孟曉雪 衛(wèi)育良 梁萌青 徐后國*

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，青島 266071；3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室，青島 266071)

脂類是魚類的重要營養(yǎng)要素之一，膽固醇作為類脂的一種，是魚體內(nèi)最為豐富的固醇類化合物。膽固醇不僅是動物細(xì)胞膜的重要組成成分，還是類固醇激素、維生素D3及膽汁酸的重要前體物。在體內(nèi)，膽固醇主要以游離膽固醇和膽固醇酯的形式存在，二者合稱為總膽固醇。水生動物中，甲殼動物由于不能自身合成膽固醇，需要在其飼料中進(jìn)行添加，而魚類等脊椎動物能夠合成膽固醇，通常認(rèn)為膽固醇是魚類的非必需營養(yǎng)物質(zhì)，因此魚類營養(yǎng)學(xué)家較少關(guān)注魚類飼料膽固醇的營養(yǎng)生理作用[1-2]。然而，近幾年的報道表明，魚類飼料中膽固醇的營養(yǎng)需求受飼料配方及魚的種類等因素影響較顯著。目前國內(nèi)外對飼料膽固醇影響魚類生長及代謝機(jī)理的研究還處于初步探討階段，本文主要對魚類膽固醇的營養(yǎng)需求、魚體內(nèi)膽固醇代謝及其代謝的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 魚類飼料膽固醇的來源

在當(dāng)今的水產(chǎn)養(yǎng)殖中，出于環(huán)境和經(jīng)濟(jì)成本的考慮，魚粉和魚油越來越多地被植物性原料所代替。不同飼料原料中，膽固醇含量的差別較大，部分飼料原料中膽固醇含量見表1。膽固醇是動物體內(nèi)主要的甾醇類物質(zhì)，因此動物原料中的膽固醇含量較高，而植物原料中膽固醇含量較低[3]。植物原料中的甾醇類主要包括β-谷甾醇、菜油甾醇及少量的豆甾醇和菜籽甾醇。這些植物固醇在動物體內(nèi)會與腸道膽固醇進(jìn)行競爭，抑制膽固醇的吸收并降低血液膽固醇的含量[4]。研究表明，攝食大豆蛋白的虹鱒(Oncorhynchusmykis)[5]和大西洋鱈魚(Gadusmorhua)[6]均存在低膽固醇效應(yīng)，這種現(xiàn)象可能主要與植物原料中膽固醇的缺乏及植物甾醇的競爭有關(guān)[7-8]。

表1 常用飼料原料中膽固醇含量

2 動物體內(nèi)膽固醇的代謝

2.1 膽固醇的內(nèi)源合成

肝臟是機(jī)體膽固醇合成的主要場所，也是維持膽固醇需求和血液膽固醇含量穩(wěn)定的重要器官。膽固醇的穩(wěn)態(tài)是維持正常生命活動的保障，不同動物合成膽固醇的能力存在顯著差異。蝦蟹類等甲殼動物不能自身合成膽固醇，所需要的膽固醇依靠外源性攝入[2]。而對于魚類等脊椎動物而言，機(jī)體自身能夠利用乙酸合成膽固醇[9]。膽固醇的生物合成可以分為4個階段：甲羥戊酸合成、異戊二酸合成、鯊烯合成、膽固醇生成。羥甲基戊二酸輔酶A還原酶(HMGR)是膽固醇合成的主要限速酶[10]。

2.2 膽固醇的分解與轉(zhuǎn)化

膽固醇在體內(nèi)不能被徹底氧化分解為二氧化碳和水，但其側(cè)鏈可以被氧化、還原和降解，轉(zhuǎn)化為固醇類物質(zhì)。皮膚組織中的膽固醇可轉(zhuǎn)化為維生素D3。膽固醇還可以與脂肪酸在膽固醇脂酰轉(zhuǎn)移酶的催化作用下結(jié)合形成膽固醇酯，并通過脂蛋白運(yùn)至其他組織中進(jìn)行儲存[11]。

此外，由膽固醇轉(zhuǎn)化為孕烯醇酮是所有類固醇激素(性類固醇激素和皮質(zhì)類固醇)合成的第1步[12-13]。所利用的膽固醇主要來源于貯存在脂滴中的膽固醇酯，以及通過選擇性攝取獲得的血漿脂蛋白[14]。類固醇激素生物合成的限速步驟是膽固醇從腎上腺或性腺的線粒體外膜轉(zhuǎn)移至線粒體內(nèi)膜，由類固醇合成急性調(diào)節(jié)蛋白介導(dǎo)。隨后在細(xì)胞色素P450膽固醇側(cè)鏈裂解酶的催化作用下生成孕烯醇酮，從而轉(zhuǎn)化為有活性的性激素(睪酮、雌二醇和孕酮)。類固醇激素會激活性腺發(fā)育，并在魚類的整個生殖期發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。

