李靜宇，許林兵，應(yīng)帆，肖維強(qiáng)，陳谷

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）（2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所，廣東廣州 510640）

香蕉枯萎?。ㄒ卜Q為巴拿馬?。┦怯烧婢怄哏牭毒虐蛯；停‵usarium oxysporumF. sp.cubense，F(xiàn)oc）引起的土傳性真菌流行病害，可造成香蕉枯萎黃化甚至死亡，嚴(yán)重威脅香蕉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1,2]。它在20世紀(jì)中葉之前摧毀了大蜜哈類（Gros Michel，AAA）香蕉的出口貿(mào)易產(chǎn)業(yè)，并威脅到用來(lái)取代它的香蕉卡文迪許（Cavendish，AAA）品系的生存?？ㄎ牡显S品系，因果形大，產(chǎn)量高，貨架期長(zhǎng)，在產(chǎn)蕉區(qū)被廣泛種植，卡文迪許品系產(chǎn)蕉量目前占所有香蕉產(chǎn)量的約45%。目前，卡文迪許品系仍是產(chǎn)蕉區(qū)主要種植品種。然而，香蕉枯萎病菌4號(hào)生理小種（Foc4）是侵染能力和毒性最強(qiáng)的尖孢鐮刀菌生理小種，可以侵染所有卡文迪許品系[2]。因而詳細(xì)研究Foc4具有重要科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。

Micro RNA（miRNAs）是一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小長(zhǎng)約20～24個(gè)核苷酸[3]。MiRNA在動(dòng)物，植物，病毒和藻類中廣泛存在，在植物中成熟體miRNA能通過(guò)切割互補(bǔ)配對(duì)的靶基因mRNA抑制其表達(dá)，而動(dòng)植物中都存在成熟體miRNA結(jié)合到與其互補(bǔ)的mRNA的位點(diǎn)抑制靶基因的翻譯[4]。真菌中miRNA產(chǎn)生機(jī)制與動(dòng)植物中miRNA產(chǎn)生機(jī)制不同，動(dòng)植物中miRNA成熟體依賴Dicer酶剪切作用產(chǎn)生，而在真菌中除了有依賴Dicer酶作用產(chǎn)生miRNA外，還發(fā)現(xiàn)有和Argonaute蛋白QDE-2、核酸外切酶QIP和包含RNase III結(jié)構(gòu)域的蛋白MRPL3結(jié)合產(chǎn)生miRNA的機(jī)制，所以在真菌中它們被稱為miRNA-like（milRNA）[5,6]。從2010年在鏈孢霉（Neurospora）中真菌milRNA首次被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，在西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporumF. sp.niveum），紅色毛蘚菌（Trichophyton rubrum）、小麥銹菌（Puccinia triticina）、金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae）、葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、新月彎孢霉（Curvularia lunata）、核 盤 菌（Sclerotinia sclerotiorum）、馬 爾 尼 菲 青 霉 菌（Penicillium marneffei）、番茄枯萎病菌（Fusarium oxysporumF. sp.lycopersici）、里氏木霉（Trichoderma reesei）和灰蓋鬼傘菌（Coprinopsis cinerea）中相繼報(bào)道了milRNA的鑒定和分析[4,5,7-16]。大部分真菌milRNA鑒定均先通過(guò)與miRbase中植物或動(dòng)物前體和成熟體比對(duì)鑒定保守milRNA，再通過(guò)發(fā)夾結(jié)構(gòu)原則鑒定新型milRNA；進(jìn)而根據(jù)利用軟件預(yù)測(cè)milRNA的靶標(biāo)基因，預(yù)測(cè)其潛在功能。并發(fā)現(xiàn)真菌milRNA對(duì)真菌生長(zhǎng)發(fā)育及致病機(jī)制具有重要調(diào)控作用。

