谷俊謀， 王立博， 曾德俊， 陸勤偉， 董 凱， 梁若鵬， 王維杰， 朱榮濤， 孫玉嶺,2,3

1 鄭州大學第一附屬醫(yī)院 肝膽胰外科， 鄭州 450052； 2 鄭州大學 肝膽胰疾病研究所， 鄭州 450052；

3 鄭州市肝膽胰疾病基礎(chǔ)與臨床研究重點實驗室， 鄭州 450052

原發(fā)性肝癌是一種常見的惡性腫瘤，具有起病隱匿、進展迅速、惡性程度高、治療難度大等特點[1]。索拉非尼作為晚期肝癌的一線治療藥物，能有效延長大多數(shù)患者的生存期[2]。但是，對于一些耐藥的患者，索拉非尼很難取得良好的成效。安羅替尼是一種新型小分子多靶點酪氨酸激酶抑制劑，能有效抑制血管內(nèi)皮細胞生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)、Met等激酶，可以抑制腫瘤及其血管的生成和生長[3]。目前包括非小細胞肺癌、結(jié)直腸癌等多種癌癥的臨床試驗正在開展[4]。通過與其他酪氨酸激酶進行比較發(fā)現(xiàn),安羅替尼對VEGFR2的抑制作用顯示出極高的選擇性[5]。但是安羅替尼在肝癌中的研究目前較少，尤其是關(guān)于其耐藥方面的研究更是少有報道。本研究主要通過培養(yǎng)建立對安羅替尼耐藥的肝癌細胞并通過ceRNA芯片進行比較，最后篩選出可能存在的與耐藥相關(guān)的mRNA。為今后的臨床和科研工作提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細胞Huh7購自美國模式菌種收集中心；安羅替尼試劑購自正大天晴藥業(yè)集團；CCK8試劑盒購自日本同仁公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶均購自GIBCO公司；引物由擎科生物公司合成；培養(yǎng)細胞總RNA提取試劑盒購自百序生物科技有限公司；細胞裂解液購自碧云天生物科技有限公司；SBC Human (4*180K) ceRNA芯片購自上海伯豪生物有限公司；PrimeScriptTMRT Reagent Kit購自日本TAKARA公司；2X PowerUp SYBR Green Master Mix購自武漢塞維爾科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)細胞 以45 ml DMEM培養(yǎng)液中添加5 ml FBS和溶于50 μl DMSO中不同濃度的安羅替尼為培養(yǎng)液；細胞置于37 ℃、5%CO2、85%～90%濕度的恒溫培養(yǎng)箱中。每天至少觀察細胞1次，當細胞生長狀態(tài)良好、密度達到90%時進行傳代。

1.2.2 Huh7耐藥細胞的建立 采用大劑量沖擊聯(lián)合低劑量誘導(dǎo)的方法篩選耐藥細胞，取處于對數(shù)期的人肝癌細胞Huh7置于終濃度為0.5 μmol/L安羅替尼的DMEM完全培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)。密切觀察1 d，若細胞狀態(tài)不好，及時更換成不含安羅替尼的DMEM完全培養(yǎng)液來調(diào)整細胞的狀態(tài)。若細胞狀態(tài)好則常規(guī)更換培養(yǎng)液，正常消化傳代，當細胞完全適應(yīng)后，將細胞置于2 μmol/L 安羅替尼的DMEM完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h來進行大劑量沖擊。逐步提升藥物濃度，直至Huh7細胞可以在藥物濃度為6 μmol/L的DMEM完全培養(yǎng)液中可以正常增殖傳代，并且在不添加藥物培養(yǎng)2周后，仍可以在藥物濃度為6 μmol/L的DMEM完全培養(yǎng)液中正常增殖傳代，經(jīng)過6個月的培養(yǎng)，獲得對安羅替尼耐藥的細胞Huh7/R，并將其維持在含2 μmol/L的安羅替尼培養(yǎng)液中。

1.2.3 CCK8細胞增殖實驗 取消化好的處于對數(shù)期的肝癌細胞Huh7和Huh7/R，調(diào)整細胞濃度為3×104～5×104/ ml，向96孔板內(nèi)每孔加入100 μl細胞懸液。設(shè)置空白組、對照組與實驗組，每組設(shè)置5個復(fù)孔；邊緣用PBS填充；于空白組與對照組中加入100 μl不含安羅替尼的培養(yǎng)液，實驗組分別加入100 μl不同濃度安羅替尼的培養(yǎng)液；1～2 h后，取出96孔板置于全自動酶標儀中，測定450 nm光吸收值；測出的對照組吸收值以接近1最為理想；根據(jù)每孔所得的光密度值來計算增殖抑制率；增殖抑制率=(對照組OD-實驗組OD)/(對照組OD-空白組OD)×100%。

