樣本總RNA，溶解于焦碳酸二乙酯(DEPC)水中，-80 ℃存儲(chǔ)。用NanoDrop ND-1000分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific，美國(guó))評(píng)估RNA的濃度和純度，所有樣品A260/A280的值為1.8～2.0，并利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。取等量(1 μg)總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，日本)反轉(zhuǎn)錄總RNA樣品得第1鏈cDNA，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在-20 ℃保存?zhèn)溆?。?shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)反應(yīng)(Bio-Rad CFX System)為10 μL體系：iTaq Universal SYBR Green Supermix(Bio-Rad美國(guó))5.0 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，cDNA模板2.0 μL(10倍稀釋)，ddH2O 2.0 μL，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)孔。擴(kuò)增程序設(shè)定：95.0 ℃預(yù)變性30 s，95.0 ℃變性15 s，退火30 s，72.0 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；之后進(jìn)行熔解曲線分析。使用的引物均根據(jù)GenBank中豬的基因序列，取保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表3。以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表3 qRT-PCR引物序列

1.4.4 盲腸菌群16S rRNA測(cè)序

本試驗(yàn)應(yīng)用16S rRNA測(cè)序技術(shù)分析發(fā)酵豆粕對(duì)仔豬盲腸菌群結(jié)構(gòu)的影響。采用溴化十六烷基三甲銨/十二烷基硫酸鈉(CTAB/SDS)方法提取樣本基因組DNA，Nanodrop ND-1000分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific，美國(guó))測(cè)定樣品核酸濃度并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA純度，無(wú)菌水稀釋樣品至1 ng/μL。以稀釋樣品作為模板，使用帶條形碼(Barcode)的特異引物擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA的V3+V4區(qū)。上游引物及其序列：341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)；下游引物及其序列：806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。PCR的反應(yīng)體系(Bio-Rad T 100)為30 μL：Phusion Master Mix(2×)15 μL，引物(2 μmol/L)3 μL，模板10 μL，H2O 2 μL。反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性1 min；30個(gè)循環(huán)(98 ℃ 10 s；50 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s)；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。GeneJET膠回收試劑盒(Thermo Scientific)回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物。Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫(kù)試劑盒(Thermo Scientific)進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過(guò)Qubit定量和文庫(kù)檢測(cè)合格后，使用Thermofisher的IonS5TMXL平臺(tái)進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。本試驗(yàn)測(cè)序由北京諾禾致源科技有限公司完成。

1.4.5 生物信息學(xué)分析

根據(jù)獨(dú)特的Barcode對(duì)樣品進(jìn)行分配后，通過(guò)剪切Barcode和引物序列得到Raw reads。使用Cutadapt(Martin 2011)軟件對(duì)Raw reads進(jìn)行質(zhì)量控制(V1.9.1，http://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/)。利用基于Silva數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.arb-silva.de/)的UCHIME算法(http://www.drive5.com/usearch/manual/uchime_algo.html)檢測(cè)和刪除嵌合體序列。使用Uparse軟件(Uparse v7.0.1001，http://drive5.com/uparse/)將相似度≥97%的序列聚成相同的操作分類單元(OTUs)?；赟ilva數(shù)據(jù)庫(kù)，使用Mothur算法進(jìn)行標(biāo)注。利用序列最少的樣本對(duì)應(yīng)的序列號(hào)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)OTUs豐度信息進(jìn)行歸一化處理。后續(xù)的α多樣性和β多樣性分析均基于此歸一化數(shù)據(jù)。

使用QIIME(版本1.7.0)和R包(版本2.15.3)進(jìn)行生物信息學(xué)和統(tǒng)計(jì)分析。α多樣性指數(shù)評(píng)價(jià)物種多樣性和均勻性，并采用t檢驗(yàn)評(píng)估組間各指數(shù)差異。使用β多樣性分析來(lái)評(píng)估各樣品組內(nèi)和組間的差異顯著性。采用基于OTUs物理距離的主成分分析(PCA)、基于非加權(quán)Unifrac距離的主坐標(biāo)分析(PCoA)顯示樣本的分布情況。線性判別分析效應(yīng)(LEfSe)分析采用Mann-Whitney檢驗(yàn)各組生物標(biāo)志物物種(LDA score≥2)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)使用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果用平均值及均值標(biāo)準(zhǔn)誤來(lái)表示，P<0.05為差異顯著，0.05≤P≤0.10表示有顯著趨勢(shì)。

