楊 聲，閆 寬，何根業(yè)，溫 超

（國家體育總局反興奮劑中心 興奮劑檢測實驗室，北京 100029）

睪酮是人體內(nèi)分泌腺產(chǎn)生的內(nèi)源性激素，在有機化學(xué)上屬于甾體激素的一種，能夠促進人體蛋白質(zhì)的合成、提高肌肉力量和質(zhì)量、促進骨髓造血、保持成年男性的雄性體征，對生殖系統(tǒng)也具有重要作用?；瘜W(xué)、制藥行業(yè)已發(fā)展出一大類蛋白合成雄性類固醇藥物（Anabolic Androgen Steroid，AAS）。AAS也是運動員和體育健身愛好者容易濫用的物質(zhì)，早在1976年就被國際奧林匹克委員會（International Olympic Committee，IOC）和世界反興奮劑機構(gòu)（World Anti-Doping Agency，WADA）禁用。在運動員被判興奮劑陽性的藥物中，AAS的陽性率高居首位，例如，WADA（2018）公布的統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，全球?qū)嶒炇夜矙z測344 177例樣品，其中AAS（S1類）的陽性例數(shù)占全部禁用物質(zhì)的43%，位居第一。因此，針對該類藥物的研究一直是反興奮劑領(lǐng)域的重要內(nèi)容之一。

檢測AAS的主要方式是尿檢，即通過收集運動員的尿樣進行分析檢測。從尿樣中檢測AAS等甾體類藥物的主要技術(shù)是氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS），該方法至今已有近 50年的歷史（Halket，1993；Horning，1968；Shackleton，1986；Shackleton et al.，1968）。2011年起，世界各國反興奮劑實驗室陸續(xù)開始對GC-MS技術(shù)進行升級換代，采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）技術(shù)檢測甾體類藥物（Eenoo et al.，2011），GC-MS/MS的靈敏度比GC-MS提高了一個數(shù)量級，可達(dá)到1 ng/mL的水平。

自2000年悉尼奧運會開始，采集血液樣本作為興奮劑的檢測方法相繼建立，例如，從血液中檢測促紅細(xì)胞生成素在興奮劑檢測中發(fā)揮著重要作用。2004年的雅典奧運會上，血液中檢測生長激素的方法首次在奧運會上使用。伴隨著科技的發(fā)展，越來越多的新技術(shù)應(yīng)用到反興奮劑領(lǐng)域。2011年，德國實驗室率先采用干血點技術(shù)結(jié)合液質(zhì)-高分辨聯(lián)用法檢測興奮劑藥物，該方法可以對多種睪酮的制劑藥物進檢測（Thomas et al.，2011，2012）。2019年3月，隨著WADA干血點國際合作項目的啟動，中國反興奮劑中心與IOC、WADA、美國反興奮劑機構(gòu)（USADA）、德國科隆興奮劑檢測實驗室、日本東京興奮劑檢測實驗室等多個國際體育組織合作，成立了指導(dǎo)委員會和專家組，有力地推動了該技術(shù)在實際檢測中的應(yīng)用。經(jīng)過近兩年的研究，我國率先建立了干血點檢測方法，并通過ISO-17025質(zhì)量管理體系的認(rèn)可，將在2022年北京冬奧會、冬殘奧會上對各國運動員使用。

1 研究對象與方法

1.1 受試者招募與血液樣品采集

招募6名健康成年男性志愿者為研究對象，年齡24～40歲，體質(zhì)量63～72 kg。對受試者一次肌肉注射0.25 g的十一酸睪酮注射液。在肌肉注射之前，留取受試者空白血液和尿液樣品，注射后4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h留取血液樣本，之后每3天采集一次靜脈血。人體試驗的倫理申請已經(jīng)國家體育總局反興奮劑中心倫理委員會批準(zhǔn)（編號：201906），且受試者均已簽署知情同意書。

1.2 樣品處理方法

干血點樣品的制備：從靜脈血樣中吸取20 μL血液，滴到Whatman DMPK-C型濾紙卡上，每張濾紙卡滴4個血點，室溫下干燥2 h后制成備用。

樣品處理方法參考文獻(xiàn)并進行了一定改良（Forsdahl et al.，2013，Tretzel et al.，2014）。具體步驟為：剪取一片20 μL干血點樣品于玻璃試管中，加入50 μL D3-睪酮內(nèi)標(biāo)溶液（2 ng/mL）、1 mL碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖液（pH值9.5）和1 mL甲醇溶液，用震蕩器混勻，然后加入4 mL叔丁基甲醚進行液液萃取，搖床震蕩10 min后進行離心，轉(zhuǎn)速4 000 rpm，離心4 min。取出上層有機相轉(zhuǎn)移至新試管中，使用55℃氮氣流吹干。用100 μL的甲氧胺溶液（10 mM）進行衍生化反應(yīng)，80℃反應(yīng)30 min，將樣品離心后（4 000 rpm，4 min）轉(zhuǎn)移至樣品瓶中，取10 μL進樣。

