康曼，韓建榮

（1.桂林醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 541199；2.山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

0 引言

雙孢蘑菇（Agaricusbisporus），亦稱洋菇、雙孢菇、白蘑菇等，其在分類(lèi)上屬真菌門(mén)（Eumycota），擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes），傘菌目（Agaricales），傘菌科（Agaricaceae），蘑菇屬（Agaricus）。雙孢蘑菇是全球產(chǎn)量最高、栽培最廣的食藥用菌之一，其美味可口、營(yíng)養(yǎng)豐富［1］，且具有抗腫瘤、抗炎、降血糖及降低膽固醇等作用［2-8］。

從野生雙孢蘑菇報(bào)道來(lái)看，我國(guó)分布的野生雙孢蘑菇主要為白色和棕色兩種，主要分布在新疆、安徽、西藏、四川、山西等地［9-14］。

本實(shí)驗(yàn)室在山西省太原市小店區(qū)分離得到一株白色野生雙孢蘑菇G1菌株［15-16］。初步研究發(fā)現(xiàn)，與一般雙孢蘑菇相比，G1菌株可以在無(wú)菌瓊脂培養(yǎng)基和麥粒培養(yǎng)基上形成大量原基，且原基最終能發(fā)育為結(jié)構(gòu)完整的子實(shí)體［17］。經(jīng)文獻(xiàn)查閱，未見(jiàn)其他雙孢蘑菇有此特性報(bào)道，所以G1菌株是一個(gè)比較理想的研究雙孢蘑菇原基及子實(shí)體分化機(jī)理的菌株。我國(guó)野生雙孢蘑菇資源比較匱乏，為了開(kāi)發(fā)利用該野生資源，本文進(jìn)行了G1菌株的馴化栽培研究，包括母種培養(yǎng)基、原種培養(yǎng)基和栽培料的篩選，可為雙孢蘑菇G1菌株的開(kāi)發(fā)利用和后期規(guī)?；耘嗵峁┛茖W(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

野生雙孢蘑菇G1菌株采自山西省太原市小店區(qū)黃陵村附近菜地，經(jīng)組織分離法得到純菌株，保存于馬糞瓊脂斜面上，標(biāo)本現(xiàn)保存于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，菌株編號(hào)2016011。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 母種培養(yǎng)基

A玉米粉蔗糖培養(yǎng)基：玉米粉40 g、蔗糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL、pH自然；

B麥粒煮汁培養(yǎng)基I：麥粒200 g、蛋白胨2 g、MgSO41.5 g、KH2PO41 g、瓊脂 20 g、蒸餾水 1 000 mL、pH自然；

C馬鈴薯半合成培養(yǎng)基I：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、KH2PO43 g、MgSO41.5 g、維生素 B110 mg、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL、pH 6.0；

D麥粒煮汁培養(yǎng)基II：麥粒100 g、蛋白胨2 g、MgSO41.5 g、KH2PO41 g、瓊脂 20 g、蒸餾水 1 000 mL、pH自然；

E馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL、pH自然；

F葡萄糖＋麥芽糖＋酵母膏培養(yǎng)基：葡萄糖10 g、麥芽膏 10 g、酵母膏 4 g、瓊脂 20 g、蒸餾水 1 000 mL、pH自然；

G馬糞培養(yǎng)基：干馬糞150 g、蔗糖50 g、瓊脂20 g、石膏20 g、蒸餾水1 000 mL、pH自然；

H麩皮培養(yǎng)基：麩皮150 g、蔗糖50 g、瓊脂20 g、石膏20 g、蒸餾水1 000 mL、pH自然；

I合成培養(yǎng)基：葡萄糖10 g、瓊脂20 g、CaCO32 g、KH2PO40.5 g、NaCl 0.2 g、酵母汁 100 mL（1∶10）、MgSO40.2 g、蒸餾水900 mL、pH自然。

上述培養(yǎng)基按配方制備后于121.3℃，滅菌20 min后備用。

1.2.2 原種培養(yǎng)基

麥粒培養(yǎng)基：取新鮮、無(wú)霉變麥粒，清洗干凈于沸水中煮0.5 h，攤晾后裝于罐頭瓶中，使含水量為40%左右，每瓶裝量200 g；

小米培養(yǎng)基：取新鮮、無(wú)霉變的小米，溫水浸泡0.5 h后，攤晾，其余制作方法同麥粒培養(yǎng)基；

玉米培養(yǎng)基：取新鮮、無(wú)霉變的玉米，溫水浸泡2 h～3 h后，攤晾，其余制作方法同麥粒培養(yǎng)基；

棉籽殼木屑培養(yǎng)基（下文中所有%都代表質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：棉籽殼80%、木屑12%、麩皮5%、葡萄糖1%、石膏1%、過(guò)磷酸鈣1%。稱取各組分，攪拌，加水，調(diào)節(jié)含水量為65%，裝瓶；