迄今為止，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)期刊文獻(xiàn)報(bào)道香蕉枯萎病致病菌尖孢鐮刀菌（Foc）的小分子RNA（milRNA），僅在孟春亮的碩士論文中提及對(duì)Foc4進(jìn)行的小分子RNA測(cè)序鑒定[17]，但未對(duì)Foc4進(jìn)行降解組測(cè)序?qū)ふ襪ilRNA的靶基因并深入研究。相對(duì)于植物和動(dòng)物，真菌滯后的miRNA研究阻礙了Foc4 milRNA的研究和應(yīng)用。因而，本研究通過(guò)小分子RNA高通量測(cè)序鑒定Foc4菌絲中milRNA，并通過(guò)降解組測(cè)序預(yù)測(cè)milRNA的靶基因，闡述Foc4中milRNA可能的調(diào)控功能，為更好地研究Foc4和香蕉枯萎病奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用香蕉枯萎病菌4號(hào)生理小種購(gòu)于廣東省微生物研究所菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。購(gòu)回后在本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行活化培養(yǎng)，使用18S測(cè)序鑒定其種屬。挑取Foc4菌絲于PDA培養(yǎng)基中28 ℃中恒溫培養(yǎng)9 d，收集平板上真菌菌絲保存于負(fù)80 ℃冰箱中，用于后續(xù)測(cè)序。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 小RNA文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序

將實(shí)驗(yàn)樣本Foc4菌絲送至杭州聯(lián)川生物有限公司進(jìn)行小RNA及降解組測(cè)序。采用天根DP441試劑盒提取其總RNA，然后采用TruSeq Small RNA Sample Prep Kits（Illumina，San Diego，USA）試劑盒按照標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行小RNA文庫(kù)制備。文庫(kù)制備工作完成后，對(duì)構(gòu)建好的文庫(kù)使用Illumina Hiseq2000/2500進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序讀長(zhǎng)為單端1×50 bp。

1.2.2 小RNA測(cè)序數(shù)據(jù)處理

首先對(duì)下機(jī)的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行測(cè)序質(zhì)量評(píng)估，評(píng)估之后再對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。本實(shí)驗(yàn)使用聯(lián)川生物miRNA數(shù)據(jù)分析軟件ACGT101-miR（LC Sciences，Houston，Texas，USA）進(jìn)行分析，該軟件的分析流程如下：（1）去除3’接頭和垃圾序列：獲取clean data；（2）長(zhǎng)度篩選：篩選出clean data中堿基長(zhǎng)度在18～25 nt的數(shù)據(jù)；（3）各種RNA數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析：將18～25 nt序列與不包含miRNA的mRNA、RFam[18]和Repbase數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，若比對(duì)上這些數(shù)據(jù)庫(kù)，則過(guò)濾這些非miRNA數(shù)據(jù)，剩余序列為有效數(shù)據(jù)。

1.2.3 miRNA鑒定

將有效數(shù)據(jù)與miRbase[19]數(shù)據(jù)庫(kù)中植物miRNA和文獻(xiàn)中報(bào)道的真菌[4,7,9,10,12]的前體及成熟體序列比對(duì)，詳見(jiàn)附表3，其中使用的Foc4參考基因組為第三代測(cè)序組裝所得[20]，并且根據(jù)其比對(duì)情況對(duì)其進(jìn)行分組，gp1a是測(cè)序物種本身已報(bào)道的，known miRNAs；gp1b，2a，2b，3是保守的conservative miRNAs，gp2有基因組位置支撐，gp3沒(méi)有基因組位置支撐，gp2a有前體基因支撐，gp2b沒(méi)有前體基因支撐；gp4是新的novel miRNAs；具體各組分類標(biāo)準(zhǔn)如下所示：

（1）gp1a為可以比對(duì)到miRBase已知的首選物種前體（pre-miRNAs），并且前體可以進(jìn)一步比對(duì)到基因組。

（2）gp1b Reads可以比對(duì)到miRBase已知的選擇物種的前體（pre-miRNAs），并且前體可以進(jìn)一步比對(duì)基因因組。

（3）gp2a Reads可以比對(duì)到miRBase選擇物種的前體（pre-miRNAs），前體不能進(jìn)一步比對(duì)到該物種的基因組，但是reads可以比對(duì)到基因組上。延伸的基因組序列可以形成滿足11條原則發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

