王明波

(錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧 錦州 121000)

舌鱗癌是頭頸部最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率約占口腔癌 1/3～1/2，臨床治療主要以手術(shù)治療為主，以放療及化療為輔[1-3]。由于舌的淋巴管及血運(yùn)豐富，并且舌的活動(dòng)頻繁，舌癌極易發(fā)生區(qū)域淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，手術(shù)不易完全清除。化療可在一定程度上控制腫瘤的負(fù)荷量，但舌癌對(duì)化療及放療敏感性差，導(dǎo)致化療效果不佳，從而引起腫瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移[4-5]。異土木香內(nèi)酯來(lái)源于菊科旋覆花屬植物土木香的干燥根，屬多年生草本植物。異土木香內(nèi)酯(isoalantolactone，IAL)是從土木香中提取的半萜烯內(nèi)酯類小分子化合物。研究表明，異土木香內(nèi)酯能抗真菌和細(xì)菌的作用，能夠顯著抑制金黃色葡萄球菌agr二元調(diào)控系統(tǒng)，依賴性地降低金黃色葡萄球菌SEA和SEB的表達(dá)[6]。最近研究表明，異土木香內(nèi)酯也有抗腫瘤的作用，IAL可抑制膀胱癌細(xì)胞株T24細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[7]。IAL通過(guò)上調(diào)p38-MAPK來(lái)抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移侵襲[8]，IAL通過(guò)激活p53從而使人肺鱗狀癌細(xì)胞凋亡[9]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究異土木香內(nèi)酯對(duì)Tca8113細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其機(jī)制，來(lái)探討異土木香內(nèi)酯對(duì)舌癌的治療可能性。

1 實(shí)驗(yàn)材料

舌鱗癌細(xì)胞株Tca8113(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院外科重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供)，1640培養(yǎng)基(SoLarbio)，DMEM培養(yǎng)基(soLarbio)，胎牛血清(BIOIND)，胰酶(servicebio)，DMSO(SoLarbio)，CCK-8溶液(瑟?dú)W生物)，EDU試劑盒(銳博生物)，transweLL小室(NEST)，TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒(塞維爾生物)，96孔板(NEST)，離心管(NEST)。倒置顯微(UOPDSY5000X)，酶標(biāo)儀(BECKman couLter AD340)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

舌癌細(xì)胞Tca8113來(lái)源于錦州醫(yī)科大學(xué)，在-80 ℃冰箱取出復(fù)蘇后，在 37 ℃、5%CO2，進(jìn)行培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用PBS洗滌1～2遍，并用2 mL胰蛋白酶加入培養(yǎng)皿中進(jìn)行消化，將消化好的混懸液1000 rpm條件下離心5 min；按照DMSO∶胎牛血清=1∶9的比例配置細(xì)胞凍存液；棄去上清，在離心管中加入凍存液，重懸細(xì)胞；通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整懸液濃度，吸取1～1.5 mL懸液，移至凍存管中，做好標(biāo)記；將凍存管依次放入4 ℃、-20 ℃冰箱各30 min，再放入液氮內(nèi)的凍存盒里凍存。

2.2 異土木香內(nèi)酯作用于Tca8113細(xì)胞的IC50值

將用DMSO稀釋成10、20、40、80、120、160 μM的溶液待用，實(shí)驗(yàn)組為不同濃度的異土木香內(nèi)酯溶液，對(duì)照組為DMSO稀釋液，將預(yù)先制備好的細(xì)胞懸液按每孔100 μL加入96孔培養(yǎng)板，(每組6個(gè)復(fù)孔)，然后將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h(37 ℃，5% CO2)。24 h后，從培養(yǎng)箱里取出培養(yǎng)板，每孔加入10 μL不同濃度異土木香內(nèi)酯溶液和DMSO稀釋液繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后，采用CCK8試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的每個(gè)孔的吸光值，記錄測(cè)量值，測(cè)算各組細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=[1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白OD值)/(對(duì)照組OD值-空白OD值)]×100 %。