棉籽殼麥麩培養(yǎng)基：棉籽殼87%、麥麩10%、過(guò)磷酸鈣1%、葡萄糖1%、石膏1%。稱取各組分，攪拌，加水，調(diào)節(jié)含水量為65%，裝瓶；

糞草培養(yǎng)基：玉米稈70%、干牛糞20%、豆餅7.5%、過(guò)磷酸鈣1%、石膏粉1%、尿素0.5%，采用常規(guī)方法堆制發(fā)酵［1］后，裝瓶。

上述原種培養(yǎng)基按配方制備后于121.3℃，滅菌60 min后備用。

1.3 栽培料

1.3.1 栽培料配方

配方1（稻草栽培料）：稻草80%、麥麩12%、牛糞5%、蔗糖1%、石膏1%、KH2PO41%；

配方2（玉米芯栽培料）：玉米芯80%、麥麩12%、牛糞5%、蔗糖1%、石膏1%、KH2PO41%；

配方3（玉米秸稈栽培料）：玉米秸桿80%、麥麩12%、牛糞5%、蔗糖1%、石膏1%、KH2PO41%；

配方4（棉籽殼栽培料）：棉籽殼80%、麥麩12%、牛糞5%、蔗糖1%、石膏1%、KH2PO41%；

配方5（木屑栽培料）：木屑70%、麥麩22%、牛糞5%、蔗糖1%、石膏1%、KH2PO41%；

配方6（玉米秸稈牛糞栽培料）：玉米秸稈70%、干牛糞20%、豆餅7.5%、過(guò)磷酸鈣1%、石膏1%、尿素0.5%；

配方7（馬糞稻草栽培料）：干馬糞56%、稻草40%、硫酸銨 1%、尿素 1%、石膏 1%、過(guò)磷酸鈣1%。

上述栽培料按配方制備后，121.3℃滅菌120 min后備用。

1.3.2 栽培料制作方法

配方1—5制作方法：稻草、玉米秸桿、玉米芯預(yù)先粉碎為直徑約1 cm碎塊，分別將各主料（稻草、玉米秸桿、玉米芯、棉籽殼、木屑）浸泡于自來(lái)水中，過(guò)夜，瀝干水分，按比例加入麥麩、牛糞、蔗糖、石膏、KH2PO4，拌勻，調(diào)節(jié)含水量為65%。配方6玉米秸稈牛糞栽培料采用常規(guī)方法［1］堆制發(fā)酵。配方7馬糞稻草栽培料購(gòu)自山西宇昊蘑菇種植有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 母種培養(yǎng)基的篩選

將G1菌株接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）平板中央，25℃，培養(yǎng)12 d，在菌落邊緣用打孔器（直徑5 mm）打孔，分別取1塊菌餅接入不同的母種培養(yǎng)基平板中心位置，25℃培養(yǎng)，每一處理5次重復(fù)，觀察菌落形態(tài)，計(jì)算菌絲體生長(zhǎng)速度［18］。

1.4.2 原種培養(yǎng)基的篩選

將G1菌株同步菌絲體接入供試的原種培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)，每一處理3次重復(fù)，觀察菌絲體的生長(zhǎng)情況，計(jì)算生長(zhǎng)速度。

1.4.3 栽培料的篩選

菌袋的制作：將制作好的不同配方栽培料裝入16 cm×33 cm聚丙烯袋中，每袋裝濕料400 g，121.3℃，滅菌120 min，自然冷卻后，接入10 g麥粒種，每個(gè)處理12袋。

發(fā)菌：將上述菌袋放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（25℃），觀察記錄菌絲體在不同栽培料中的吃料情況，待菌絲體長(zhǎng)滿袋后，繼續(xù)培養(yǎng)10 d。

覆土：將發(fā)好菌的菌袋移至出菇房，隨機(jī)擺放于不同層架上，打開(kāi)菌袋，袋口朝上，覆上直徑約1.5 cm左右的粗土，厚度2 cm左右，反復(fù)噴水至覆土充分吸水而不滲流入栽培料中，菇房濕度80%左右，溫度自然，待菌絲爬上粗土后，覆上細(xì)土，厚度1 cm左右。

出菇期管理：調(diào)節(jié)菇房溫度為14℃～22℃，空氣濕度95%，每天開(kāi)窗通風(fēng)1 h，保證覆土層濕潤(rùn)并給予一定的散射光照以刺激子實(shí)體的分化。觀察并記錄原基、子實(shí)體發(fā)生時(shí)間。