膽固醇降解最重要的機(jī)制是轉(zhuǎn)化為膽汁酸，主要包括經(jīng)典途徑和替代途徑[15-16]。膽固醇在肝臟中轉(zhuǎn)化為膽汁酸后貯存于膽囊，在腸道中被重新吸收由門靜脈進(jìn)入肝臟，從而實(shí)現(xiàn)膽汁酸的肝腸循環(huán)。以膽汁酸鹽的形式進(jìn)入腸道未被吸收的膽固醇，一般是在細(xì)菌作用下轉(zhuǎn)化為糞固醇或以殘量膽固醇的形式排出體外。

2.3 膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)

膽固醇在動物機(jī)體內(nèi)主要以膽固醇酯的形式借助具有親水性結(jié)構(gòu)的脂蛋白通過血液進(jìn)行運(yùn)輸[11]。飼料中的脂類與載脂蛋白結(jié)合形成乳糜微粒，將外源膽固醇和甘油三酯從腸道運(yùn)輸?shù)狡渌M織進(jìn)行利用。在肝細(xì)胞中合成的極低密度脂蛋白(VLDL)，主要將外源攝入和內(nèi)源合成的膽固醇以及甘油三酯由肝臟運(yùn)輸?shù)狡渌M織進(jìn)行利用、貯存或代謝轉(zhuǎn)化。在血液循環(huán)的過程中，VLDL在脂蛋白脂肪酶的作用下通過脫脂得到低密度脂蛋白(LDL)，然后肝外組織在LDL受體的幫助下通過內(nèi)吞作用對其進(jìn)行攝取和膽固醇的利用。過多的膽固醇則被高密度脂蛋白(HDL)逆轉(zhuǎn)運(yùn)回肝臟進(jìn)行降解清除，以維持體內(nèi)膽固醇的穩(wěn)態(tài)。

低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)/高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)比值作為膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的標(biāo)志，同時也是反映外周血管中膽固醇蓄積的指標(biāo)[17]。在以魚粉為基礎(chǔ)的飼料中添加膽固醇顯著增加了LDL-C/HDL-C比值[9,18]，即增加了膽固醇在外周組織中的蓄積，而在以植物性蛋白質(zhì)源為基礎(chǔ)的飼料中添加膽固醇則該比值顯著降低[9,17,19-20]。

3 魚類膽固醇營養(yǎng)需求

水產(chǎn)養(yǎng)殖對魚粉魚油具有很強(qiáng)的依賴性。為緩解魚粉魚油短缺對水產(chǎn)養(yǎng)殖可持續(xù)發(fā)展的影響，魚粉魚油替代逐漸成為目前魚類營養(yǎng)研究的一大熱點(diǎn)，也是產(chǎn)業(yè)應(yīng)用的一大趨勢。植物性原料由于可獲得性高且相對廉價，正越來越多地被用在水產(chǎn)飼料中。以植物性原料部分或全部替代魚粉魚油后，一些必需氨基酸、脂肪酸和礦物質(zhì)通常需要額外補(bǔ)充，但膽固醇等因子則容易被忽略，導(dǎo)致水產(chǎn)動物的生長以及機(jī)體成分可能受到膽固醇缺乏的影響。

由于魚類等脊椎動物能夠在體內(nèi)合成膽固醇，目前很少有研究關(guān)注膽固醇在魚類營養(yǎng)代謝中的作用及機(jī)理。然而，膽固醇的生物合成是一個高耗能的過程，合成1個膽固醇需要18個乙酰輔酶A、36個ATP和16個還原型輔酶Ⅱ(NADPH)。若飼料中膽固醇含量較低，則會迫使養(yǎng)殖魚類不斷進(jìn)行內(nèi)源性膽固醇合成，產(chǎn)生大量能量消耗。因此，外源膽固醇對于魚類營養(yǎng)生理的重要性和必要性需要重新進(jìn)行評估。