2.3 應(yīng)用CCK8法檢測(cè)異土木香內(nèi)酯對(duì)TCA8113細(xì)胞增殖能力的影響

實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組合實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組為20 μM的異土木香內(nèi)酯DMSO稀釋溶液，對(duì)照為DMSO稀釋液。將預(yù)先制備好的細(xì)胞懸液按每孔100 μL加入96孔培養(yǎng)板，(每組不少于5個(gè)復(fù)孔)，然后將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h(37 ℃，5% CO2)。24 h后，從培養(yǎng)箱里取出培養(yǎng)板，每孔加入 10 μL 待測(cè)物質(zhì)后放回培養(yǎng)箱持續(xù)孵育。分別在0、12、24、36 h，從培養(yǎng)箱里取出培養(yǎng)板，再向每孔加入10 μL CCK8工作液。再次放回培養(yǎng)箱孵育1～2 h，后拿出培養(yǎng)板用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。并記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2.4 EDU法檢測(cè)異土木香內(nèi)酯對(duì)Tca8113細(xì)胞增值力的影響

將預(yù)先制備好的細(xì)胞懸液按每孔100 μL加入96孔培養(yǎng)板，分為兩組，每組2個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)組為20 μM的異土木香內(nèi)酯DMSO稀釋溶液，對(duì)照為DMSO稀釋液。首先將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱，37 ℃，5% CO2，培養(yǎng)至正常生長(zhǎng)狀態(tài)。然后配制適量的EDU試劑，并進(jìn)標(biāo)記，經(jīng)固定染色后，在熒光顯微鏡下，觀察細(xì)胞顏色并拍照，紫外光下，細(xì)胞核全染為藍(lán)色，綠光下增殖細(xì)胞核染為紅色。

2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)異土木香內(nèi)酯對(duì)Tca8113細(xì)胞遷移能力影響實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)仍分為兩組，每組2個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)組為20 μM的異土木香內(nèi)酯DMSO稀釋溶液，對(duì)照為DMSO稀釋液。將Tca8113細(xì)胞接種于6孔板中，過(guò)夜培養(yǎng)，鋪滿底部。第2天用槍頭比著直尺，盡量垂至于背后的橫線劃痕，用PBS洗細(xì)胞3次，去處劃下的細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基。放入37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。按0、6、12、24 h，分別對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行拍照，并記錄劃痕位置及寬度。用Photoshop軟件計(jì)算劃痕前后細(xì)胞之間空白處面積差(單位：像素)，取平均值，計(jì)算遷移率。遷移率=(劃痕0 h空白處面積-劃痕后 24 h空白處面積)/劃痕0 h空白處面積。

2.6 Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)異土木香內(nèi)酯對(duì)Tca8113細(xì)胞侵襲能力影響實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)仍分為兩組，每組2個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)組為20 μM的異土木香內(nèi)酯DMSO稀釋溶液，對(duì)照為DMSO稀釋液。在培養(yǎng)瓶中加入胰酶進(jìn)行消化，調(diào)整細(xì)胞至合適密度觀察計(jì)數(shù)。24孔板中，在下室加入400 μL完全培養(yǎng)基，上室加入不含血清的細(xì)胞懸液200 μL，然后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后，用多聚甲醛固定25 min，生理鹽水清洗3次，加入結(jié)晶紫進(jìn)行染色40 min，在顯微鏡下比較兩者之間的差異性，記錄測(cè)量值，利用GraphPad軟件輔助分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.7 Tunel實(shí)驗(yàn)異土木香內(nèi)酯對(duì)Tca8113細(xì)胞凋亡的影響

實(shí)驗(yàn)仍分為兩組，每組2個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)組為20 μM的異土木香內(nèi)酯DMSO稀釋溶液，對(duì)照為 DMSO稀釋液。在24孔板上培養(yǎng)貼壁細(xì)胞。按照TμN(yùn)EL凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。處理好的樣本立即在熒光顯微鏡下分析拍照，載玻片注意避光。DAPI能將凋亡和未凋亡的細(xì)胞都染成藍(lán)色，只在凋亡的細(xì)胞核中才有CF640-dUTP摻入而定位的綠色熒光。

2.8 Western Blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

準(zhǔn)備4組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Tca8113細(xì)胞，每瓶細(xì)胞數(shù)基本保持一致，實(shí)驗(yàn)設(shè)置實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組：配制10 μM和20 μM的異土木香內(nèi)酯溶液，將配置好的異土木香內(nèi)酯溶液分別接種Tca8113細(xì)胞；同時(shí)以 0.5% DMSO 處理組作為對(duì)照濃度；空白對(duì)照組為不做任何處理的Tca8113細(xì)胞。分別提取總蛋白，采用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，經(jīng)采用SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)印、染色照相后。分別檢測(cè)舌癌細(xì)胞Tca8113的GAPDH內(nèi)參蛋白，Caspase3、Bcl-2蛋白的表達(dá)水平，來(lái)檢測(cè)異土木香內(nèi)酯對(duì)舌癌細(xì)胞的作用。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 異土木香內(nèi)酯作用于Tca8113細(xì)胞的IC50值