采收：G1菌株在子實(shí)體尚未開(kāi)傘時(shí)采收，整個(gè)采收期80 d，即從覆土到采收結(jié)束的時(shí)間。

記錄各配方每個(gè)菌袋中產(chǎn)生子實(shí)體的數(shù)量、重量、栽培性狀，計(jì)算生物學(xué)效率、產(chǎn)量、出菇的潮數(shù)等，產(chǎn)量＝每袋子實(shí)體平均鮮重；生物學(xué)效率［19］＝每袋子實(shí)體平均鮮重（g）/栽培料干重×100；單菇重＝每袋子實(shí)體重量/子實(shí)體個(gè)數(shù)。每種栽培料上隨機(jī)采10個(gè)子實(shí)體，測(cè)量記錄菌柄直徑、長(zhǎng)度，菌蓋直徑和厚度，計(jì)算平均值［20］。

2 結(jié)果與分析

2.1 母種培養(yǎng)基篩選結(jié)果

雙孢蘑菇G1菌株在不同母種培養(yǎng)基（A—I）上生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖1和表1。G1菌株在麩皮培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度最快（2.23 mm/d），顯著高于在馬糞培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度（2.07 mm/d），但在馬糞培養(yǎng)基上菌絲體潔白、濃密、長(zhǎng)勢(shì)最好。在馬鈴薯半合成培養(yǎng)基I和麥粒煮汁培養(yǎng)基II上，菌絲體生長(zhǎng)速度差異不顯著（P＜0.05）。同樣，在麥粒煮汁培養(yǎng)基I和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上G1菌株生長(zhǎng)速度差異不顯著（P＜0.05）。在葡萄糖＋麥芽糖＋酵母膏培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基上，菌絲體雖然致密，但生長(zhǎng)速度非常緩慢（0.65和0.72 mm/d），差異不顯著（P＜ 0.05）。綜合考慮，G1菌株最適母種培養(yǎng)基為馬糞培養(yǎng)基，其次為麩皮培養(yǎng)基。此外，發(fā)現(xiàn)G1菌株在部分培養(yǎng)基上可以形成原基及子實(shí)體。

圖1 不同母種培養(yǎng)基上雙孢蘑菇G1的菌落形態(tài)（A-I培養(yǎng)基名稱見(jiàn)1.2.1）Fig.1 Colonies of Agaricus bisporus strain G1 on different original strawn media（the names of A-I media are shown in part 1.2.1）

表1 不同母種培養(yǎng)基上雙孢蘑菇G1菌絲體生長(zhǎng)情況Table 1 Growth situations of mycelia of Agaricus bisporus G1 on different original strawn media

2.2 原種培養(yǎng)基篩選結(jié)果

不同原種培養(yǎng)基上G1菌株菌絲體生長(zhǎng)情況見(jiàn)表2。G1菌株在玉米和小米培養(yǎng)基上萌發(fā)速度最快（36 h），在棉籽殼木屑培養(yǎng)基和棉籽殼麥麩培養(yǎng)基上萌發(fā)速度較慢（72 h和120 h）；G1菌株在不同原種培養(yǎng)基上菌絲體生長(zhǎng)速度差異顯著（P＜0.05），其中在小米培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度最大（3.84 mm/d），顯著高于在其它培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度（P＜0.05）；在棉籽殼麥麩培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度最?。?.44 mm/d）。從長(zhǎng)勢(shì)來(lái)看，在麥粒和小米培養(yǎng)基上，菌絲體長(zhǎng)勢(shì)最好。綜合萌發(fā)時(shí)間、生長(zhǎng)速度及菌絲體長(zhǎng)勢(shì)，G1菌株最適的原種培養(yǎng)基為小米培養(yǎng)基，其次為麥粒和玉米培養(yǎng)基。

表2 不同原種培養(yǎng)基上雙孢蘑菇G1菌絲體生長(zhǎng)情況Table 2 Growth situations of mycelia of Agaricus bisporus strain G1 on different strawn media

2.3 栽培料篩選結(jié)果

由表3可知，雙孢蘑菇G1菌株能在發(fā)酵料即配方6（玉米秸稈牛糞栽培料）和配方7（馬糞稻草栽培料）上產(chǎn)生原基及子實(shí)體，而在非發(fā)酵料（配方1—5）上菌絲體生長(zhǎng)緩慢，不能形成原基及子實(shí)體。在配方6栽培料上子實(shí)體產(chǎn)量、生物學(xué)效率及所產(chǎn)蘑菇數(shù)量均高于配方7，在配方6和7上產(chǎn)生的子實(shí)體單菇重分別為4.73 g和4.93 g。在配方7上產(chǎn)生原基的時(shí)間為12 d，比在配方6上早5 d。在這兩種栽培料上，從覆土到采收結(jié)束的80 d，G1菌株均產(chǎn)生了2潮菇，且所產(chǎn)子實(shí)體干物質(zhì)含量分別為9.49%和9.78%。

