黃治國，蒲領(lǐng)平，羅惠波，林峰，張宿義，程國富，鄧杰

（1.四川輕化工大學(xué)釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓 644000）（2.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州 646000）（3.四川宇晟酒業(yè)投資管理有限公司成都分公司，四川成都 610000）

濃香型白酒的釀造是一個復(fù)雜的微生物群落相互作用的過程[1]。窖泥是濃香型白酒主要生香功能菌生長繁殖的載體，酒醅發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸類和酯類等物質(zhì)是濃香型白酒濃郁窖香的基礎(chǔ)。窖泥中的微生物種類豐富，酯化型微生物能將酸類物質(zhì)和醇類物質(zhì)進(jìn)行酯化產(chǎn)酯，是窖泥中一類重要的功能微生物[2]。不同的產(chǎn)香微生物協(xié)同作用才生成了濃香型白酒以己酸乙酯為主體，三大酯和四大酸輔助香型的獨(dú)特風(fēng)格白酒[3,4]，菌株之間的協(xié)同作用有利于目標(biāo)產(chǎn)物的合成，能提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量[5]。

由于窖泥中高醇、高酸、微氧的極端條件，導(dǎo)致窖泥中的酯化型微生物主要以細(xì)菌為主[6]。細(xì)菌是白酒釀造中的重要生香微生物，但目前對釀酒環(huán)境中酯化細(xì)菌方面的研究相對較少，主要集中在對葡萄球菌、假單胞菌和放線菌等的研究[7,8]。近年來，關(guān)于窖泥中酯類物質(zhì)的研究以香氣物質(zhì)及其前體物的產(chǎn)生菌為主，許多酯化細(xì)菌的研究[9-11]主要在酒曲環(huán)境中進(jìn)行，且篩選出的酯化細(xì)菌均為好氧菌株。因此對釀造環(huán)境中產(chǎn)酯細(xì)菌有待于進(jìn)一步的研究和探索，尋找新的窖泥微生物研究途徑，擴(kuò)大對窖泥中微生物資源的利用非常有必要。

響應(yīng)面優(yōu)化法廣泛應(yīng)用于食品、生物、環(huán)境等各方面[12-14]，它能以很少的實(shí)驗(yàn)數(shù)量和時間對實(shí)驗(yàn)進(jìn)行全面研究，科學(xué)、準(zhǔn)確的分析局部與整體之間的關(guān)系，在優(yōu)化配比的條件下，可以提高不同微生物之間的協(xié)同效果，有利于代謝產(chǎn)物的積累[15-17]。本文主要以窖泥中分離出來的3株酯化細(xì)菌的接種量為因素，先利用最陡爬坡試驗(yàn)逼近響應(yīng)值區(qū)域，后利用Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對主要影響因子影響己酸乙酯和丁酸乙酯的產(chǎn)量建立二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型，并對該模型的顯著性利用Design-Expert.V 8.0.6軟件進(jìn)行檢驗(yàn)[18]，優(yōu)化得到復(fù)配發(fā)酵中各菌株接種量的最佳配比，以期為提高濃香型白酒質(zhì)量提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）、廣西梭菌（Clostridium guangxiense）、煎盤梭菌（Clostridium sartagoforme）均由釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室窖內(nèi)微生物課題組從優(yōu)質(zhì)窖泥中分離得到。

MES培養(yǎng)基、L-半胱氨酸鹽酸鹽(分析純，北京奧索萊寶生物技術(shù)有限公司)，乙酸丁酯（色譜純）、丁酸鈉、硫酸鈉、二水合氯化鈣、碳酸氫鈉、葡萄糖、磷酸二氫鉀、酵母膏（分析純，成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 主要儀器設(shè)備

LRH-250生化培養(yǎng)箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）、AW200SG厭氧工作站（金壇市科技分析儀器有限公司）、CI54DS立式壓力蒸汽滅菌鍋（廈門儀器有限公司）、SW-CJ-IF超凈工作臺（蘇州集團(tuán)空氣技術(shù)有限公司）、AR2140電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）、7890A-5975B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent科技有限公司)、UV-1200紫外可見分光光度儀（翱藝儀器上海有限公司）、55i+Ds-SM-U1顯微成像系統(tǒng)（日本NIKON公司）、Scan1200菌落分析儀（Inter science公司）。