（4）gp2b Reads可以比對(duì)到miRBase選擇物種的前體（pre-miRNAs），前體不能進(jìn)一步比對(duì)到該物種的基因組，但是reads可以比對(duì)到基因組上。延伸的基因組序列不可以形成滿足11條原則發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

（5）gp3a Reads可以比對(duì)到miRBase選擇物種的前體（pre-miRNAs），前體不能進(jìn)一步比對(duì)到基因組，reads也不可以比對(duì)到基因組上。cluster中比對(duì)上的Reads數(shù)目拷貝數(shù)>1，代表性的Reads分值>260，沒(méi)有錯(cuò)配。

（6）gp4a Reads不能比對(duì)到miRBase選擇物種的前體（pre-miRNAs），reads可以比對(duì)到基因組上。延伸的基因組序列可以形成滿足11條發(fā)夾結(jié)構(gòu)原則。

1.2.4 降解組文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序

降解組測(cè)序的原理：在植物體內(nèi)絕大多數(shù)的miRNA是利用剪切作用調(diào)控靶基因的表達(dá)，且剪切常發(fā)生在miRNA與mRNA互補(bǔ)區(qū)域的第十位核苷酸上。靶基因經(jīng)剪切產(chǎn)生兩個(gè)片段，5’剪切片段和3’剪切片段。其中3’剪切片段，包含有自由的5’單磷酸和3’polyA尾巴，可被RNA連接酶，連接產(chǎn)物可用于下游高通量測(cè)序；而含有5’帽子結(jié)構(gòu)的完整基因，含有帽子結(jié)構(gòu)的5’剪切片段或是其他缺少5’單磷酸基團(tuán)的RNA是無(wú)法被RNA酶連接，因而無(wú)法進(jìn)入下游的測(cè)序?qū)嶒?yàn)；對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行深入地比對(duì)分析，可以直觀地發(fā)現(xiàn)在mRNA序列的某個(gè)位點(diǎn)會(huì)出現(xiàn)一個(gè)波峰，而該處正是候選的miRNA剪切位點(diǎn)。

降解組建庫(kù)包含以下步驟：1.通過(guò)磁珠捕獲mRNA，3.5’adaptor連接；2.Biotinylated Random Primers和mRNA的混合反轉(zhuǎn)錄；3.PCR擴(kuò)增，完成整個(gè)文庫(kù)制備工作后，構(gòu)建好的文庫(kù)用Illumina Hiseq2000/2500進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序讀長(zhǎng)為單端1×50 bp。

1.2.5 降解組測(cè)序數(shù)據(jù)處理及分析將下機(jī)后的降解組數(shù)據(jù)進(jìn)行如下分析：

（1）測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)通過(guò)一系列數(shù)據(jù)處理得到可用于后續(xù)分析的可比對(duì)測(cè)序序列。

（2）將可比對(duì)序列與測(cè)序物種的cDNA數(shù)據(jù)庫(kù)序列比對(duì)生成降解組密度文件（degradome density file）。

（3）通過(guò)剪切位點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件（GSTAr）預(yù)測(cè)出與測(cè)序物種小RNA序列配對(duì)的靶基因mRNA序列。

（4）將預(yù)測(cè)的miRNA對(duì)應(yīng)的靶基因和生成降解組密度文件中的mRNA進(jìn)行結(jié)合運(yùn)算，找出共同具有的mRNA，該mRNA即為miRNA的靶基因。并給出降解組的峰值分類和分值，并對(duì)產(chǎn)生的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行作圖（t-plots）。降解組峰值分類Category 0表示原始數(shù)據(jù)片段在該位置，豐度等于該轉(zhuǎn)錄RNA上的豐度最大值，并且只有1個(gè)最大值；Category 1表示原始數(shù)據(jù)片段在該位置，豐度等于該轉(zhuǎn)錄RNA上的豐度最大值，并且不只1個(gè)豐度最大值；Category 2表示原始數(shù)據(jù)片段在該位置，豐度小于該轉(zhuǎn)錄RNA上的豐度最大值，但卻大于該轉(zhuǎn)錄RNA上的豐度中間值；Category 3表示原始數(shù)據(jù)片段在該位置，豐度小于或等于該轉(zhuǎn)錄RNA上的豐度中間值；Category 4表示原始數(shù)據(jù)片段在該位置，只有1個(gè)與該轉(zhuǎn)錄RNA比對(duì)上。降解組等級(jí)代表milRNA剪切靶基因得到片段的豐度情況，降解組等級(jí)越低代表預(yù)測(cè)的靶基因越可靠。

