康 超，郝 督，簡思杰，榮 娜，劉 祥*，丁 銳

(1.陜西理工大學 生物科學與工程學院 中德天然產物研究所， 陜西 漢中 723000；2.甘肅新希望六和農牧有限公司， 甘肅 蘭州 730000)

3-羥基苯乙酸、4-羥基苯乙酸、3,4-二羥基苯乙酸是3種重要的化工中間體，廣泛用于醫(yī)藥、染料、農藥等領域[1]。其中，4-羥基苯乙酸被認為是一種潛在的高滲、缺氧的抑制劑[2]，具有抗焦慮[3]、抑菌和防治肺水腫活性特性[4]。3-羥基苯乙酸和3,4-二羥基苯乙酸是神經遞質的內源性代謝物[5]，經小鼠靜脈注射后均表現(xiàn)出抗焦慮活性。細胞色素P450酶系是代謝內源性(激素)和外源性化合物(藥物、農藥)的混合功能氧化酶，是肝臟重要的Ⅰ相代謝酶系，引起人體一系列的藥代動力學變化，負責90%藥物的代謝和多種外源化合物的代謝，可用作藥物之間相互作用的預測[6-8]。因此CYP450酶常用于藥物代謝情況的評價。

本研究應用大鼠肝微粒體孵育法和Cocktail探針法，與美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)推薦的探針底物[9]非那西丁、甲苯磺丁脲、氯唑沙宗和睪酮在體外孵育后，利用液相色譜技術評價不同羥基位點苯乙酸對大鼠主要的CYP450酶系4種亞型CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1和CYP3A4的體外抑制作用，以期探討不同羥基位點苯乙酸的代謝差異，為新藥合成奠定基礎。

1 實驗材料

1.1 實驗試劑

3-羥基苯乙酸(貨號B24111)、4-羥基苯乙酸(貨號B30104)和3,4-二羥基苯乙酸(貨號B21788)，均為分析標準品，購于上海源葉生物科技公司，HPLC純度≥98%；非那西丁、甲苯磺丁脲、氯唑沙宗、睪酮(上海源葉生物科技公司，純度≥98%)；還原輔酶Ⅱ四鈉鹽(NADPH，批號S10103)、色譜甲醇、色譜乙腈(純度≥99.5%)均購于天津市大茂化學試劑廠；改良型BCA測蛋白濃度試劑盒(上海生工有限公司)、冰乙酸(天津市科密歐化學試劑有限公司)；實驗用水為超純水；其他試劑均為分析純。

1.2 實驗儀器

Ultimate 3000高效液相色譜儀含自動進樣器、柱溫箱、在線真空脫氣機、低壓四元梯度泵、DAD檢測器(thermo)；Intersil? ODS-3(日本島津)；ME104E/02型分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；DW-86L388L超低溫冷凍冰箱(青島海爾特種電器有限公司)；1730R微量高速冷凍離心機(韓國基因有限公司)；微量移液器(德國Eppendorf公司)；HH-2數顯恒溫水浴鍋(常州潤華電器有限公司)；全自動雪花制冰機(日本松下電器產業(yè)株式會社)；KQ3200DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；渦旋振蕩儀，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；DHG-9123A電熱恒溫鼓風干燥箱(上海齊欣科學儀器有限公司)；溶劑過濾器(天津市領航實驗設備股份有限公司)。

1.3 實驗動物

健康8周齡雄性SD大鼠3只，體重(200±10) g(西安交通大學實驗動物中心，合格編號SCXK(陜)2018-001)，為SPF級動物。將大鼠飼養(yǎng)在22 ℃、濕度70%、12 h明暗交替環(huán)境下，允許自由進食和飲水，飼養(yǎng)5 d以上，保證充分適應環(huán)境。