2 結(jié) 果

2.1 復(fù)合益生菌固態(tài)發(fā)酵豆粕對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響

如表4所示，與對(duì)照組相比，飼糧中添加復(fù)合益生菌固態(tài)發(fā)酵豆粕顯著提高斷奶仔豬終末體重和平均日增重(P<0.05)，顯著降低料重比(P<0.05)。

表4 復(fù)合益生菌固態(tài)發(fā)酵豆粕對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響

2.2 復(fù)合益生菌固態(tài)發(fā)酵豆粕對(duì)斷奶仔豬腸道形態(tài)的影響

如圖1所示，對(duì)照組腸道絨毛有斷裂、倒伏，而發(fā)酵豆粕組腸道絨毛排列更整齊緊密。分析其絨毛高度和隱窩深度，與對(duì)照組相比，發(fā)現(xiàn)飼糧中添加復(fù)合益生菌固態(tài)發(fā)酵豆粕顯著提高斷奶仔豬空腸絨毛高度(P<0.05)，且空腸絨隱比有升高趨勢(shì)(P=0.07)，顯著升高十二指腸絨隱比(P<0.05)(表5)。

圖1 斷奶仔豬腸道形態(tài)

2.3 復(fù)合益生菌固態(tài)發(fā)酵豆粕對(duì)斷奶仔豬腸道吸收相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

如圖2所示，與對(duì)照組相比，飼糧中添加復(fù)合益生菌固態(tài)發(fā)酵豆粕顯著提高斷奶仔豬十二指腸SGLT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量、空腸SGLT1和b0,+T以及回腸PepT1和AQP1 mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)。

SGLT1：鈉依賴性葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1 sodium-dependent glucose co-transporter 1；PepT1:小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體1 small peptide transporter 1;AQP1:水通道蛋白1 aquaporins 1; b0,+AT:堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體 cationic amino acid transporter。

2.4 復(fù)合益生菌固態(tài)發(fā)酵豆粕對(duì)斷奶仔豬盲腸菌群的影響

本試驗(yàn)共收集12個(gè)盲腸內(nèi)容物樣品，經(jīng)16s rRNA測(cè)序得菌群平均有效序列數(shù)為56 320條，聚類生成1 165個(gè)OTUs。共檢測(cè)到20個(gè)門、23個(gè)綱、35個(gè)目、56個(gè)科、114個(gè)屬和100個(gè)種。結(jié)果表明，飼糧中添加復(fù)合益生菌固態(tài)發(fā)酵豆粕有提高斷奶仔豬盲腸菌群α多樣性的趨勢(shì)(Shanon指數(shù)，P=0.10；Simpson指數(shù)，P=0.09；見(jiàn)表6)。基于OTUs物理距離的PCA分析和基于非加權(quán)unifrac距離的PCoA分析發(fā)現(xiàn)(圖3)，飼糧中添加復(fù)合益生菌固態(tài)發(fā)酵豆粕沒(méi)有顯著影響斷奶仔豬盲腸菌群β多樣性。分析菌群組成發(fā)現(xiàn)，在門水平上，菌群主要由擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)組成(圖4-A)，共占比80%以上，與對(duì)照組相比，添加復(fù)合益生菌固態(tài)發(fā)酵豆粕提高了Firmicutes的相對(duì)豐度(36.9% vs 44.2%)。在屬水平上，對(duì)照組優(yōu)勢(shì)菌屬均為未鑒定普雷沃氏菌科(unidentified_Prevotellaceae)、厭氧弧菌屬(Anaerovibrio)和彎曲桿菌屬(Campylobacter)，占比分別為11.7%、10.0%、9.8%；復(fù)合益生菌固態(tài)發(fā)酵豆粕組優(yōu)勢(shì)菌屬為unidentified_Prevotellaceae、擬普雷沃菌屬(Alloprevotella)和Anaerovibrio，占比分別為8.0%、7.2%、6.2%。其中，Alloprevotella在對(duì)照組的占比為6.8%，而Campylobacter在發(fā)酵豆粕組中的占比為2.7%。LEfSe分析發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加復(fù)合益生菌固態(tài)發(fā)酵豆粕導(dǎo)致梭菌目(Clostridiales)、梭菌綱(Clostridia)、毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)、鼠桿菌科(Muribaculaceae)、翠桿菌屬(Turicibacter)和黏膜乳桿菌(Lactobacillusmucosae)等的富集(圖4-C)。