1.2.6 milRNA功能分析

對(duì)通過(guò)降解組測(cè)序獲得的milRNA靶基因進(jìn)行GO和KEGG功能富集分析，并結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中的代謝通路描述、基因功能預(yù)測(cè)和基因注釋信息，查閱相關(guān)文獻(xiàn)中基因功能，對(duì)milRNA靶基因功能進(jìn)行解析。

2 結(jié)果與討論

2.1 小RNA測(cè)序數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析

如表1所示，小RNA測(cè)序共獲得11783990條原始數(shù)據(jù)（raw reads），原始數(shù)據(jù)去除重復(fù)數(shù)據(jù)后得到unique reads為2326111條。首先去除原始數(shù)據(jù)中接頭和垃圾序列等低質(zhì)量片段，然后對(duì)清潔讀數(shù)進(jìn)行長(zhǎng)度篩選，保留18～25 nt長(zhǎng)度的序列。圖1為18～25 nt長(zhǎng)度序列的統(tǒng)計(jì)分布。將18～25 nt序列與不包含miRNA的mRNA、RFam和Repbase數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，若比對(duì)上這些數(shù)據(jù)庫(kù)，則過(guò)濾這些非miRNA數(shù)據(jù)，剩余序列為有效數(shù)據(jù)（valid reads）。比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)后，獲得有效數(shù)據(jù)條數(shù)3351578條，占原始數(shù)據(jù)的比例為28.44%。有效數(shù)據(jù)去除重復(fù)后得到unique reads為744349條，用于鑒定Foc4中milRNA。

表1 小RNA文庫(kù)組成Table 1 Composition of the small RNA library

圖1 小RNA長(zhǎng)度分布Fig.1 Size distribution of small RNAs

2.2 milRNA的鑒定分析

將測(cè)序得到的valid reads與miRbase中植物和文獻(xiàn)中收集得到的真菌miRNA成熟體及前體序列（附表3）比對(duì)，如表2所示，鑒定獲得Foc4中7個(gè)保守的（conservative）milRNA，包括4個(gè)與真菌比對(duì)上的milRNA（Foc-milR1，F(xiàn)oc-milR2 Foc-milR3和Foc-milR4）和3個(gè)與植物比對(duì)上的milRNA（Foc4-milR5，F(xiàn)oc4-milR6和Foc4-milR7），還有3個(gè)新型的（novel）milRNA（Foc4-novel milR1，F(xiàn)oc4-novel milR2和Foc4-novel milR3），詳細(xì)信息見(jiàn)表1。其中4個(gè)與真菌比對(duì)上的milRNA分組為gp1b，即比對(duì)到miRBase已知的選擇物種的前體（pre-miRNAs），并且前體可以進(jìn)一步比對(duì)到基因組。例如，F(xiàn)oc4中預(yù)測(cè)的Foc4-milR4與番茄枯萎病菌（Fon）中fon-miR-1-m0017比對(duì)上，R-1代表Foc4-milR4右端少掉1個(gè)堿基，且其前體可以進(jìn)一步比對(duì)到Foc4基因組。三個(gè)與植物比對(duì)上的milRNA分組為gp2a，表示可與植物前體比對(duì)上，但該植物前體并不能比對(duì)上Foc4基因組，該成熟體milRNA可以比對(duì)到Foc4基因組上，且在成熟體milRNA周圍延伸的基因組序列可以形成滿足11條發(fā)夾結(jié)構(gòu)原則的前體。Foc4-milR5，F(xiàn)oc4-milR6和Foc4-milR7分別與多個(gè)miRbase已知miRNA比對(duì)上被注釋為：mtr-MIR5229a-p3_2ss16AG18TG，ppe-MIR399k-p5_2ss13GC20GA和zma-MIR162-p3_2ss4GA19AT。Foc4-milR7的注釋為zma-MIR162-p3_2ss4GA19AT表示可與miRbase中玉米（Zea mays）前體MIR162比對(duì)上且位于前體的3’端，且2ss4GA19AT表示在第4個(gè)堿基G由A替換，在第19個(gè)堿基A由T替換，共計(jì)2個(gè)替換，且其分組為gp2b，表示玉米前體MIR162不能比對(duì)上Foc4基因組?？梢园l(fā)現(xiàn)，三個(gè)與植物比對(duì)上的Foc4-milRNA成熟體中都存在兩個(gè)堿基的替換，且比對(duì)上的前體都不能比對(duì)上Foc4基因組，表明miRNA雖然在植物和真菌間有保守的成熟體，但其前體在植物和真菌間變化差異較大。