1.2.4 ceRNA芯片篩選差異基因 采用試劑盒的操作步驟對正常肝癌細胞Huh7和耐藥肝癌細胞Huh7/R進行RNA的初步提??；對提取的RNA進行純化；純化后的RNA進行反轉(zhuǎn)錄和熒光標記；對雜交后的芯片進行洗滌和掃描；對差異的mRNA進行Go和KEGG pathway富集分析。

1.2.5 實時熒光定量(real-time PCR)反應(yīng) 用RNA提取試劑盒對處于對數(shù)期的正常肝癌細胞株Huh7和耐藥肝癌細胞株Huh7/R進行RNA的提取。按照PrimeScriptTMRT Reagent Kit說明書將RNA進行反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以GADPH作為內(nèi)參，按照2X PowerUp SYBR Green Master Mix說明書進行real-time PCR反應(yīng)，條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，而后進行40個循環(huán)(95 ℃ 15 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s)。引物序列5′-3′：BIRC2(上游引物-CATAGTAGCTTGTTCAGTGGT，下游引物-CTCTAGAATTAAGAGGGTTTGGAG)，ABCC2(上游引物-GGACACTCTTACAGGGTGAC，下游引物-GGATCAGGATCTGGAATCCG)，MAPK8(上游引物-GATGTTTACATAGTCATGGAGCTC，下游引物-TACTGGGCTTTAAGTCCCG)，BIRC7(上游引物-CTCCTTCTATGACTGGCCG，下游引物-CCTCACCTTGTCCTGATGG)，GADPH(上游引物-TCAAGATCATCAGCAATGCC，下游引物-CGATACCAAAGTTGTCATGGA)。

2 結(jié)果

2.1 肝癌細胞的抑制率 正常肝癌細胞24 h的IC50為(2.99±0.93)μmol/L，耐藥肝癌細胞的24 h IC50為(27.85±1.42)μmol/L。通過公式：耐藥指數(shù)=耐藥細胞IC50/親本細胞的IC50，計算出耐藥肝癌細胞相對于正常肝癌細胞對安羅替尼的耐藥指數(shù)為9.31(圖1)。

2.2 差異mRNA的篩選 芯片的數(shù)據(jù)來自R/bioconductor的數(shù)據(jù)包clusterProfiler，使用Fisher精確檢驗，篩選標準為term/GO上差異的基因數(shù)目不小于2，P<0.05。研究發(fā)現(xiàn)共有2790個差異mRNA，其中上調(diào)mRNA有611個，下調(diào)mRNA有2179個(圖2)。

圖1 CCK8法檢測安羅替尼對Huh7和Huh7/R的抑制作用

圖2 差異mRNA熱圖見二維碼

2.3 Go和KEGG pathway分析 通過分析term/GO發(fā)現(xiàn)差異基因分布最多的3個基因集為cell、cell part和cellular progress(圖3)。KEGG中基因改變最多的通路為信號傳導(dǎo)通路(圖4)。

圖3 正常肝癌細胞與耐藥肝癌細胞差異基因的GO富集分析圖

圖4 正常肝癌細胞與耐藥肝癌細胞差異基因的KEGG pathway分析圖

2.4 前10個差異mRNA 通過縮減P值篩選出10個差異最大的基因分別為BIRC2、BIRC7、ABCC2、MAPK8、MAP2K6、SERPING1、MX1、RPP30、UTP14A、KLHL13。通過文獻檢索，發(fā)現(xiàn)有4個基因可能與耐藥有關(guān)，分別是：BIRC2、BIRC7、ABCC2、MAPK8。其中BIRC2、ABCC2、MAPK8表達水平下降(P值分別為0.0014、0.0012、0.011 8)，BIRC7的表達水平增加(P<0.001)。

2.5 real-time PCR驗證差異表達mRNA 利用傳統(tǒng)的real-time PCR對這BIRC2、BIRC7、ABCC2、MAPK8 4個mRNA進行了再次驗證，并通過GraphPad Prism 8軟件進行處理，結(jié)論與芯片一致(t值分別為10.74、32.65、18.34、2.80，P值分別為0.000 4、0.000 1、0.000 1、0.044 8)(圖5)。