1.3 試劑

醋酸睪酮酯（CAS 1045-69-8）、丙酸睪酮酯（CAS 57-85-2）、苯甲酸睪酮酯（CAS 2088-71-3）、環(huán)戊丙酸睪酮酯（CAS 58-20-8）、苯丙酸睪酮酯（CAS 1255-49-8）、庚酸睪酮酯（CAS 315-37-7）、癸酸睪酮酯（CAS 5721-91-5）、十一酸睪酮酯（CAS 5949-44-0）均購自Sigma-aldrich公司。甲醇、叔丁基甲醚、甲酸均為HPLC級、氘代D3-睪酮購自Sigma-aldrich公司。甲酸銨為HPLC級試劑，購自Fluka公司。碳酸氫鈉、碳酸鈉、氫氧化鈉購自國藥試劑公司。純水使用國產(chǎn)純水機制備（北京愛思泰克科技公司），純水電阻值大于18.0 MW。

1.4 儀器和參數(shù)設(shè)置

液相色譜-高分辨離子軌道阱質(zhì)譜儀（Thermo Dionex Ultimate 3000 LC/Q Exactive Plus）和液相色譜柱[Thermo hypersil GOLDTM（100× 2.1 mm，1.9 μm）]均來自美國賽默飛公司。流動相A為水相，含10 mM甲酸銨（0.05%甲酸）水溶液。流動相B為有機相，為色譜級純度的甲醇（0.1%甲酸）。流速為0.25 mL/min。

流動相梯度：0～2 min，65%溶劑B；2～9.5 min，65%～100% 溶劑 B；9.5～13 min，100% 溶劑 B；13～15 min，100%～65%溶劑B。柱溫箱溫度為35℃。離子化模式為正離子采集。干燥氣流量為8 L/min（450℃）。離子傳輸管溫度為300℃，分辨率為17 500。質(zhì)量偏差5 ppm以下。掃描模式為Full scan（50～750 m/z）和PRM模式。

2 實驗結(jié)果

衍生化前，幾種睪酮酯的分子離子的精確質(zhì)量不同，但去掉甾環(huán)上17位上的側(cè)鏈后，都是一樣的睪酮分子，8種睪酮制劑的分子結(jié)構(gòu)見圖1。睪酮的酯型藥物經(jīng)過離子源在正模式采集下，分子發(fā)生裂解，分子離子為[M＋H]＋，同時二級質(zhì)譜可獲得一些特征碎片離子，如97.064 8、109.064 8、253.194 7、289.215 5的碎片離子。這些碎片都是睪酮的甾環(huán)碎裂后形成的特征碎片。醋酸睪酮酯的特征碎片和質(zhì)譜圖見圖2。

圖1 8種睪酮酯的分子結(jié)構(gòu)Figure 1.The Molecular Structure of Eight Testosterone Esters

圖2 醋酸睪酮酯的質(zhì)譜圖Figure 2.The Mass Spectrum of Testosterone Acetate

衍生化后，分子在A環(huán)的3位氧原子被甲氧胺的氮原子取代，形成肟的結(jié)構(gòu)，再經(jīng)過ESI離子源的裂解，原來m/z為97.064 8的離子成為了m/z為126.091 2的離子，而m/z為109.064 8的則轉(zhuǎn)變成m/z為138.091 0的特征離子碎片（圖3）。

圖3 衍生化后醋酸睪酮酯形成的E/Z型肟的質(zhì)譜圖Figure 3.The Mass Spectrum of E/Z Isomers of Testosterone Acetate Oxime

2.1 檢測限

配制8種睪酮酯的對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mg/mL，逐級按10 ng/mL、5 ng/mL、2.5 ng/mL、1.0 ng/mL、0.5 ng/mL、0.25 ng/mL、0.125 ng/mL的濃度梯度進行稀釋，然后添加到空白全血中，按樣品提取方法進行處理，經(jīng)液相色譜-高分辨離子軌道阱質(zhì)譜儀分析后，根據(jù)特征離子的色譜圖信噪比＞3估計檢測限。本研究中，十一酸睪酮酯的檢測限為0.3 ng/mL，其他7種睪酮酯的檢測限為0.1 ng/mL，與文獻(xiàn)報道結(jié)果接近（Forsdahl et al.，2015）。