圖3 復(fù)合益生菌固態(tài)發(fā)酵豆粕對(duì)斷奶仔豬盲腸菌群β多樣性的影響

圖4 復(fù)合益生菌固態(tài)發(fā)酵豆粕對(duì)斷奶仔豬盲腸菌群物種的影響

表6 復(fù)合益生菌固態(tài)發(fā)酵豆粕對(duì)斷奶仔豬盲腸菌群α多樣性指數(shù)的影響

3 討 論

本課題組利用腸道益生菌做了大量的研究工作[7-8]，發(fā)現(xiàn)飼糧直接添加植物乳桿菌、羅伊氏乳桿菌和釀酒酵母菌均能顯著提高仔豬生長(zhǎng)性能，改善腸道健康，提高動(dòng)物免疫力，降低斷奶仔豬腹瀉[8-13]。且植物乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、釀酒酵母菌和枯草芽孢桿菌發(fā)現(xiàn)具有較好的分泌蛋白酶和纖維酶活性，能夠降解豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)成分，提高飼糧的利用率[14-15]。因此本試驗(yàn)利用以上益生菌種，對(duì)豆粕進(jìn)行改良兩步法固態(tài)發(fā)酵，測(cè)定豆粕固態(tài)發(fā)酵前后主要營(yíng)養(yǎng)成分含量變化，并進(jìn)一步探究該發(fā)酵豆粕對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能、腸道形態(tài)、吸收功能及腸道菌群的影響。

3.1 復(fù)合益生菌固態(tài)發(fā)酵豆粕對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響

已有大量研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，飼糧添加發(fā)酵豆粕可以提高斷奶仔豬生長(zhǎng)性能，降低料重比和腹瀉率，降低病死率[3-4,16-18]。這是因?yàn)椋?)在微生物發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的有機(jī)酸具有誘食作用，可提高動(dòng)物采食量；2)微生物發(fā)酵可以降低豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子水平，并提高其他營(yíng)養(yǎng)成分含量，提高動(dòng)物對(duì)飼糧中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率[2]。在生產(chǎn)實(shí)踐中，由于菌種組合比例、添加量及發(fā)酵方法的不同造成發(fā)酵豆粕營(yíng)養(yǎng)成分差別很大[19]，且在飼糧中發(fā)酵豆粕添加量、飼喂時(shí)間長(zhǎng)短、飼喂豬生長(zhǎng)階段也不盡相同。因此，飼喂發(fā)酵豆粕對(duì)豬生長(zhǎng)性能的影響研究結(jié)果也不完全一致。目前應(yīng)用于發(fā)酵豆粕的菌種多為芽孢桿菌、酵母菌和乳桿菌，發(fā)酵豆粕在飼糧中添加量在4.0%～24.5%，有效劑量在10%左右，飼喂時(shí)間一般在21 d以上，可顯著提高斷奶仔豬平均日增重，降低料重比[20-23]。本試驗(yàn)添加9%復(fù)合益生菌固態(tài)發(fā)酵豆粕飼喂斷奶仔豬，并未發(fā)現(xiàn)采食量的顯著提高，但是終末體重和平均日增重顯著提高，料重比顯著降低。因此，我們推斷本試驗(yàn)中，斷奶仔豬平均日增重的提高與采食量無(wú)關(guān)，可能與添加發(fā)酵豆粕的營(yíng)養(yǎng)成分組成及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收率有關(guān)。而本試驗(yàn)中豆粕發(fā)酵后大豆蛋白大量降解，被降解后主要集中為26 ku左右的小肽，易于消化吸收。