2 實驗方法

2.1 肝微粒體的制備及濃度測定

雄性SD大鼠，12 h明暗交替，實驗環(huán)境下適應5 d以上。取樣前12 h禁食不禁水，將大鼠脫頸處死，剖腹后摘取肝臟，用已預冷的生理鹽水沖洗干凈，用剪刀剪碎。稱取肝臟組織，加入質量比為1∶9的生理鹽水，3000 r/min冰浴勻漿20 s，4 ℃條件9000 r/min離心20 min，上清液轉移至含0.2 mL CaCl2(88 mmol)溶液的離心管中，冰浴振搖5 min，27 000g離心20 min。在沉淀中加入400 μL甘油-Tris緩沖液，吹打混勻，于-80 ℃冰箱保存。用BCA法測定所制備的微粒體蛋白濃度，根據試劑盒說明書進行操作，OD562 nm下測定樣品吸光度。以A562吸光值為縱坐標，BSA濃度(μg/mL)為橫坐標，繪制標準曲線，計算所得肝微粒體蛋白濃度。

2.2 標準曲線的建立

精密稱取甲苯磺丁脲、氯唑沙宗、非那西丁、睪酮標準品11.4、9.2、10.4、9.3 mg，以色譜甲醇定容于10 mL容量瓶，渦旋混勻，配成1.14、0.92、1.04、0.93 mg/mL的標準儲備液。配制4組質量濃度分別為6.25、12.50、25.00、50.00、75.00、100.00、125.00 μg/mL的標準溶液，0.22 μm有機微孔濾膜過濾后上HPLC，以探針底物濃度(μg/mL)為橫坐標，不同濃度下所測得的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算標準曲線方程。

2.3 實驗分組及肝微粒體孵育體系

實驗分3組進行，實驗組(3-羥基苯乙酸組、4-羥基苯乙酸組、3,4-二羥基苯乙酸組)、空白對照組(無藥物)和無活性組(無NADPH)，每組實驗平行3樣本。精密稱取3-羥基苯乙酸、4-羥基苯乙酸、3,4-二羥基苯乙酸標準品20.14、16.27、12.65 mg溶于甲醇配制濃度為1 mg/mL的母液。以Tirl-HCl(100 mmol/L，pH 7.4)為溶劑稀釋，制得終濃度為5.00、10.00、20.00、50.00、100.00、200.00 μg/mL的3-羥基苯乙酸、4-羥基苯乙酸、3,4-二羥基苯乙酸溶液。如表1所示為孵育體系，體系在37 ℃恒溫水浴中預孵育5 min后快速加入30 μL的NADPH溶液啟動反應。30 min后立即加入500 μL冰冷甲醇溶液終止反應，4 ℃環(huán)境沉淀蛋白3 h，渦旋振蕩1 min，14 000 r/min離心15 min，取上清液，20 μm有機濾膜過濾上清液上HPLC。

2.4 高效液相色譜檢測方法

Intersil? ODS-3(4.6 mm×150 mm，4 μm)；流速：0.75 mL/min；流動相：流動相(A)乙腈，流動相(B)25 mM乙酸鈉緩沖液；檢測波長范圍：200～350 nm；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；采用梯度洗脫，其程序如表2所示。

表1 大鼠肝微粒體孵育體系加樣表

表2 流動相梯度洗脫程序

2.5 相對酶活性計算

通過建立的探針藥物法檢測物中探針底物的峰面積代入標準曲線中計算底物濃度(無活性組測定值為總底物濃度)代入公式計算相對酶活性：

相對酶活性=(總底物濃度-剩余底物濃度)/總底物濃度×100%。

2.6 數據處理

使用Excel、SPSS 22.0統(tǒng)計軟件和GraphPad Prism 5.0進行數據的處理與分析，連續(xù)型變量采用均數±標準差(x±SD)進行統(tǒng)計學描述，實驗組和空白組采用單因素方差分析。

3 結果與分析

3.1 BCA法蛋白濃度測定

利用BCA法測定制備好的大鼠肝微粒體蛋白濃度，根據試劑盒說明書進行操作，在波長為562 nm處測定樣品的吸光度。以BSA的濃度(mg/mL)為橫坐標，A562吸光值為縱坐標，所得線性回歸方程為y=0.001 4x+0.127 7，相關系數R2=0.995 6，其相關系數達到檢測要求，計算獲得大鼠肝微粒體蛋白濃度為0.4 mg/mL。