1.3 培養(yǎng)基

計(jì)數(shù)培養(yǎng)基：稱取MES 0.5 g/L、L-半胱氨酸鹽酸0.25 g/L、乙酸鈉1 g/L、磷酸二氫鉀0.5 g/L、氯化鈉1.0 g/L、碳酸氫鈉0.3 g/L、硫酸鈉0.5 g/L、二水合氯化鈣0.15 g/L、六水氯化鎂0.4 g/L、酵母浸粉1.0 g/L、蛋白胨1.5 g/L、葡萄糖3 g/L、丁酸鈉2 g/L，pH 5.5，121 ℃滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：在計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加可溶性淀粉5 g/L、5%乙醇溶液5 mL/L。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 菌株復(fù)配試驗(yàn)

1.4.1.1 混合培養(yǎng)試驗(yàn)

將活化后的菌株Y1、Y2、Y3分別培養(yǎng)至對數(shù)期末期后，按1:1的比例分別混合制成Y1-Y2、Y1-Y3、Y2-Y3，按1:1:1的比例混合制成Y1-Y2-Y3種子液，并以5%接種量接種到計(jì)數(shù)培養(yǎng)基中，34 ℃厭氧培養(yǎng)2 d后，再用紫外分光光度計(jì)（OD660）測定吸光值，以未接種的培養(yǎng)基作為空白，記錄結(jié)果。

1.4.1.2 復(fù)配發(fā)酵試驗(yàn)

單菌發(fā)酵：將分離的菌株活化后，培養(yǎng)至對數(shù)期末期作為種子液，在厭氧工作站中按5%接種量將3株菌分別接種于裝有80 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的厭氧瓶中，移至生化培養(yǎng)箱中34 ℃下培養(yǎng)12 d，通過GC-MS檢測發(fā)酵產(chǎn)物。

將分離的菌株活化后，按1：1的比例分別混合制成Y1-Y2、Y1-Y3、Y2-Y3，按1:1:1的比例混合制成Y1-Y2-Y3種子液，在厭氧工作站中按5%接種量將種子液分別接種于已滅菌并裝有80 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的厭氧瓶中，移至生化培養(yǎng)箱中34 ℃培養(yǎng)12 d，通過GC-MS檢測發(fā)酵產(chǎn)物。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將分離的菌株活化后，培養(yǎng)至對數(shù)期末期作為種子液，按5%接種量分別接種于除氧后的80 mL滅菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基，34 ℃培養(yǎng)2 d，將菌液分別稀釋0、1、2、4、6、8、10倍，用紫外分光光度計(jì)（OD660）測吸光值，以未接種的培養(yǎng)基作為空白對照，記錄結(jié)果。再將上述菌液再分別稀釋到10-4、10-5、10-63個梯度涂布，每個梯度涂布三次，用菌落計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，并于660 nm波長處測定吸光度。以菌株濃度（CFU/mL）為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)，得出Y1菌株擬合公式=1×10-6x-0.0111，R2=0.9997；Y2菌株擬合公式=5×10-6x+0.0105，R2=9986；Y3菌 株 擬 合 公 式=4×10-7x-0.0293；R2=0.9995。并在相同OD值0.7條件下利用上述公式計(jì)算出各自所對應(yīng)的菌體數(shù)。

1.4.3 樣品檢測方法

1.4.3.1 樣品預(yù)處理

取5 mL種子液和0.25 mL濃度為20 mg/100 mL乙酸正丁酯裝入15 mL的頂空瓶中，混勻后于55 ℃下先平衡15 min，再萃取30 min，隨后進(jìn)行手動進(jìn)樣。

1.4.3.2 GC-MS分析方法

（1）氣相色譜（GC）條件：DB-WAX（60 m×250 μm×0.25 μm）色譜柱；載氣為高純He，流速1 mL/min，進(jìn)樣口溫度230 ℃；程序升溫：初始溫度為45 ℃，保持1 min，然后以6 ℃/min的升溫速率升至160 ℃，保持1 min，再以20 ℃/min到230 ℃，保持6 min。

（2）質(zhì)譜（MS）條件：電子離子源（EI），70 eV電子能量，采集模式為全掃描，質(zhì)量范圍20～550 amu，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，接口溫度230 ℃。

1.4.3.3 定性與定量分析

定性：通過所測得質(zhì)譜圖與NIST05a.L標(biāo)準(zhǔn)譜庫比對，利用匹配度均大于或等于80（最大值為100）的特征離子進(jìn)行定性分析，并鑒定結(jié)果[19]。