3個(gè)novel milRNA其分組為gp4a，表示該序列不能比對(duì)上miRbase中已選擇物種的前體，但可以比對(duì)上Foc4基因組上，且延伸基因組序列可以形成滿足11條發(fā)夾結(jié)構(gòu)原則的前體。

圖2 milRNAs前體發(fā)夾結(jié)構(gòu)Fig.2 The hairpin structures of milRNAs precursors

在十個(gè)鑒定milRNA中，F(xiàn)oc4-milR3和Foc4-novel milR3的表達(dá)量較高，表明香蕉枯萎病菌Foc4的milRNA可能具有重要作用。圖2所示為gp2a分組和gp4a分組milRNA的前體發(fā)夾結(jié)構(gòu)。所鑒定的milRNA中最短的Foc4-milR7的前體長(zhǎng)度為56 nt，而最長(zhǎng)的Foc4-novel milR1的前體長(zhǎng)度為233 nt，可以發(fā)現(xiàn)真菌milRNA的前體長(zhǎng)度變化非常大，有研究也發(fā)現(xiàn)在鏈孢霉和灰蓋鬼傘菌中milRNA的前體長(zhǎng)度也非常的靈活[5,16]。

表2 Known and predicted milRNATable 2 Summary of known and predicted milRNA in Foc4

2.3 milRNA靶基因的分析鑒定

進(jìn)而對(duì)Foc4菌絲進(jìn)行降解組測(cè)序，產(chǎn)出原始數(shù)據(jù)27984500條，去除重復(fù)后得到unique raw reads為6695437條，除去3’接頭后剪切位點(diǎn)標(biāo)簽較短（<15 nt）的序列后，能比對(duì)上Foc4轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫(kù)的序列（Mapped Reads）為19773216條，占raw reads的比率為70.66%，unique Mapped Reads為4848061條，占Unique Raw Reads的比率為72.44%（表3），依此生成降解組密度文件。將Targetfinder軟件根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)預(yù)測(cè)的靶基因和降解組測(cè)序所收集到的剪切片段結(jié)合運(yùn)算，找出共同擁有的mRNA，即為Foc4 milRNA的靶基因。