3.2 復(fù)合益生菌固態(tài)發(fā)酵豆粕對(duì)斷奶仔豬腸道形態(tài)的影響

豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致腸道絨毛萎縮及隱窩增生，如胰蛋白酶抑制劑會(huì)干擾胰蛋白酶和糜乳蛋白酶的正常功能，導(dǎo)致腸道形態(tài)異常，并影響動(dòng)物的蛋白質(zhì)消化。豆粕經(jīng)過(guò)復(fù)合益生菌發(fā)酵處理后，抗?fàn)I養(yǎng)因子大大減少，可以減輕抗原蛋白對(duì)腸道黏膜的刺激和損傷，改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)。Feng等[23]添加24.5%發(fā)酵豆粕發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵豆粕可顯著升高小腸各腸段絨毛高度，提高十二指腸隱窩深度。岳曉敬等[20]也發(fā)現(xiàn)，添加12%發(fā)酵豆粕可顯著改善斷奶仔豬腸道形態(tài)，改善斷奶應(yīng)激造成的絨毛斷裂、粘連，提高腸道微絨毛密度和高度，且腸道絨毛整齊度好。與前人研究結(jié)果一致，本試驗(yàn)添加9%發(fā)酵豆粕飼喂斷奶仔豬，發(fā)現(xiàn)腸道絨毛排列更整齊緊密。我們推斷飼喂發(fā)酵豆粕對(duì)腸道形態(tài)的改善可能與其對(duì)自噬相關(guān)信號(hào)通路的抑制有關(guān)，在Zhu等[24]的研究中也發(fā)現(xiàn)，添加復(fù)合益生菌發(fā)酵豆粕可使仔豬腸道中自噬因子微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B(LC3B)蛋白表達(dá)降低，發(fā)酵豆粕改善腸道形態(tài)的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。豆粕發(fā)酵后，成分變化復(fù)雜，抑制自噬相關(guān)信號(hào)通路的有效成分尚待明確。

3.3 復(fù)合益生菌固態(tài)發(fā)酵豆粕對(duì)斷奶仔豬腸道吸收相關(guān)基因表達(dá)的影響

本試驗(yàn)中豆粕發(fā)酵后，粗蛋白質(zhì)含量由51.93%提高55.86%，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量集中在26 ku以下。研究發(fā)現(xiàn)，豆粕發(fā)酵后必需和非必需氨基酸含量均顯著提高[2]，且添加益生菌發(fā)酵豆粕可提高仔豬腸道蛋白酶活性[23]。飼糧中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)經(jīng)胃腸道消化后通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)載體進(jìn)入腸道黏膜細(xì)胞參與機(jī)體代謝，而氨基酸、小肽、葡萄糖及水分的吸收都離不開(kāi)轉(zhuǎn)運(yùn)載體的作用，目前關(guān)于發(fā)酵豆粕對(duì)斷奶仔豬腸道黏膜消化吸收相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因的表達(dá)少有人關(guān)注。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，飼糧直接添加羅伊氏乳桿菌可顯著改善斷奶仔豬生長(zhǎng)性能，這與腸道黏膜氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體PepT1、興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體3(EAAT3)、中性和基礎(chǔ)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體(rBAT)、鈉離子依賴中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(B0AT1)、b0,+AT等基因表達(dá)量的提高有關(guān)，分析其機(jī)制發(fā)現(xiàn)羅伊氏乳桿菌可通過(guò)提高核糖體S6蛋白(S6)及70ku核糖體S6激酶1(70S6K1)的磷酸化激活蛋白合成通路哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mTORC1)[12-13,25]。本研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加復(fù)合益生菌固態(tài)發(fā)酵豆粕可顯著提高斷奶仔豬空腸b0,+T和回腸PepT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量，發(fā)酵豆粕有可能激活機(jī)體蛋白質(zhì)合成通路，其潛在機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。飼喂發(fā)酵豆粕提高腸道黏膜組織中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)是斷奶仔豬生長(zhǎng)性能提高的原因之一。