半定量：以60%乙醇配制濃度為20 mg/100 mL的乙酸正丁酯內(nèi)標(biāo)溶液，在5 mL發(fā)酵液中加入100 μL內(nèi)標(biāo)溶液，萃取后，再根據(jù)內(nèi)標(biāo)峰面積與樣品中所測物質(zhì)峰面積之比以及內(nèi)標(biāo)在樣品中的最終濃度來計(jì)算檢測物質(zhì)的含量[20]。

1.4.4 復(fù)配優(yōu)化方法

1.4.4.1 最陡爬坡試驗(yàn)

最陡爬坡試驗(yàn)根據(jù)1.4.1和1.4.2的試驗(yàn)結(jié)果，對達(dá)到顯著水平的影響因素設(shè)定變化方向和步長，逼近最佳區(qū)域，確定各試驗(yàn)因素取值的中心點(diǎn)。

1.4.4.2 Box-Benhnken Design試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在最陡爬坡試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方差分析得到各接種量的最佳水平，利用Design-Expert.V8.0.6軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)，以Y1、Y2和Y3 3株菌的接種量為自變量，以綜合歸一值Y為響應(yīng)值，從而確定3株菌協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)己酸乙酯和丁酸乙酯的最優(yōu)發(fā)酵接種配比，得到編碼水平（表1）。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素編碼水平Table 1 Factor code and level of response surface experiments

1.4.4.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

按照響應(yīng)面試驗(yàn)所得預(yù)測結(jié)果，分別配置Y1、Y2和Y3菌株的菌懸液，按1:1:1的比例制成復(fù)合種子液，以5%接種量接種于除氧后的80 mL滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，34 ℃培養(yǎng)12 d，通過GC-MS分析發(fā)酵產(chǎn)物。

1.4.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，采用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并運(yùn)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行SNK-q檢驗(yàn)和多重比較。每組試驗(yàn)均重復(fù)3次。

在響應(yīng)面分析中，將己酸乙酯和丁酸乙酯的檢測指標(biāo)采用Hassan方法歸一化為0～1之間的值[21]，如公式1：

式中：di，每組試驗(yàn)所測得的真實(shí)值；dmax，試驗(yàn)中的最高值；dmin，試驗(yàn)中的最低值。

再將己酸乙酯和丁酸乙酯的權(quán)重分別設(shè)為0.6和0.4，得到包含己酸乙酯和丁酸乙酯的綜合值Y，如公式2：

2 結(jié)果與討論

2.1 3株菌混合培養(yǎng)效果

為了研究在混合培養(yǎng)條件不同菌株之間是否存在顯著的競爭抑制關(guān)系，本試驗(yàn)對3株菌間進(jìn)行混合培養(yǎng)試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示：Y1-Y2、Y1-Y3、Y2-Y3和Y1-Y2-Y3 4個復(fù)配組合在OD660值上均顯著高于Y1、Y2和Y3單菌株OD660值（p＜0.05），雖然它們在混合培養(yǎng)時依然存在著相互抑制的作用，且其中每種菌的生物量可能低于單菌株培養(yǎng)時的生物量，但它們在混培時的總體生物量將會大于其單菌株養(yǎng)時的生物量，這證明在一定條件下這3株菌相互之間混合培養(yǎng)時各菌株體能較為和諧的生長。與單一菌種發(fā)酵相比，混合培養(yǎng)方式不但提高了活菌數(shù)，而且還減少了發(fā)酵后再混配的環(huán)節(jié)，有效地提高了原材料、設(shè)備和能源的利用率[22]。

圖1 不同菌株間混合培養(yǎng)效果Fig.1 Mixed culture effect between different strains

2.2 各復(fù)配組合發(fā)酵產(chǎn)物的差異

混合培養(yǎng)結(jié)果表明3株菌間有較好的共生能力，但在代謝產(chǎn)物的合成上是否存在協(xié)同促進(jìn)作用需要進(jìn)一步研究證明，因此本試驗(yàn)先對3株菌之間進(jìn)行復(fù)配發(fā)酵試驗(yàn)。