2.2 提取回收率

取睪酮酯的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別稀釋成10 ng/mL、5 ng/mL、1.0 ng/mL、0.5 ng/mL的濃度，一份添加50 μL內(nèi)標(biāo)溶液（D3-T）到10個空白全血中提取后備用；另一份添加50 μL內(nèi)標(biāo)溶液后，直接使用初始流動相復(fù)溶，分別進樣后計算提取回收率。結(jié)果顯示，各濃度的回收率在50%～86%。

2.3 日內(nèi)和日間精密度

實驗的日內(nèi)精密度經(jīng)測定小于15%。日間精密度連續(xù)測定3天，日間精密度為12%～25%。說明樣品會隨著時間的推移而部分降解，因此，在實驗過程中樣品制備完畢后應(yīng)及時進行檢測。

2.4 應(yīng)用于人體試驗后血液樣品的檢測情況

采用本實驗建立的方法對受試者服用睪酮十一酸酯0.25 g后，取干血點樣本20 μL（1個血點）進行檢測，結(jié)果可以檢測到睪酮十一酸酯的原型藥物，并且在停用藥物后7～14天仍能被檢測到。實驗結(jié)果可以作為使用了外源性睪酮類興奮劑的直接證據(jù)。

3 討論

3.1 干血點技術(shù)的特點

干血點是一種血樣的保存方式的統(tǒng)稱，是將外周血液標(biāo)本（新生兒的腳跟、成人指尖或者耳垂等部位采集到的少量血液）保存到濾紙片上，干燥后用于臨床疾病篩查、藥理研究、藥物代謝研究的方法統(tǒng)稱。該技術(shù)起源于20世紀(jì)60年代，由美國微生物學(xué)家Robert Guthrie于1963年為篩查新生兒遺傳病——苯丙酮尿癥所創(chuàng)立（Scriver，1998）。它的特點是取樣創(chuàng)傷小，采取血液樣本，只需干燥，對樣品的保存溫度沒有特殊要求，但低溫（-20℃）干燥環(huán)境將延長樣品的保存期限。對樣品采集人員的性別也沒有要求，而且對運動員的隱私也進行了最大程度上的保護，因此是運動員容易接受的一種采樣方式。

3.2 干血點技術(shù)的難點

睪酮根據(jù)來源可分為內(nèi)源性睪酮和外源性睪酮，內(nèi)源性睪酮即人體細(xì)胞分泌的睪酮，外源性睪酮即人工制藥合成的睪酮制劑。當(dāng)外源性睪酮進入人體后，如何與自身的睪酮進行區(qū)分充滿難度。首先，如何發(fā)現(xiàn)體內(nèi)的睪酮增多就是一個難題。睪酮的分泌與種族、年齡、性別、遺傳等因素有關(guān)，并且存在個體差異，有學(xué)者建立了部分人群血清睪酮正常值的參考范圍，但反興奮劑檢測多采用尿檢，測定的是尿樣中的睪酮，血清中的值只能作為參考。常規(guī)的檢測方法是通過測定一系列內(nèi)源性睪酮代謝物的濃度和比值，如5α-雄烷二醇、5β-雄烷二醇、雄酮、本膽烷醇酮等，與已經(jīng)建立的人群參考值進行比較，找出濃度指標(biāo)、代謝物之間濃度比值異常的可疑樣本后，再借助同位素比質(zhì)譜技術(shù)進行確證，才能準(zhǔn)確區(qū)分內(nèi)源性和外源性睪酮。

同位素比質(zhì)譜技術(shù)可以測定睪酮分子中的碳原子的同位素比值（13C/12C），從分子的同位素構(gòu)成上顯示出差異（Becchi et al.，1994），它的原理是用于人工合成睪酮的化學(xué)原料的碳元素與人體通過食物攝入的含碳化合物存在差異。但該方法也存在一些不足，例如，檢測靈敏度不如干血點法，其次，如果采用植物甾醇提取的原料來合成睪酮，就很難發(fā)現(xiàn)碳元素分布上的差異。

血漿中存在一種酯酶，可以將進入體內(nèi)的睪酮制劑水解，轉(zhuǎn)變成跟人體分泌的睪酮一樣的形式，因此難以被檢測到。干血點技術(shù)是一種直接檢測睪酮酯的方法，其優(yōu)勢在于巧妙地通過使血液脫水后干燥，降低了血漿中的酯酶活性，甚至使酯酶失去活性，使得微量的樣品中仍然有完整的睪酮制劑分子，一旦被檢測到，可以肯定其使用了外源性睪酮制劑。