3.4 復(fù)合益生菌固態(tài)發(fā)酵豆粕對(duì)斷奶仔豬腸道菌群的影響

有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，飼糧添加發(fā)酵豆粕可降低斷奶仔豬腸道有害菌(大腸桿菌和沙門氏菌)的數(shù)量[21,26-27]，并增加腸道菌群的多樣性，改善菌群結(jié)構(gòu)，增加腸道中厚壁菌門、乳酸菌科和乳酸菌屬等有益菌的相對(duì)豐度[28-29]。本研究也發(fā)現(xiàn)，飼喂復(fù)合益生菌固態(tài)發(fā)酵豆粕有提高腸道菌群物種多樣性和豐富度的趨勢(shì)，且益生菌Lactobacillusmucosae得到富集。這可能和發(fā)酵豆粕中存活的大量發(fā)酵菌種有關(guān)。有意思的是，本試驗(yàn)中添加的發(fā)酵豆粕中含有大量的存活益生菌，但是只有乳桿菌在仔豬腸道中得到了富集，這可能與發(fā)酵豆粕中乳桿菌的相對(duì)豐度有關(guān)。Zhu等[24]采用16S rRNA測(cè)序技術(shù)研究飼喂發(fā)酵豆粕的斷奶仔豬的糞便和結(jié)腸內(nèi)容物菌群結(jié)構(gòu)，并與平均日采食量和免疫因子水平做相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)嚴(yán)格厭氧芽孢桿菌(Clostridiumsensustricto)、毛螺菌屬(Lachnospira)和擬桿菌屬(Bacteroides)相對(duì)豐度與仔豬腹瀉率呈正相關(guān)，乳桿菌屬(Lactobacillus)、布勞特氏菌屬(Blautia)和Clostridiumsensustricto相對(duì)豐度與平均日采食量呈正相關(guān)，Lactobacillus及Lachnospira相對(duì)豐度則與血清免疫球蛋白M(IgM)含量呈正相關(guān)。因此，我們推斷發(fā)酵豆粕提高斷奶仔豬生長(zhǎng)性能和免疫力可能和腸道菌群的改善有關(guān)。Jin等[30]利用唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和釀酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)復(fù)合發(fā)酵豆粕后，應(yīng)用16S rRNA測(cè)序技術(shù)結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析發(fā)酵飼糧中的菌群結(jié)構(gòu)和代謝產(chǎn)物分布，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后，飼糧中的優(yōu)勢(shì)菌種為腸球菌，而并非添加的益生菌種。且發(fā)酵后飼糧中的乳酸含量升高，總揮發(fā)性脂肪酸含量降低。進(jìn)一步代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵使得馬來(lái)酸、苯乙酸、亞油酸乙酯、二同-亞麻酸和L-茶氨酸等得到富集，而這些代謝產(chǎn)物具有較好的抗菌活性。綜上所述，飼糧添加發(fā)酵豆粕影響斷奶仔豬腸道菌群的可能原因有：1)豆粕發(fā)酵后本身含有大量活的益生菌，可產(chǎn)生占位效應(yīng)，抑制有害菌生長(zhǎng)；2)豆粕發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生大量生物活性物質(zhì)(寡糖、多肽及促生長(zhǎng)因子等)，促進(jìn)有益菌生長(zhǎng)，改善腸道微生物區(qū)系；3)豆粕發(fā)酵后的代謝產(chǎn)物具有較好的抑菌活性，阻礙有害菌的生長(zhǎng)。發(fā)酵豆粕如何通過(guò)菌群影響機(jī)體生長(zhǎng)代謝的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

綜合以上研究結(jié)果，利用自制復(fù)合益生菌固態(tài)發(fā)酵豆粕等量(9%)替換無(wú)抗飼糧中普通豆粕，可提高斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能，改善腸道形態(tài)和吸收功能，并有提高腸道菌群多樣性的趨勢(shì)。