由表2可知，Y1、Y2、Y3產(chǎn)己酸乙酯（11.16、10.48、5.60 mg/100 mL）和丁酸乙酯（25.56、17.42、10.56 mg/100 mL），同時也產(chǎn)己酸（4.90、6.51、3.84 mg/100 mL）和丁酸（8.01、9.16、2.41 mg/100 mL），還有少量的乙酸（0.5、0.36、0.45 mg/100 mL），3株菌的己酸產(chǎn)量都低于丁酸產(chǎn)量，己酸乙酯產(chǎn)量低于丁酸乙酯產(chǎn)量可能與其酯化的專一性無關(guān)，而與其前體物質(zhì)己酸和丁酸的含量相關(guān)；3株菌都產(chǎn)高級醇（正丁醇、正戊醇、正己醇、2-壬醇、1-辛醇）產(chǎn)生，其中正丁醇為Y1和Y2的主要高級醇類產(chǎn)物，產(chǎn)量分別為17.00、12.82 mg/100 mL。在白酒的微量成分中，高級醇是白酒醇甜和助香劑的主要物質(zhì)，酸類賦予白酒豐滿和刺激感；醇與酸酯化成酯，從而使白酒具有良好香味[23]。

表2 復(fù)配發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of mixed fermentation test

復(fù)配發(fā)酵組合Y1-Y2和Y2-Y3代謝的己酸乙酯（16.24、14.38 mg/100 mL）、丁酸乙酯（38.56、28.95 mg/100 mL）產(chǎn)量都顯著（p＜0.05）高于Y1、Y2和Y3，復(fù)配發(fā)酵組合Y1-Y2-Y3代謝的己酸乙酯（19.78 mg/100 mL）、丁酸乙酯（45.37 mg/100 mL）和總化合物（99.5 mg/100 mL）產(chǎn)量也都顯著（p＜0.05）高于Y1-Y2、Y1-Y3和Y2-Y3組合，表明菌株Y3與菌株Y2有較好的協(xié)同作用；Y1-Y2-Y3組合為最優(yōu)試驗(yàn)組，表明從窖泥中篩選出的這3株菌能夠較好的進(jìn)行混合協(xié)同發(fā)酵來提高己酸乙酯和丁酸乙酯的產(chǎn)量。

2.3 復(fù)配優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 最陡爬坡試驗(yàn)確定顯著影響因素水平的中心點(diǎn)

為了最大限度的逼近己酸乙酯和丁酸乙酯產(chǎn)量的真實(shí)值，將Y1、Y2、Y3 3株菌復(fù)配發(fā)酵時分別接種的生物量作為變量進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)。結(jié)果如表3所示：己酸乙酯和丁酸乙酯的含量隨著各菌株接種生物量的變化呈先上升后下降的變化趨勢，在第5組試驗(yàn)處己酸乙酯和丁酸乙酯的綜合歸一值（Y）為0.994達(dá)到最大值，表明在第5組試驗(yàn)中3株菌接種量的配比已逼近最佳配比范圍。因此對第5組試驗(yàn)中各菌株接種生物量的中心點(diǎn)取值進(jìn)行試驗(yàn)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表3 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of path of steepest ascent experiment

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 The results of response surface experiments

表5 BBD試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 5 The results of anova analysis of Box-Behnken design

2.3.2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用Design Expert 8.0.6軟件對表4中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)擬合回歸，并獲得己酸乙酯和丁酸乙酯的綜合歸一值（Y）對Y1接種量（A）、Y2接種量（B）和Y3接種量（C）的二次多項(xiàng)回歸方程：Y綜合值=0.65+0.19A+0.22B-0.16C+0.20AB-0.087AC-0.22BC-0.20A2-0.14B2-0.24C2。利用自變量同編碼變量的變換公式（Xi=(xi-x0)/Δ，Δ為自變量步長，Xi為自變量編碼值，xi為自變量實(shí)際值，x0為自變量在中心處實(shí)際值）將全變量編碼水平的二次回歸方程轉(zhuǎn)換為全變量非編碼水平的二次回歸方程：Y綜合值=0.65324 +0.19042A+0.22016B-0.15761C+0.19987AB-0.087431AC-0.2249B C-0.20097A2-0.14057B2-0.2381C2。