3.1 飼料膽固醇對魚類攝食和生長的影響

3.2 飼料膽固醇對魚體營養(yǎng)組成的影響

肝臟中膽固醇的沉積量隨飼料膽固醇含量的增多而上升[1,17]。飼料中膽固醇的過度添加可能會造成肝臟中膽固醇的過度累積，引發(fā)肝臟損傷或組織病變[27]。使用豆粕替代飼料中45%的魚粉后，牙鲆魚體的粗脂肪和血清膽固醇含量顯著降低[24]；而飼料中添加1%左右的膽固醇顯著提高了大菱鲆[17]、牙鲆[24]、虹鱒[26]魚體粗脂肪和血清膽固醇含量。與之類似的，當(dāng)以脫脂魚粉為主要蛋白質(zhì)源時，在飼料中梯度添加(<2%)膽固醇顯著升高了大菱鲆魚體粗脂肪和血清膽固醇含量[29]。與對魚體粗脂肪含量的影響相對應(yīng)，飼料中添加1%的膽固醇后，大西洋鮭的肝體指數(shù)(HSI)顯著升高[18]。脂蛋白脂肪酶(LPL)與肝脂酶(HL)是血液中參與脂肪分解代謝的2種關(guān)鍵酶，而激素敏感脂酶(HSL)是負(fù)責(zé)脂肪組織細(xì)胞中脂肪水解的限速酶之一。研究發(fā)現(xiàn)，飼料膽固醇對血液中HL活性的影響不顯著，但顯著提高了LPL和HSL的活性[27]。這些研究出現(xiàn)飼料膽固醇影響魚體粗脂肪含量的結(jié)果，可能是因?yàn)樗砑拥哪懝檀寄軌蛟隗w內(nèi)轉(zhuǎn)化為膽汁酸，促進(jìn)脂類物質(zhì)的消化和吸收，從而促進(jìn)了脂肪的累積[21]，但過多添加膽固醇又會造成脂質(zhì)代謝紊亂，使得機(jī)體粗脂肪含量降低[27]。與脂類沉積規(guī)律不同，在鲆鰈魚類中，魚體的粗蛋白質(zhì)、水分和粗灰分含量均未受到飼料膽固醇添加量的顯著影響[24,29]；在軍曹魚中，飼料膽固醇含量在一定范圍內(nèi)增加(0～0.8%)對魚體粗蛋白質(zhì)含量無顯著影響，但當(dāng)膽固醇含量繼續(xù)增加(1.2%～2.0%)時，魚體粗蛋白質(zhì)含量顯著增加[27]。

此外，在大西洋鮭上的研究表明，飼料中添加1%的膽固醇使得肝臟中棕櫚酸(C16∶0)、花生四烯酸(C20∶4n-6，ARA)和二十二碳六烯酸(C22∶6n-3，DHA)的相對含量顯著降低，油酸(C18∶1n-9)和二十碳烯酸(C20∶1n-9)的相對含量顯著升高，而糞便中飽和脂肪酸的相對含量顯著降低，不飽和脂肪酸的相對含量顯著升高[18]。這說明膽固醇的添加不但會導(dǎo)致肝臟膽固醇的累積，還會對糞便和肝臟的脂肪酸組成產(chǎn)生一定的影響。

3.3 飼料膽固醇對魚體健康的影響

膽固醇添加量過低或過高都會降低魚體的免疫功能并加重其炎癥反應(yīng)。飼料中膽固醇含量的異常會降低草魚(Ctenopharyngodonidella)抗皮膚出血和損傷能力及相關(guān)免疫酶的活性[32]。在以豆粕為基礎(chǔ)的飼料中添加適量(0.9%～1.2%)的膽固醇可以提高虹鱒的免疫應(yīng)答能力和抗嗜水氣單胞菌能力[33]。

本文就目前針對魚類膽固醇營養(yǎng)需求的相關(guān)研究進(jìn)行了總結(jié)，詳見表2。

表2 魚類膽固醇營養(yǎng)需求的相關(guān)研究

4 膽固醇代謝的影響因素及調(diào)控機(jī)制

4.1 膽固醇代謝的影響因素

4.1.1 營養(yǎng)素

外源攝入的營養(yǎng)物質(zhì)可以通過調(diào)節(jié)膽固醇代謝的相關(guān)因子及關(guān)鍵酶的活性來改變機(jī)體的膽固醇代謝，影響膽固醇穩(wěn)態(tài)。膽固醇在機(jī)體內(nèi)的運(yùn)輸與脂蛋白密切相關(guān)，而磷脂又是脂蛋白的重要組成成分，在膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮著重要作用。韓冰[34]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中磷脂與膽固醇在影響半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)稚魚的生長作用上具有很強(qiáng)的相關(guān)性，當(dāng)飼料中不含磷脂時，隨膽固醇含量的升高，特定生長率先升高后下降；而當(dāng)飼料磷脂含量為5.0%或7.5%時，不添加膽固醇組的特定生長率顯著高于膽固醇添加組。由此可見，在飼料中添加磷脂可以起到一定的節(jié)約膽固醇的作用。