表3 降解組數(shù)據(jù)總覽Table 3 Data summary of degradome sequencing

降解組測(cè)序總共預(yù)測(cè)出53對(duì)milRNA-mRNA，有7個(gè)milRNA通過(guò)降解組測(cè)序發(fā)現(xiàn)其潛在靶基因，分別 為Foc4-milR2，F(xiàn)oc4-milR4，F(xiàn)oc4-milR5，F(xiàn)oc4-milR6，F(xiàn)oc4-milR7，F(xiàn)oc4-novel milR1和Foc4-novel milR3。其中，F(xiàn)oc4-novel milR1所調(diào)控靶基因數(shù)目最多為27個(gè)，其靶基因注釋包括染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重塑復(fù)合亞基snf21（Chromatin structure-remodeling complex subunit snf21），腺苷酸脫氫酶（AMP deaminase），細(xì)胞壁合成蛋白psu1（Cell wall synthesis protein psu1），線粒體ATP合成酶亞基α（ATP synthase subunit alpha，mitochondrial），蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase），ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器CDR4（ABC transporter CDR4），假定螺旋酶mug81（Putative helicase mug81），線粒體細(xì)胞色素b-c1復(fù)合亞基Rieske（cytochrome b-c1 complex subunit Rieske，mitochondrial），過(guò)氧化物生物發(fā)生因子19（Peroxisomal biogenesis factor 19）和孢子壁成熟蛋白DIT1（Spore wall maturation protein DIT1）等。此外，F(xiàn)oc4-milR5調(diào)控14個(gè)靶基因，其中靶基因編碼F型轉(zhuǎn)運(yùn)氫離子的ATPase亞基C（F-type H+-transporting ATPase subunit C），堿性神經(jīng)酰胺酶（alkaline ceramidase），羥異羥乙酸水解酶（hydroxyisourate hydrolase）和CAMKK蛋白激酶（CAMKK protein kinase）等。Foc4-novel milR3是表達(dá)水平最高的milRNA，其靶基因編碼烏頭水合酶（Aconitate hydratase），3-植酸酶A（3-phytase A）和真核翻譯起始因子3亞基B（eukaryotic translation initiation factor 3 subunit B）等。其他milRNA靶基因詳細(xì)信息見(jiàn)表2。圖3列出了幾個(gè)milRNA與其靶標(biāo)基因的T-plot圖，例如圖3a中，F(xiàn)oc4-milR2靶向基因Foc4_580068650，降解組等級(jí)（category）為2，milRNA剪切位點(diǎn)在靶基因1880處（T-plot圖中紅色點(diǎn)標(biāo)記處）。

圖3 T-plot圖Fig.3 T-plot images

從表2中發(fā)現(xiàn)，Targetfinder軟件通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)對(duì)milRNA靶基因進(jìn)行評(píng)分（AllenScore），milRNA所有靶基因均不是完全匹配的，且匹配率最高的milRNA-mRNA的AllenScore為3.5分。在鏈孢霉中絕大多數(shù)milRNA也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)完美匹配的靶基因，推斷真菌milRNA可能靶向不完全互補(bǔ)的序列[5]。Foc4中milRNA也可能是通過(guò)靶向不完全互補(bǔ)的基因發(fā)揮調(diào)控作用。

2.4 靶基因功能分析

圖4 milRNA靶基因GO分類Fig.4 Gene ontology categories of the target genes of Foc4 milRNAs

對(duì)通過(guò)降解組測(cè)序預(yù)測(cè)的milRNA的靶基因進(jìn)行GO富集分析，從圖4可以看出，在分子功能（molecular function）分類中，歸類為分子功能的ATP結(jié)合（ATP binding）條目的基因較多。在細(xì)胞定位（cellular component）分類中，細(xì)胞核（nucleus）條目和細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)（cytosol）條目較多，在生物學(xué)過(guò)程（biological process）分 類 中，蛋 白 質(zhì) 磷 酸 化（protein phosphorylation）和致病機(jī)制（pathogenesis）條目中基因數(shù)較多。表明Foc4中milRNA可能調(diào)控多個(gè)生物學(xué)過(guò)程，具有重要意義。

圖5 milRNAs靶基因KEGG分類Fig.5 KEGG pathways categories of the target genes of Foc4 milRNAs

MilRNA的靶基因能歸入KEGG通路中的基因有20個(gè)。如圖5所示，靶基因歸入氧化磷酸化通路（Oxidative phosphorylation）和嘌呤代謝通路（Purine metabolism）的 基 因 數(shù) 最 多，脂 代 謝 通 路（Glycerophospholipid metabolism），丙酮酸鹽代謝（Pyruvate metabolism）和核糖體通路（Ribosome）次之。從KEGG通路注釋分類圖，可以發(fā)現(xiàn)Foc4 milRNA的靶基因參與多個(gè)代謝過(guò)程。其中表達(dá)量較高的milRNA Foc4-milR4的靶基因Foc4_580004970編碼假定蛋白參與調(diào)控甘油磷脂代謝通路（Glycerophospholipid metabolism），F(xiàn)oc4-novel milR3靶向的Foc4_580043960基因編碼3-植酸酶A（3-phytase A）可參與調(diào)節(jié)硫胺素代謝（Thiamine metabolism）和核黃素代謝（Riboflavin metabolism）。表明Foc4 milRNA可能對(duì)代謝過(guò)程有重要影響。香蕉枯萎病菌能量代謝過(guò)程對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育和致病性有重要作用，本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Foc4-novel milR3的靶基因通過(guò)編碼烏頭水合酶（Aconitate hydratase）參與調(diào)控三羧酸循環(huán)通路，F(xiàn)oc4-milR5靶基因?yàn)镕oc4_580004190編碼F型轉(zhuǎn)運(yùn)H+的ATPase亞基C和Foc4-novel milR1靶基因Foc4_580041730編碼線粒體ATP合成酶亞基α，兩者都是調(diào)控與ATP合成相關(guān)的酶參與氧化磷酸化通路。在葡萄座腔菌響應(yīng)病毒脅迫時(shí)也發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)milRNA調(diào)控代謝過(guò)程[10]。