進(jìn)一步對回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表5。由表5可知，該模型極顯著（p＜0.0001），失擬項(xiàng)P=0.6248＞0.05（不顯著），說明該回歸模型可靠，可用于3株菌接種量的優(yōu)化。另外，模型的決定系數(shù)R2=0.9759，說明擬合程度良好；校正決定系數(shù)校正系數(shù)R2Adj=0.9449，指出預(yù)測值與實(shí)際值具有高度的相關(guān)性。因此該回歸模型可用于對發(fā)酵產(chǎn)己酸乙酯和丁酸乙酯試驗(yàn)綜合評分值的理論預(yù)測。在回歸模型中，一次項(xiàng)A、B、C對綜合評分值影響極顯著（p＜0.01）；模型中交互項(xiàng)BC對綜合評分值影響極顯著（p＜0.01），而AB對綜合評分值影響顯著（p＜0.05），AC對綜合評分值影響不顯著（p＞0.05）；模型中二次項(xiàng)A2、B2和C2對綜合評分值影響達(dá)到極顯著水平（p＜0.01）。

2.3.3 顯著因素水平的優(yōu)化

為了更直觀反映Y1、Y2和Y3之間的交互作用對歸一值(Y)的影響，利用Design Expert 8.0.6軟件繪制了響應(yīng)面，如圖2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)回歸模型存在穩(wěn)定點(diǎn)(A：0.51、B：0.76、C：-0.71)，即菌株Y1、Y2、Y3接種量分別為3.70×106、1.35×106、4.35×106cfu/mL，此時己酸乙酯和丁酸乙酯的歸一值(Y)的最大估計(jì)值為0.996，己酸乙酯、丁酸乙酯的最大估計(jì)值分別為32.37、119.41 mg/100 mL。

圖2 Y1、Y2和Y3 3株菌接種生物量三因素交互作用對綜合評分值的影響Fig.2 The effects of three factors of strains Y1～Y3 on the composite score value

2.3.4 復(fù)配發(fā)酵優(yōu)化驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

為了驗(yàn)證優(yōu)化后的復(fù)配發(fā)酵產(chǎn)己酸乙酯和丁酸乙酯效果，以原復(fù)配方法為對照進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。由圖3可知，應(yīng)用優(yōu)化后的復(fù)配發(fā)酵產(chǎn)物己酸乙酯和丁酸乙酯含量顯著高于優(yōu)化前（p＜0.05），且與模型預(yù)測值差異不顯著（p＞0.05），證明模型有效。

圖3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Results of the validation test

3 結(jié)論

3.1 本研究以產(chǎn)酯化力強(qiáng)的菌株Y1（Clostridium beijerinckii）、Y2（Clostridium guangxiense）、Y3（Clostridium sartagoforme）為試驗(yàn)對象，以接種量為基礎(chǔ)，通過單菌株發(fā)酵和協(xié)同發(fā)酵試驗(yàn)，以達(dá)到更強(qiáng)的產(chǎn)酯性能為目的對3株酯化細(xì)菌進(jìn)行復(fù)配，并結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化其產(chǎn)己酸乙酯和丁酸乙酯的發(fā)酵工藝。結(jié)果顯示3株菌兩兩之間均有一定的協(xié)同作用，3株菌同時協(xié)同發(fā)酵效果最優(yōu)，丁酸乙酯和己酸乙酯含量顯著高于其他協(xié)同發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果（p＜0.05）；3株菌株接種量最佳配比為Y1:Y2:Y3=4:1.5:4.5。在此條件下，己酸乙酯和丁酸乙酯的產(chǎn)量分別為32.25 mg/100 mL和117.68 mg/100 mL，優(yōu)化效果顯著。

3.2 對濃香型酒而言，合成己酸乙酯的微生物，國內(nèi)外均少見報道。從微生物而論，酵母菌、霉菌和細(xì)菌有酯化能力，實(shí)驗(yàn)與應(yīng)用主要在霉菌與酵母菌上[24-27]，對細(xì)菌的研究少見報道。目前，基于不同種群間的相互作用協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)己酸乙酯和丁酸乙酯研究較少，但這對揭示窖泥酯化微生物在白酒中的實(shí)際應(yīng)用具有重要意義。本研究僅在篩選出的酯化菌中做協(xié)同發(fā)酵，后續(xù)可和產(chǎn)酸菌如己酸菌、丁酸菌的協(xié)同發(fā)酵方面、對功能菌在釀酒中實(shí)際應(yīng)用方面作進(jìn)一步研究，如在陶壇中試驗(yàn)與大曲和酒醅協(xié)同釀造無窖泥濃香型白酒等。