升高狼鱸(Dicentrarchuslabrax)飼料中碳水化合物的含量后，肝臟HMGR基因表達(dá)上調(diào)，膽固醇合成增多[35]。在虹鱒中，投喂富含碳水化合物的飼料也導(dǎo)致了血漿膽固醇含量的增加[36]。植物油替代魚油使得大西洋鮭的膽固醇生物合成相關(guān)基因表達(dá)量升高[37]。而本實(shí)驗(yàn)室在對紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)的研究中則發(fā)現(xiàn)，富含n-6多不飽和脂肪酸的油源傾向于升高總膽固醇含量而降低HDL-C含量[38]。對長鏈多不飽和脂肪酸調(diào)節(jié)鲆鰈類性類固醇激素合成的作用，本實(shí)驗(yàn)室也進(jìn)行了初步的研究，發(fā)現(xiàn)在半滑舌鰨飼料中DHA/二十碳五烯酸(C20∶5n-3,EPA)比例為1.09時顯著促進(jìn)了雌魚雌二醇的生成，DHA/EPA比例為2.05時顯著促進(jìn)了雄魚睪酮的生成[39]。飼料中的ARA亦可調(diào)節(jié)半滑舌鰨體內(nèi)性類固醇激素的合成，但其效果取決于魚的性別和成熟階段[40]。大體來看，ARA對性類固醇激素合成的調(diào)控作用在性腺發(fā)育早期更加明顯(相對于性腺發(fā)育后期)，在雄魚中更加明顯(相對于雌魚)[40]。而且，相關(guān)研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，3β-羥基類固醇脫氫酶(3β-HSD)可能是飼料脂肪酸調(diào)控半滑舌鰨性類固醇激素合成的重要靶標(biāo)蛋白。本實(shí)驗(yàn)室在另一種鲆鰈魚類大菱鲆中也進(jìn)行了類似的相關(guān)試驗(yàn)，但與在半滑舌鰨中所得結(jié)果不同的是ARA的添加降低了親魚性類固醇激素的合成[41]。飼料中添加抗壞血酸會增加虹鱒血清總膽固醇和LDL及糞便膽汁酸含量，上調(diào)肝臟HMGR和膽固醇7α-羥化酶(CYP7A1)的表達(dá)，降低肝臟LDL受體含量和血清皮質(zhì)醇含量[42]。

當(dāng)然，低膽固醇含量的飼料原料替代魚粉會影響膽固醇代謝，但這種影響可能主要是膽固醇含量的變化而非其他營養(yǎng)成分的變化所帶來。例如，以脫脂豆粕替代魚粉會降低虹鱒血漿膽固醇和甘油三酯的含量[46]。飼料中添加450～600 g/kg橡膠籽粕可降低雜交羅非魚(Oreochromisniloticus×O.aureus)肝臟HMGR、CYP7A1活性和LDL受體含量[47]。此外，飼料營養(yǎng)水平的不同對機(jī)體膽固醇代謝產(chǎn)生的影響也不同。饑餓和禁食處理會減少機(jī)體HMGR的合成，從而抑制肝臟膽固醇的合成[48]。最后，值得一提的是，植物固醇的添加可能會抑制外源性膽固醇的吸收，增加肝臟合成膽固醇的能力，這在大鼠中得到了證實(shí)[49]，但是在魚類中尚未有相關(guān)報道發(fā)表。

4.1.2 非營養(yǎng)性飼料添加劑

大豆皂苷具有熱穩(wěn)定性，是三萜系化合物配糖體。飼料中添加300 mg/kg的皂苷可以顯著提高尼羅羅非魚肌肉膽固醇的含量[50]，但是在以魚粉為基礎(chǔ)的飼料中添加大豆皂苷對大菱鲆膽固醇代謝無顯著影響[4]。趙峰等[51]研究表明，在羅非魚飼料中分別以及聯(lián)合添加果寡糖和枯草芽孢桿菌，均能使得機(jī)體血清甘油三酯及膽固醇含量下降。

