李云霞，劉旭梅，王 寧，周 娜，劉建芳，王文習(xí)

桃紅丸為我院開發(fā)的非標(biāo)準(zhǔn)制劑(制劑許可證號(hào)：總制字2016F202004)，具有活血化瘀、調(diào)經(jīng)止痛的功效，在治療關(guān)節(jié)炎、月經(jīng)不調(diào)、冠心病、皮膚色斑方面療效顯著[1-4]。桃紅丸由桃仁、紅花、當(dāng)歸、川芎、赤芍等9味藥組成，其中桃仁、紅花為君藥，是活血化瘀方劑中的經(jīng)典組合。桃仁中主要含有各種脂肪酸、不飽和脂肪酸、甾醇及糖苷類，黃酮類化合物等[5]；紅花主要含色素、黃酮類化合物，生物堿類，其中羥基紅花黃色為最主要的有效成分[6-9]；當(dāng)歸、川芎、赤芍為臣藥，主要的有效化學(xué)成分有芍藥苷和阿魏酸、川芎內(nèi)酯等[10]。由于處方中含有原藥材粉末，現(xiàn)有的滅菌工藝有時(shí)不能達(dá)到微生物限度檢查要求，需要60Co-γ輻照滅菌處理。

20世紀(jì)70年代以來，60Co-γ輻照滅菌在全世界廣泛展開，由于其穿透力強(qiáng)、使用方便、省時(shí)省力、價(jià)廉、節(jié)能等特點(diǎn)，且在常溫下就可達(dá)到理想的滅菌效果[11-13]。近年來輻照滅菌技術(shù)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥食品行業(yè)、農(nóng)業(yè)、工業(yè)生產(chǎn)等，中藥制劑領(lǐng)域也開始普遍使用60Co-γ射線輻照滅菌[14-19]，尤其是對(duì)易揮發(fā)、熱敏感的中藥材及蜜丸的滅菌，更能體現(xiàn)出其優(yōu)越性[20]。本研究通過建立輻照前后桃紅丸的高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜，同時(shí)選取測(cè)定該制劑中的3種有效成分羥基紅花黃色素A、芍藥苷和阿魏酸在輻照前后的含量變化，考察輻射滅菌對(duì)桃紅丸的影響，為輻照滅菌技術(shù)在中藥制劑中應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 儀器與試藥

1.1試驗(yàn)儀器 安捷倫1100高效液相色譜儀(G1322型在線脫氣機(jī)、G1311A型二元泵、G1313A型自動(dòng)進(jìn)樣器、G1315B二極管陣列檢測(cè)器、A.08化學(xué)工作站，美國(guó)Agilent公司)，BT214D型、BT125D型分析天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，雷磁PHS-3C型酸度計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)，KQ-250B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試驗(yàn)藥品 乙腈為色譜純(天津市康科德科技有限公司)；85%磷酸；甲醇為分析純；水為超純水。阿魏酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110773-201313；純度以99.6%計(jì))；芍藥苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110736-200630，純度以95.7%計(jì))；羥基紅花黃色素A對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111637-301308)。桃紅丸(批號(hào)：20180320)，桃紅丸(批號(hào)：20180320，輻照劑量8 kGy)。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱為Shimadzu VP-ODS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫為室溫，流速1 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm。以乙腈為流動(dòng)相A，磷酸溶液(pH 2.6)為流動(dòng)相B，梯度洗脫(0～20 min，95%～78% B；20～35 min，78%～70% B；35～45 min，70%～60% B；45～50 min，60%～25% B；50～51 min，25%～95% B)；平衡時(shí)間為10 min；進(jìn)樣量為20 μl。

2.2溶液制備

2.2.1對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備：精密稱定羥基紅花黃色素A、阿魏酸對(duì)照品各約10 mg，分別置100 ml量瓶中，精密稱定芍藥苷對(duì)照品約25 mg，置25 ml量瓶中，分別加入適量50%甲醇，超聲處理2 min使其溶解，放至室溫，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，獲得每1 ml含羥基紅花黃色素0.1 mg、阿魏酸0.1 mg和芍藥苷1 mg的單一成分對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.2混合對(duì)照品溶液的制備：精密量取羥基紅花黃色素A對(duì)照品儲(chǔ)備液1 ml、阿魏酸對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5 ml和芍藥苷對(duì)照品儲(chǔ)備液1 ml，置10 ml量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3供試品溶液的制備：取桃紅丸細(xì)粉約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇液30 ml，稱定重量，超聲處理8 min，放至室溫，加50%甲醇液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，放置，上清液用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1專屬性試驗(yàn)：取空白溶劑(50%甲醇)和對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，見圖1。由圖可知，空白溶劑不干擾測(cè)定。

圖1 空白溶劑、對(duì)照品溶液和供試品溶液的指紋圖譜

2.3.2線性與范圍：取各對(duì)照品儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋成系列濃度的對(duì)照品溶液進(jìn)行分析，記錄3種對(duì)照品的色譜峰面積，以各指標(biāo)成分的濃度(X，μg/ml)為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積A為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。見表1。結(jié)果表明3個(gè)指標(biāo)成分在所測(cè)定的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系較好。

表1 桃紅丸三種成分的線性與范圍(n=5)

2.3.3精密度試驗(yàn)：取混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄3個(gè)組分的峰面積。羥基紅花黃色素A、芍藥苷和阿魏酸峰面積的RSD值分別為1.5%、0.6%、1.9%。結(jié)果表明儀器的精密度良好。