注：a,BIRC2;b,ABCC2;c,MAPK8；d.BIRC7。

2.6 生存分析 對4個差異最大的mRNA進行生存分析，其中BIRC7的高表達與MAPK8的低表達對應(yīng)顯著減少的累積生存率(P值分別為0.022 0、0.005 6)(圖6)。

注：a,BIRC2; b，ABCC2; c,MAPK8； d,BIRC7。

3 討論

肝癌治療方法主要有肝切除術(shù)、肝移植、局部射頻消融術(shù)、經(jīng)肝動脈化療栓塞術(shù)(TACE)、放療和系統(tǒng)治療等[6]。但是由于肝癌起病隱匿，很多患者發(fā)現(xiàn)時已處于肝癌晚期。安羅替尼作為一種新型的小分子酪氨酸激酶抑制劑，目前有研究[7-9]表明原發(fā)性肝癌患者在TACE術(shù)后行安羅替尼治療安全有效，并且不良反應(yīng)可以耐受，這為患者帶來了新的希望。然而，一旦出現(xiàn)安羅替尼耐藥，晚期患者的治療將面臨更大的困難。

本研究通過大劑量沖擊聯(lián)合低劑量誘導(dǎo)的方法成功培養(yǎng)出對安羅替尼耐藥的肝癌細胞，并通過ceRNA芯片對耐藥肝癌細胞與正常肝癌細胞進行測序比較發(fā)現(xiàn)共有差異mRNA 2790個，其中上調(diào)mRNA有611個，下調(diào)mRNA有2179個。通過Go和KEGG pathway分析發(fā)現(xiàn)，差異mRNA分布最多的3個基因集為cell、cell part和cellular progres，KEGG中基因改變最多的通路為信號傳導(dǎo)通路。通過縮小P值篩選出差異性較大的10個mRNA中有4個mRNA與耐藥和細胞生長與死亡有關(guān)，分別為BIRC7、BIRC2、ABCC2、MAPK8。

桿狀病毒IAP重復(fù)序列7(BIRC7)是最近發(fā)現(xiàn)的一個凋亡抑制蛋白家族成員。BIRC7的過表達與凋亡、化療和放療抵抗力增加、腫瘤復(fù)發(fā)和患者生存率下降有關(guān)[10-11]。桿狀病毒IAP重復(fù)序列2(BIRC2)與BIRC7同屬凋亡抑制蛋白家族。在NF-κB的調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用[12-13]，同時，抗凋亡基因BIRC2和BIRC3是潛在的致癌基因染色體9A1擴增子的驅(qū)動因子，可以增強腫瘤細胞的活性并抑制其凋亡[14]。有研究[15]表明BIRC2不僅可以抑制HIV1的轉(zhuǎn)錄，還可被Smac模擬物靶向作用以促進病毒潛伏期的逆轉(zhuǎn)。ABCC2包含32個外顯子，其中4個主要在肝臟中表達[16-17]，與Dubin-Johnson綜合征和遺傳性膽汁淤積性疾病有密切關(guān)系。研究[18]表明ABCC2與苯妥英鈉、卡馬西平、丙戊酸鈉、拉莫三嗪、托吡酯和左乙拉西坦等抗癲癇藥物的耐藥機制相關(guān)。MAPK8，也稱為c-Jun N末端激酶，是MAPK8家族中的一員[19]，可以通過MAPK信號通路介導(dǎo)對替莫唑胺的抗性和膠質(zhì)母細胞瘤細胞凋亡[20]。

綜上所述，通過分析安羅替尼耐藥的肝癌細胞與正常肝癌細胞的基因表達差異，從中篩選出了10個差異最大的mRNA，進一步研究發(fā)現(xiàn)，在耐藥細胞中BIRC2、ABCC2、MAPK8表達水平下降，而BIRC7的表達水平增加；其中BIRC7高表達以及MAPK8低表達均與肝癌患者的生存率降低相關(guān)，而BIRC2與ABCC2的表達水平與肝癌患者生存率沒有顯著相關(guān)性，這對以后的實驗和臨床工作存在一定的借鑒意義。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻聲明：谷俊謀負責課題設(shè)計，資料分析，撰寫論文；王立博、曾德俊、陸勤偉、董凱、梁若鵬、王維杰、朱榮濤參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；孫玉嶺負責擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。