4.1.3 環(huán)境因素

魚類作為一種水生脊椎動物，其生長及生理代謝受環(huán)境因子如鹽度、密度以及水污染的影響較大。鹽度是影響魚類生長和生存的重要環(huán)境因子之一，金槍魚(Trachinotusovatus)血清膽固醇含量隨水環(huán)境鹽度的增加先降低后升高，當(dāng)鹽度為25‰時機(jī)體血清膽固醇含量最低[52]。隨著飼養(yǎng)密度的增加，團(tuán)頭魴血清中的皮質(zhì)醇和甘油三酯含量顯著增加，而總膽固醇含量顯著下降[53]。當(dāng)對鯉魚(Cyprinuscarpio)進(jìn)行急性氨氮脅迫時，對照組與試驗(yàn)組間血清膽固醇含量無顯著差異[54]。此外，重金屬和人工合成藥物的不恰當(dāng)處理會導(dǎo)致脂質(zhì)調(diào)節(jié)類藥物被排放到水環(huán)境中成為污染物，通過水環(huán)境干擾魚類的脂質(zhì)代謝[55]。對成年斑馬魚(Daniorerio)分別投喂噴灑有吉非羅齊和阿伐他汀的飼料后，發(fā)現(xiàn)雌魚和雄魚的膽固醇含量均顯著降低[56]。

4.2 膽固醇代謝的調(diào)控機(jī)制

4.2.1 激素調(diào)節(jié)

激素是調(diào)節(jié)膽固醇代謝的重要因素之一，主要通過促使HMGR磷酸化(非活性)和去磷酸化(活性)的發(fā)生影響膽固醇的合成?？蓪δ懝檀即x產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用的激素主要包括胰島素、胰高血糖素、甲狀腺激素和皮質(zhì)醇等。胰高血糖素會促進(jìn)HMGR的磷酸化，從而抑制膽固醇的合成[11]，胰島素的作用與之相反。此外，胰島素和甲狀腺激素還可以通過誘導(dǎo)HMGR的合成來促進(jìn)膽固醇的合成。

4.2.2 膽固醇的負(fù)反饋調(diào)節(jié)

細(xì)胞內(nèi)膽固醇的含量可以負(fù)反饋調(diào)節(jié)膽固醇的合成代謝，主要是通過調(diào)節(jié)膽固醇合成的主要限速酶HMGR來實(shí)現(xiàn)的[10]。肝臟HMGR的活性以及mRNA水平的反饋調(diào)節(jié)有助于實(shí)現(xiàn)機(jī)體的膽固醇穩(wěn)態(tài)[57-58]。HMGR的合成與降解都受到膽固醇含量的調(diào)控，當(dāng)機(jī)體內(nèi)膽固醇含量超過正常水平時，HMGR的轉(zhuǎn)錄減少且降解增加，從而減少機(jī)體膽固醇的合成。相關(guān)研究表明，隨著飼料膽固醇含量的增加，魚類肝臟中HMGR的表達(dá)量顯著降低[17,20,59]。并且，與植物性蛋白質(zhì)組相比，魚粉組黃尾鰤肝臟中HMGR的表達(dá)量顯著降低[10]。與之相對應(yīng)的是，膽汁酸合成關(guān)鍵酶CYP7A1的表達(dá)量顯著上升。這表明膽固醇底物的增加促進(jìn)了膽汁酸的合成，從而增加了膽汁酸的轉(zhuǎn)化率[30]。

5 小結(jié)與展望

魚類能夠自身合成膽固醇，但外源膽固醇的添加在魚類飼料中的必要性目前存在爭議，尤其是在“不含膽固醇的植物性原料在水產(chǎn)飼料中應(yīng)用越來越廣泛”這一大背景下，在高植物性蛋白質(zhì)飼料中添加外源性膽固醇的必要性需要重新進(jìn)行系統(tǒng)的評估。目前關(guān)于魚類膽固醇營養(yǎng)需求的評估仍然僅僅局限在對魚類攝食、生長性能和體成分的關(guān)注上。然而，膽固醇作為一種重要的類脂質(zhì)及載脂蛋白的重要組成成分，其對魚體脂質(zhì)代謝的影響及相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制值得進(jìn)行深入研究。此外，膽固醇代謝的魚類種屬差異、魚類不同生長階段間膽固醇的營養(yǎng)需求差異、不同飼料原料及其他營養(yǎng)素對膽固醇代謝的影響也需要進(jìn)行進(jìn)一步評估和深入研究。此外，目前關(guān)于膽固醇代謝途徑的研究多集中于哺乳動物，相關(guān)代謝途徑在魚類中是否完全保守，也需要大量試驗(yàn)進(jìn)行科學(xué)驗(yàn)證。