經(jīng)檢測(cè)，對(duì)照組、10、20、40、80、120、160 μM組的平均吸光值分別為0.451、0.285、0.224、0.235、0.221、0.235和0.274。通過(guò)與對(duì)照組比較計(jì)算，得出即 IC50值為20 μM。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，異土木香內(nèi)酯的作用濃度均為 20 μM，見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度異土木香內(nèi)酯作用于Tca8113細(xì)胞的OD值

3.2 異土木香內(nèi)酯對(duì)Tca8113細(xì)胞活力影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)CCK-8法檢測(cè)20 μM異土木香內(nèi)酯在36 h內(nèi)對(duì)Tca8113細(xì)胞活性的影響，經(jīng)檢測(cè)，隨著時(shí)間增加，實(shí)驗(yàn)組的Tca8113細(xì)胞活性逐漸降低，見(jiàn)圖2。

*P<0.05

3.3 異土木香內(nèi)酯對(duì) Tca8113 細(xì)胞克隆形成能力影響實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在7 d內(nèi)，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的克隆數(shù)明顯減少。20 μM異土木香內(nèi)酯對(duì)Tca8113細(xì)胞增殖能力具有明顯的抑制作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖3。

***P<0.001

3.4 異土木香內(nèi)酯對(duì)Tca8113細(xì)胞增殖力影響實(shí)驗(yàn)

EDU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)證明：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比增殖能力明顯減弱，以P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果提示，20 μM異土木香內(nèi)酯對(duì)Tca8113細(xì)胞增殖能力具有抑制作用，見(jiàn)圖4。

**P<0.01

3.5 異土木香內(nèi)酯對(duì)Tca8113 細(xì)胞遷移能力影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，Tca8113細(xì)胞爬行距離變小，以P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明細(xì)胞遷移能力明顯減小，見(jiàn)圖5，遷移率見(jiàn)表1。說(shuō)明20 μM的異土木香內(nèi)酯對(duì)Tca8113細(xì)胞遷移能力具有抑制作用。

圖5 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組劃痕實(shí)驗(yàn)0 h與24 h比較

表1 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞遷移率比較

**P<0.01

3.6 異土木香內(nèi)酯對(duì)Tca8113細(xì)胞侵襲能力影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Transwell實(shí)驗(yàn)表明，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，侵襲能力明顯減弱，以P<0.01為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。如圖7所示，表明異土木香內(nèi)酯對(duì)Tca8113細(xì)胞侵襲能力具有抑制作用。

3.7 異土木香內(nèi)酯對(duì)Tca8113細(xì)胞凋亡影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tunel實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，Tca8113細(xì)胞凋亡明顯增多，以P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明20 μM異土木香內(nèi)酯對(duì)Tca8113細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用，見(jiàn)圖8。

**P<0.01

**P<0.01

3.8 Western Blot

結(jié)果表明，不同處理組的內(nèi)參蛋白GAPDH的表達(dá)水平無(wú)差異，表明其幾乎不受其他因素影響，可以作為內(nèi)參得到每個(gè)樣品的相對(duì)含量。與對(duì)照組相比，異土木香內(nèi)酯組的抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低，而促凋亡蛋白Caspase-3活性水平均顯著增加，與濃度呈正相關(guān)，以P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖9。