真菌milRNA不僅可以調(diào)控代謝過(guò)程影響其生長(zhǎng)發(fā)育，也會(huì)影響其致病性。例如，在西瓜枯萎病菌中，發(fā)現(xiàn)Fon-miR7696a-3p和Fon-miR6108a分別靶向單端孢霉毒素（trichothecene）和乙烯誘導(dǎo)肽1（NEP1）調(diào)節(jié)毒素合成[4]；在金龜子綠僵菌和新月彎孢酶中發(fā)現(xiàn)milRNA對(duì)菌絲體生長(zhǎng)和孢子的形成有重要調(diào)控作用，可能影響致病性[9,11]。在本研究中也發(fā)現(xiàn)了一些milRNA調(diào)控致病性相關(guān)基因表達(dá)，例如，F(xiàn)oc4-novel milR1靶向基因Foc4_580051390編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器CDR4。ABC（ATP binding cassette）轉(zhuǎn)運(yùn)器由賦予特異性的跨膜結(jié)構(gòu)域和含有高度保守的氨基酸基序的結(jié)構(gòu)保守的核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成，它們不僅充當(dāng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，也是ATP水解產(chǎn)生的能量的受體或通道[21]。例如CDR4是鏈孢菌唑耐藥的主要原因[22,23]，而在葡萄座腔菌中Bd-milRNA1147靶向ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器可能會(huì)抑制其侵染梨樹(shù)[10,24]。在植物致病菌禾谷鐮刀菌中敲除編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器基因FgABC1和FgABCC9，發(fā)現(xiàn)其對(duì)小麥根系和小麥冠的毒力減弱[25,26]。推測(cè)Foc4-novel milR1可能通過(guò)調(diào)控ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器CDR4影響其毒力。此外，F(xiàn)oc4-novel milR1靶基因Foc4_580122700編碼孢子壁成熟蛋白DIT1（Spore wall maturation protein DIT1），可能與Foc4孢子形成相關(guān)。在新月彎孢酶中也發(fā)現(xiàn)milRNA參與孢子形成[11]。

Foc4在宿主香蕉內(nèi)的生長(zhǎng)發(fā)育和致病性都是影響香蕉枯萎病的重要因素，本研究將為香蕉枯萎病的防治提供新的思路和一定的參考。

3 結(jié)論

本研究利用小分子RNA測(cè)序?qū)ο憬犊菸≈虏【鶩oc4進(jìn)行測(cè)序，共鑒定7個(gè)保守的milRNA和3個(gè)新型的milRNA。利用降解組測(cè)序分析鑒定出53個(gè)受milRNA調(diào)控的潛在靶標(biāo)基因，它們參與調(diào)控多個(gè)代謝通路，包括嘌呤代謝、甘油磷脂代謝、硫胺素代謝和三羧酸循環(huán)通路，對(duì)真菌生長(zhǎng)發(fā)育有重要作用；同時(shí)鑒定到milRNA靶向ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器CDR4和孢子壁成熟蛋白DIT1，可能對(duì)Foc4導(dǎo)致香蕉枯萎病發(fā)病具有重要影響。本研究首次在香蕉枯萎病致病菌Foc4中利用降解組測(cè)序預(yù)測(cè)milRNA靶基因，對(duì)研究真菌milRNA調(diào)控功能提供了重要參考，也為香蕉枯萎病的防治提供了新的思路。