3.2 探針藥物的標準曲線

以非那西丁、甲苯磺丁脲、氯唑沙宗、睪酮樣品的濃度為橫坐標，各探針藥物的峰面積為縱坐標，獲得標準曲線，如表3所示。標準品的HPLC色譜圖如圖1所示，表明各物質峰形良好，分離完全，無雜質峰干擾，出峰時間分別為12.180、13.057、13.353、16.013 min，在濃度范圍內，各探針藥物峰面積與濃度均呈良好的線性關系。

表3 大鼠肝微粒體中CYP450酶探針底物的回歸方程

A.非那西??；B.氯唑沙宗；C.甲苯磺丁脲；D.睪酮 圖1 各探針藥物的色譜圖

3.3 CYP450酶系代謝底物剩余濃度

將各組測定的峰面積帶入標準曲線，得出各探針藥物的底物剩余濃度，如表4—表6所示。

表4 3-羥基苯乙酸存在下大鼠肝微粒體中CYP450酶底物的剩余濃度(x±SD，n=3)

表5 4-羥基苯乙酸存在下大鼠肝微粒體中CYP450酶底物的剩余濃度(x±SD，n=3)

表6 3,4-二羥基苯乙酸存在下大鼠肝微粒體中CYP450酶底物的剩余濃度(x±SD，n=3)

3.4 CYP450酶系的相對活性

計算各組藥物的相對酶活性，結果如表7—表9所示。由表中數據得出3-羥基位點苯乙酸在中高濃度時，大鼠肝微粒體中的CYP1A2、CYP2E1和CYP2C9的酶活性相對于空白組有顯著性差異；其濃度在50 μg/mL時，肝微粒體CYP3A4的酶活性有顯著性差異。4-羥基苯乙酸在不同濃度時肝微粒體CYP2C9的酶活性有顯著差異，在高濃度CYP2E1和低濃度CYP3A4的酶活性有顯著性差異。3,4-二羥基苯乙酸在不同濃度時，肝微粒體CYP2C9和CYP2E1的酶活性有顯著差異；在高濃度時，肝微粒體CYP3A4有顯著性差異；在低濃度時，肝微粒體CYP1A2和CYP3A4的酶活性有顯著差異。

3.5 探針底物的IC50值及抑制曲線

利用GraphPad Prism 5.0軟件，以相對酶活性為縱坐標，以不同羥基位點苯乙酸濃度的對數值(lgC)為橫坐標作圖，得到不同羥基位點苯乙酸對CYP450酶系不同亞型的抑制曲線，如圖2—圖4所示。結果顯示：隨著3-羥基苯乙酸濃度的逐漸升高，CYP2E1與CYP3A4的酶活性均有上升趨勢，在濃度達到50 μg/mL后，酶活性到達最大值，隨后酶活性逐漸降低。4-羥基苯乙酸濃度逐漸增大時，CYP1A2、CYP2C9和CYP2E1的酶活性變化趨勢大致相同，在濃度達到100 μg/mL時，CYP1A2、CYP2C9和CYP2E1的酶活性均到達最大值，而CYP3A4則是在4-羥基苯乙酸濃度達到20 μg/mL時，酶活性到達最高值；3,4-二羥基苯乙酸的濃度為10 μg/mL時，4種CYP亞型酶的酶活性均達到最大。

表7 3-羥基苯乙酸對大鼠肝微粒體CYP亞型酶相對活性的影響(x±SD，n=3)

表8 4-羥基苯乙酸對大鼠肝微粒體CYP亞型酶相對活性的影響(x±SD，n=3)

表9 3,4-二羥基苯乙酸對大鼠肝微粒體CYP亞型酶相對活性的影響(x±SD，n=3)

圖2 3-羥基苯乙酸對大鼠肝微粒體中 CYP各亞型酶活性的抑制曲線

通過抑制曲線計算酶活性的IC50值，根據通用的CYP450酶抑制劑強度分級規(guī)則進行分析[10]，表10結果顯示IC50值均大于100，即不同羥基位點苯乙酸對大鼠肝細胞色素P450(CYP450)酶4種亞型CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1和CYP3A4均無顯著抑制作用。但3,4-二羥基苯乙酸對考察的CYP450酶系的4種亞型的IC50值比只有單個羥基位點的3-羥基苯乙酸和4-羥基苯乙酸的數值更小，表明3,4-二羥基苯乙酸對4種CYP亞型酶的抑制趨勢較明顯。