表3 雙孢蘑菇G1菌株在不同栽培料上的出菇情況和干物質(zhì)含量Table 3 Quantitative production parameters and dry matter contents of the harvested Agaricus bisporus G1 during a harvesting period of 80 days

G1菌株在配方6和7上均可產(chǎn)生子實(shí)體，子實(shí)體白色，近半球形，多數(shù)散生，菌蓋白色，幼時(shí)平滑，后期表面具小絨毛，菌柄白色、中實(shí)，呈中央著生。其子實(shí)體形態(tài)與其他白色雙孢蘑菇相似［21］（表4）。由表可知，在配方6上產(chǎn)生的子實(shí)體的菌蓋直徑與厚度稍低于配方7；但在配方6上產(chǎn)生的子實(shí)體菌柄的長(zhǎng)度和直徑稍高于配方7?？傮w來(lái)講，G1菌株產(chǎn)生的子實(shí)體小于一般的雙孢蘑菇。綜合生物學(xué)效率、產(chǎn)量、子實(shí)體產(chǎn)生時(shí)間等因素，G1菌株最適栽培料為配方6即玉米秸稈牛糞栽培料。

表4 G1菌株在不同栽培料上產(chǎn)生的子實(shí)體性狀Table 4 Diameters and lengths of Agaricus bisporus G1 fruiting bodies cultivated on different substrates

3 分析與討論

本研究通過(guò)分析G1菌株在不同母種、原種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度和菌絲體長(zhǎng)勢(shì)，篩選出了其最適母種、原種培養(yǎng)基。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，G1菌株在麩皮培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度最快，但菌絲體較稀疏。在食用菌的培養(yǎng)過(guò)程中，菌絲健壯與否對(duì)后續(xù)的栽培及產(chǎn)量有明顯的影響。雖然G1菌株在馬糞培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度低于麩皮培養(yǎng)基，但菌絲體濃密，健壯，且馬糞培養(yǎng)基成本較低，適宜規(guī)?；a(chǎn)制種，所以G1菌株最適母種培養(yǎng)基為馬糞培養(yǎng)基。根據(jù)菌絲體生長(zhǎng)速率和長(zhǎng)勢(shì)，G1菌株最適的原種培養(yǎng)基為小米培養(yǎng)基，但該培養(yǎng)基成本較高，且制作過(guò)程容易染菌，所以該培養(yǎng)基適用于實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模制種，不適宜大規(guī)模生產(chǎn)制種。

栽培結(jié)果表明：G1菌株在非發(fā)酵料上菌絲體生長(zhǎng)緩慢，不能產(chǎn)生原基及子實(shí)體，在馬糞稻草和玉米秸稈牛糞這2種發(fā)酵栽培料上菌絲體生長(zhǎng)健壯，且能產(chǎn)生原基及子實(shí)體，這與其他雙孢蘑菇對(duì)栽培料性質(zhì)的要求基本相同［1］，其原因可能由于菌絲體在發(fā)育過(guò)程中的需求不同所致，所以不同菌株的生理特性和培養(yǎng)特性不同［22］，相比于馬糞稻草栽培料，G1菌株在玉米秸稈牛糞栽培料上生物學(xué)效率和產(chǎn)量更高，但和已商業(yè)化的雙孢蘑菇栽培品種相比，G1菌株的生物學(xué)效率和產(chǎn)量偏低。Martínez-Carrera等［23］對(duì)分離自莫斯科的10野生雙孢蘑菇進(jìn)行了栽培，其中很多種產(chǎn)量偏低，這說(shuō)明蘑菇屬是較易馴化的一個(gè)屬，盡管其產(chǎn)量偏低。此外，由于產(chǎn)量受多種因素的影響，包括營(yíng)養(yǎng)、溫度、光照、最適pH值以及通風(fēng)，只有在適宜的條件下，子實(shí)體的產(chǎn)量及生物學(xué)效率才會(huì)較高，G1菌株的生物學(xué)效率較低，可能與栽培條件有關(guān)，所以下一步有必要研究其適宜的栽培條件。

在摸索栽培條件時(shí)，當(dāng)栽培溫度較低（14℃左右），濕度較低時(shí)（30%～50%），G1子實(shí)體會(huì)出現(xiàn)一些畸形菇，即在菌蓋上再長(zhǎng)一個(gè)小蘑菇，這說(shuō)明G1菌株的結(jié)實(shí)能力較強(qiáng)。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。此外，G1菌株在麥粒培養(yǎng)基和瓊脂培養(yǎng)基上可以形成原基，且原基并能進(jìn)一步分化為子實(shí)體，而其他雙孢蘑菇相關(guān)報(bào)道非常少，對(duì)這些現(xiàn)象有必要進(jìn)行進(jìn)一步的研究。