圖9 Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖

近年來(lái)，舌癌的發(fā)生率有上升的趨勢(shì)，且其惡性程度較高，生長(zhǎng)快，浸潤(rùn)性強(qiáng)。舌癌晚期波及口底、下頌骨，向后侵及腭舌弓及扁桃體；侵及舌根部或伴繼發(fā)感染時(shí)發(fā)生劇烈疼痛。對(duì)于惡性舌癌的治療以手術(shù)為主聯(lián)合其他治療方法，根據(jù)患者的具體情況來(lái)實(shí)施治療方案。一般來(lái)說(shuō)，手術(shù)切除原發(fā)病灶，手術(shù)解決的是局部病灶及手術(shù)可涉及范圍內(nèi)的病灶，但對(duì)于已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病例的治療或在預(yù)防復(fù)發(fā)方面是無(wú)能為力的，這時(shí)依靠化學(xué)藥物治療或生物治療具有一定的療效。另外，利用中藥治療配合手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)治療可起到很好的治療效果，因?yàn)橹兴幹委熌芴岣呙庖吖δ?，從而起到提高和鞏固療效的作用。已有研究?jīng)證實(shí)，有數(shù)百種中藥材具有抑制腫瘤癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，諸如百安、參陽(yáng)、苗藍(lán)、黃寄素、清瘤亮喉等在體外實(shí)驗(yàn)研究、治療或輔助治療口腔鱗癌中，均顯示出了明顯的殺腫瘤作用[10-13]。本研究對(duì)異土木香內(nèi)酯對(duì)舌癌Tca8113細(xì)胞的影響及其可能的產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用的機(jī)制進(jìn)行了探討，本研究中采用CCK-8法測(cè)出異土木香內(nèi)酯對(duì)Tca8113細(xì)胞 IC50值為20 μM，且在36 h內(nèi)，異土木香內(nèi)酯對(duì)Tca8113細(xì)胞活性具有明顯的抑制作用。已有研究表明異土木香內(nèi)酯對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞的IC50值為22.45 μmol/L[14]。通過(guò)EDU實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，20 μM的異土木香內(nèi)酯可以抑制舌癌Tca8113細(xì)胞增殖，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明異土木香內(nèi)酯可能在治療舌癌中具有潛在的可能性。癌細(xì)胞遷移和侵襲是發(fā)生癌轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)[15]，本實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明0 μM的異土木香內(nèi)酯可以有效的抑制舌癌Tca8113細(xì)胞的遷移和侵襲。Tunnel實(shí)驗(yàn)證明其可以誘導(dǎo)Tca8113細(xì)胞凋亡。其可能原因是其可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝通路。有文獻(xiàn)報(bào)道，異土木香內(nèi)酯可以通過(guò)上調(diào)p38-MAPK誘導(dǎo)胰腺癌PANC-1細(xì)胞凋亡[16-18]和抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移侵襲[19]，激活p53來(lái)誘導(dǎo)人肺鱗狀癌細(xì)胞凋亡，還有文獻(xiàn)報(bào)道其通過(guò)增加ROS誘導(dǎo)前列腺癌PC3細(xì)胞凋亡[20-22]。

綜上所述，異土木香內(nèi)酯對(duì)舌癌細(xì)胞具有抑制作用，但是其作用機(jī)制還需要進(jìn)步研究。發(fā)現(xiàn)其在舌癌臨床應(yīng)用前景及價(jià)值。

4 討 論

本研究對(duì)異土木香內(nèi)酯對(duì)舌癌Tca8113細(xì)胞的影響及其可能的產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用的機(jī)制進(jìn)行了探討。研究中通過(guò)CCK8實(shí)驗(yàn)，對(duì)異土木香內(nèi)酯的體外藥效做了初步研究，以舌癌Tca8113 細(xì)胞為研究對(duì)象，研究異土木香內(nèi)酯對(duì)舌癌Tca8113細(xì)胞的抑制作用，CCK8結(jié)果顯示，在孵育時(shí)間為24 h內(nèi)，異土木香內(nèi)酯對(duì)舌癌Tca8113細(xì)胞的IC50值為20 μM，在0～20 μM 濃度范圍，隨著濃度增加，抑制作用增強(qiáng)，但是濃度范圍為20～80 μM，抑制作用增強(qiáng)效果不明顯。克隆形成實(shí)驗(yàn)和EDU實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了20 μM 異土木香內(nèi)酯可以抑制舌癌Tca8113細(xì)胞增殖，同時(shí)抑制細(xì)胞克隆形成。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明20 μM的異土木香內(nèi)酯可以有效的抑制舌癌Tca8113細(xì)胞的遷移和侵襲。但具體機(jī)制不明確，因此需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。本研究中通過(guò)Tunnel實(shí)驗(yàn)和Western Blot實(shí)驗(yàn)證明，異土木香內(nèi)酯可以誘導(dǎo)Tca8113 細(xì)胞凋亡?？赡茉蚴瞧淇梢哉{(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝通路。

綜上所述，異土木香內(nèi)酯能抑制舌鱗癌 Tca8113細(xì)胞的增殖、遷移侵襲并促進(jìn)Tca8113細(xì)胞凋亡，并呈一定濃度時(shí)間依賴性。但具體機(jī)制不明確，因此需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。