3.3 干血點技術(shù)可檢測的藥物種類

干血點是一種血樣的保存方式，因此不僅睪酮類興奮劑可以通過該方法進行檢測，其他種類的興奮劑，如刺激劑甲基麻黃堿（Kojima et al.，2016）、麻醉劑（Verplaetse et al.，2015）、鎮(zhèn)痛劑曲馬多（Luginbühl et al.，2020）、糖皮質(zhì)激素、小肽類（Lange et al.，2020）、促紅細(xì)胞生成素（EPO）和生長激素（GH）等可用干血點技術(shù)進行檢測（荊京等2021；Yuan et al.，2021）。然而，由于現(xiàn)行的 WADA 規(guī)定中，僅對尿樣中特定刺激劑的結(jié)果判定有閾值方面的要求，對于干血點的濃度閾值如何判定還在討論中。未來隨著研究的不斷深入與完善，系統(tǒng)的干血點技術(shù)體系將逐漸建立。

3.4 睪酮酯衍生化后形成的E/Z型肟的結(jié)構(gòu)推測

睪酮酯分子中含有羰基與甲氧胺在甲醇溶液中可以發(fā)生反應(yīng)，生成的產(chǎn)物在有機化學(xué)上叫做肟。由于構(gòu)型上存在E/Z異構(gòu)體，根據(jù)WADA的要求（WADA，2021），需要做進一步的鑒定。通過一系列的實驗觀察，發(fā)現(xiàn)采用不同溫度、日光照射、甚至室溫條件下放置，均能形成E/Z型的睪酮酯的肟產(chǎn)物，區(qū)別只是產(chǎn)率不同。本研究中的色譜分離條件，比文獻(xiàn)中的分離度更優(yōu)。例如，有研究雖然提到反應(yīng)形成了E/Z型異構(gòu)體，但沒有進一步對異構(gòu)體進行鑒定；而且文獻(xiàn)中采用的液相分離條件也無法實現(xiàn)基線分離（Gray et al.，2011）。因此，建議采用羥胺試劑而非甲氧胺進行衍生化，使色譜分離時的E/Z兩個異構(gòu)體在色譜圖上呈現(xiàn)一個合并的“單峰”形式（Forsdahl et al.，2013）。也有文獻(xiàn)中顯示出不完全的分離效果，色譜峰呈現(xiàn)肩峰特征（Tretzel et al.，2014）。有研究報道，實現(xiàn)了睪酮酯的基線分離，但內(nèi)標(biāo)物質(zhì)氘代睪酮的肟卻仍然是一個單峰（Gray et al.，2011），說明還有改進的余地。而本研究可以做到氘代睪酮肟的E/Z異構(gòu)體的分離，雖然它的17位上只是一個羥基，沒有長的側(cè)鏈，色譜圖上仍可顯示出雙峰特征。

根據(jù)有機化學(xué)中立體化學(xué)與光化學(xué)反應(yīng)的有關(guān)理論（邢其毅等，1983），在反應(yīng)生成的機理上，熱力學(xué)上容易生成的結(jié)構(gòu)較多為E型，而Z型由于空間構(gòu)型上不利于形成而占比較少。因此做出以下推斷，Hypersil GOLDTM色譜柱采用水-甲醇為流動相時，色譜圖上保留時間早、豐度較小的色譜峰為Z型睪酮酯的肟產(chǎn)物，保留時間晚、豐度較大的色譜峰為E型睪酮酯的肟產(chǎn)物（圖4、圖5）。由于本研究是從色譜-質(zhì)譜技術(shù)上進行結(jié)構(gòu)推斷的異構(gòu)體，其可靠性還有待其他波譜學(xué)技術(shù)的驗證。

圖4 8種睪酮酯的提取離子色譜圖Figure 4.The Extracted Ion Chromatogram of Eight Testosterone Esters

圖5 衍生化后睪酮酯肟的E/Z構(gòu)型Figure 5.E/Z Configuration of Testosterone Ester Oxime

4 結(jié)論

本實驗方法不僅適用于血液樣品的檢測，也適用于保存在濾紙片上的干血點樣品的檢測。該檢測方法靈敏、快速。使用了十一酸睪酮的受試者的血液樣本，在停用后7～14天仍可檢出十一酸睪酮酯的原型，因此，為控制睪酮類藥物制劑的濫用提供了可靠的檢測方法。本研究采用液相色譜技術(shù)實現(xiàn)了8種睪酮酯的肟化產(chǎn)物的同分異構(gòu)體的基線分離，并首次對E和Z型異構(gòu)體進行了結(jié)構(gòu)推測，可以滿足WADA的相關(guān)要求。干血點技術(shù)作為常規(guī)尿檢、血檢的重要補充手段，使得對外源性睪酮酯的檢測又多了一項新技術(shù)。