圖3 4-羥基苯乙酸對大鼠肝微粒體中 圖4 3,4-二羥基苯乙酸對大鼠肝微粒體中 CYP各亞型酶活性的抑制曲線 CYP各亞型酶活性的抑制曲線

表10 不同羥基位點苯乙酸組對大鼠肝微粒體各亞型的IC50值

4 討論

近年來，關于藥物單體對于CYP450酶系的代謝研究較常見，但是有關于藥物中間體的報導很少。具有羥基位點的苯乙酸作為一種精細化工中間體，因其自身的特殊結構顯示出抗焦慮和肝保護[11]的生理活性，并可用于合成多種藥物，但它的代謝情況并不清楚。CYP450是藥物代謝主要酶系，藥物在代謝過程中會對CYP450的酶活性產生影響，因此可通過檢測CYP450酶活性變化來探究藥物的代謝情況。CYP450酶更可參與到中藥誘導肝毒性的檢測之中，其活性變化可直接用作中藥毒副作用的參考[12]。本實驗發(fā)現(xiàn)，當3-羥基苯乙酸的濃度逐漸升高時，CYP2E1和CYP3A4的活性均有上調，隨后下降。4-羥基苯乙酸與3,4-二羥基乙酸在隨著藥物的濃度升高，4種肝藥酶的總體活性上升趨勢較為明顯，其中CYP3A4升高趨勢表現(xiàn)一致。3種不同羥基位點的醫(yī)藥中間體，是同分異構體，因此在肝微粒體蛋白的活性曲線具有相似性，可能與其本身的結構相關。黃彧等[13]對厚樸酚、和厚樸酚(同分異構體)在大鼠肝微粒體中的抑制作用研究中發(fā)現(xiàn)，兩者對大鼠肝微粒體中的4種亞型酶(CYP2C、CYP2D6、CYP2E1、CYP2B6)活性均有抑制作用，且隨化合物濃度和預溫育時間增加而增加。本研究在相同視角下，表明3種不同羥基位點的醫(yī)藥中間體，在與這4種酶(CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1、CYP3A4)代謝的藥物進行聯(lián)用時，不存在相互作用，可為臨床藥物使用提供理論依據。

HPLC法操作方便，檢測結果準確，靈敏度高且成本低。李清等[14]利用HPLC檢測探針底物濃度來評價中藥對肝微粒體CYP450酶活性的影響。本實驗通過HPLC方法對4種CYP450亞型酶的探針底物進行檢測，間接獲得了不同位點的羥基苯乙酸對CYP450亞型酶的影響。探針藥物作為CYP450酶的底物，廣泛用于檢測CYP450酶的活性，間接反映藥物在體內的代謝情況。目前，較為成熟的探針藥物有氯唑沙宗、右美沙芬、睪酮、甲苯黃丁脲和奧美拉唑，對應CYP450酶分別為CYP2E1、CYP2D6、CYP3A4、CYP2C9和CYP2C19。Liu等[15]和景嫻等[16]通過檢測氯唑沙宗和右美沙芬的底物濃度，分析了CYP2E1和CYP2D6的活性，從而評價抗生素聯(lián)用在體內引起的肝損傷機理。肝微粒體是研究細胞色素P450(CYP450)酶介導的藥物代謝的理想培養(yǎng)基[17]，肝微粒體含有肝臟表達中所有參與藥物代謝的CYP450酶系，且制備簡單，可長期保存，代謝時間短，結果重現(xiàn)性好，方便大量操作，該法普遍應用于評價藥物代謝[18]。郭艷麗等[19]及張培玉等[20]利用鼠或人肝微粒體模型，研究了中藥成分對CYP450酶系的影響。

本研究制備了濃度為0.4 mg/mL大鼠肝微粒體開展藥物代謝情況研究，發(fā)現(xiàn)不同羥基位點苯乙酸均對大鼠肝微粒體的CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1和CYP3A無抑制作用，藥物安全性高，為不同羥基位點苯乙酸藥物開發(fā)奠定基礎，但存在種屬差異性，人源肝微粒的代謝還需進一步研究探討。