2.3.4重復(fù)性試驗(yàn)：平行制備6份供試品溶液，進(jìn)行分析，記錄指紋圖譜。記錄供試品中各指標(biāo)成分相應(yīng)的峰面積，計(jì)算其含量，并將6次測(cè)定結(jié)果的RSD用于考察方法的重復(fù)性。供試品溶液中羥基紅花黃色素A、芍藥苷和阿魏酸3個(gè)指標(biāo)成分含量的RSD值分別為2.0%、2.6%和2.7%。結(jié)果表明該方法的重復(fù)性較好。

2.3.5回收率試驗(yàn)：精密稱定桃紅丸細(xì)粉約0.5 g，共6份，分別置具塞錐形瓶中，每個(gè)錐形瓶中分別加入羥基紅花黃色素A對(duì)照品儲(chǔ)備液2.5 ml、芍藥苷對(duì)照品儲(chǔ)備液1.5 ml和阿魏酸對(duì)照品儲(chǔ)備液2.5 ml，再精密加入50%甲醇至30 ml，稱定重量，按“2.2.3供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法配制輻照后的供試品溶液，進(jìn)行分析，記錄指紋圖譜。根據(jù)回收率=(測(cè)得量-樣本含量)/加入量×100%計(jì)算3個(gè)指標(biāo)成分的回收率。見表2。

表2 加樣回收率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.3.6穩(wěn)定性試驗(yàn)：取輻照后桃紅丸的供試品溶液，分別于0、3、6、9、24 h進(jìn)樣，記錄色譜圖。計(jì)算三個(gè)指標(biāo)成分相應(yīng)峰面積的RSD值以考察該溶液的穩(wěn)定性。羥基紅花黃色素A、芍藥苷和阿魏酸的峰面積的RSD值分別為1.5%、1.7%和2.1%。結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.4供試品含量測(cè)定 取輻照前與輻照后的供試品溶液和混合對(duì)照品溶液進(jìn)行分析，并記錄色譜圖。采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算供試品中3個(gè)組分的含量。測(cè)得供試品中羥基紅花黃色素A、芍藥苷和阿魏酸輻照前的含量分別為0.5582 mg/g、3.1050 mg/g、0.4589 mg/g；供試品中羥基紅花黃色素A、芍藥苷和阿魏酸輻照后的含量分別為0.5526 mg/g、3.1180mg/g、0.4625mg/g，輻照后含量無明顯變化。

2.5相似度分析

2.5.1供試品對(duì)照指紋圖譜的建立：取輻照前桃紅丸細(xì)粉，制備供試品溶液，進(jìn)行分析，記錄指紋圖譜。

2.5.2指紋圖譜分析：取輻照后桃紅丸細(xì)粉制備8份供試品溶液，分別進(jìn)樣，測(cè)定供試品的指紋圖譜。

2.5.3相似度分析：采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》研究版(2004A)對(duì)輻照前后的指紋圖譜進(jìn)行分析，以輻照前樣品的色譜圖為參照?qǐng)D譜，采用多點(diǎn)校正，用中位數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜和指紋圖譜。見圖2。處理數(shù)據(jù)，計(jì)算相似度，相似度均≥0.999。相似度計(jì)算結(jié)果可以看出輻照前后桃紅丸的含量變化并無顯著差異。

圖2 桃紅丸對(duì)照指紋圖譜和供試品指紋圖譜

3 討論

本研究結(jié)果顯示，所建立的指紋圖譜方法驗(yàn)證結(jié)果良好，能夠滿足桃紅丸輻照前后主要成分含量變化。輻照前后，桃紅丸中羥基紅花黃色素A、芍藥苷和阿魏酸的含量均沒有顯著變化；輻照前后指紋圖譜的相似度很高，沒有峰個(gè)數(shù)的增加或缺失。實(shí)驗(yàn)過程對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行了考察，采用DAD全波長(zhǎng)掃描檢測(cè)器，在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，分別在230、254、320、403 nm處對(duì)整個(gè)圖譜進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)230 nm處下各成分具有較好的紫外吸收，出峰數(shù)目相對(duì)較多，各色譜峰峰形及分離效果相對(duì)較好，且基線較為平穩(wěn)，故選擇230 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

該實(shí)驗(yàn)分別對(duì)體積分?jǐn)?shù)為50%甲醇、甲醇、50%乙醇及乙醇為提取溶劑進(jìn)行了考察，經(jīng)過對(duì)比峰形、響應(yīng)值、峰分離情況，甲醇的提取效果更好一點(diǎn)。隨后又對(duì)體積分?jǐn)?shù)為75%甲醇、50%甲醇、25%甲醇和水作了進(jìn)一步考察，經(jīng)過比較，最后選擇體積分?jǐn)?shù)為50%甲醇為提取溶劑。

該實(shí)驗(yàn)過程還對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了優(yōu)選，首先選擇甲醇-水進(jìn)行考察，提取溶劑為體積分?jǐn)?shù)為50%甲醇，進(jìn)行指紋圖譜的分析，但峰分離不好，基線上漂。隨后又考察了甲醇-磷酸溶液(pH 2.6)、甲醇-磷酸溶液(pH 4)、甲醇-0.5%乙酸、甲醇-1%乙酸、甲醇-KH2PO4溶液(磷酸調(diào)至pH 4)、甲醇-KH2PO4溶液(30 mmol/L，pH3)、乙腈-水、乙腈-磷酸溶液(pH 2.6)等流動(dòng)相體系，以色譜峰基線的平穩(wěn)情況、指標(biāo)成分的峰形以及分離效果為目標(biāo)，最佳的流動(dòng)相為乙腈-磷酸溶液(pH 2.6)。

綜上所述，通過高效液相色譜法結(jié)合多指標(biāo)定量測(cè)定法測(cè)定桃紅丸較為可靠，該方法比較全面地反映了桃紅丸的含量變化，可為其質(zhì)量控制提供較為可靠的科學(xué)依據(jù)。