李燦燁，張嘉嘉，龐裕昌，劉靖

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院，廣東佛山 528000）

淫羊藿苷（Icariin，ICA）是一種黃酮苷類化合物，在藥理作用上不僅具有抗炎抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等活性，在治療骨質(zhì)疏松、精神類疾病如阿爾茲海默病、帕金森以及在風(fēng)濕病、腦缺血和動脈粥樣硬化等多種疾病方面也具有很好的療效。

近年來，多項研究已證明淫羊藿苷對肝腫瘤有一定的抑制效果，且具有一定的劑量依賴性[1]。但是淫羊藿苷立體空間較大，在水中的溶解度低、溶出速度慢，生物利用度低[2]，其應(yīng)用受到了極大的限制。近年來，研究人員致力于研究提高淫羊藿苷生物利用度的方法。

β-環(huán)糊精（β-CD）作為一種圓筒狀有機物，具有良好的水溶性，增溶效果好，不僅能夠有效地將淫羊藿苷進行包合并運輸[3]，而且對細(xì)胞無毒性[4]。本實驗將β-環(huán)糊精與淫羊藿苷以99∶1的質(zhì)量比制備生成β-環(huán)糊精淫羊藿苷包合物，將其和淫羊藿苷分別作用于SMMC-S7721和Hep-G2肝癌細(xì)胞，比較研究β-環(huán)糊精淫羊藿苷包合物對SMMC-7721細(xì)胞和Hep-G2細(xì)胞體外增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 細(xì)胞株及培養(yǎng)

實驗所用SMMC-7721細(xì)胞株和Hep-G2細(xì)胞株為中山大學(xué)陶亮課題組所贈。細(xì)胞在含10%胎牛血清、1%的青霉素-鏈霉素溶液的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱條件下培養(yǎng)。

1.1.2 試劑

青霉素-鏈霉素溶液，批號J190007，Gibco公司；RPMI-1640培養(yǎng)基，批號C11995500BT，Gibco公司；胎牛血清，批號1928700，BI公司；胰蛋白酶，批號2062475，Gibco公司；二甲基亞砜，廣州永津生物科技有限公司；CCK-8試劑盒，批號PH687，同仁化學(xué)研究所；淫羊藿苷，薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司；β-環(huán)糊精淫羊藿苷包合物，佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院丁毅力課題組制作。

1.1.3 儀器

KosterCAM KMC-500倒置熒光顯微鏡，Carl Zeiss；Thermo 3111/8038二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，Thermo Fisher Scientific公司；MK3&4MK2酶標(biāo)儀，Bio Tek公司；超凈工作臺，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；IC 1000自動細(xì)胞計數(shù)儀，上海睿鈺生物科技有限公司；TDZ5-WS高速離心機，艾本德中國有限公司；HWS-12恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

配置含10%胎牛血清、1%的青霉素-鏈霉素溶液的RPMI-1640培養(yǎng)液，將SMMC-7721細(xì)胞和Hep-G2細(xì)胞分別轉(zhuǎn)移至裝有5 mL培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱條件下培養(yǎng)，2 d更換一次培養(yǎng)液，并每天記錄細(xì)胞的生長狀況。

1.2.2 酶標(biāo)儀法

檢測淫羊藿苷和β-環(huán)糊精淫羊藿苷包合物對肝癌細(xì)胞體外增殖的抑制作用：收集對數(shù)生長期生長狀況良好的SMMC-7721細(xì)胞和Hep-G2細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化處理后，用含有10%胎牛血清和1%雙抗的培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞懸液，配制成濃度為1×105cell/mL的兩種細(xì)胞懸液，分別接種在96孔板中，每孔接種100 μL細(xì)胞懸液。培養(yǎng)24 h后，β-環(huán)糊精淫羊藿苷包合物組每板分別加入100 μL不同濃度的β-環(huán)糊精淫羊藿苷包合物，使各組包合物終濃度分別為 25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL，每個濃度5個復(fù)孔；淫羊藿苷組分別加入100 μL不同濃度淫羊藿苷，使其終濃度為 25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL，每個濃度5個復(fù)孔，同一96孔板上設(shè)置空白組（培養(yǎng)基組）和對照組（純細(xì)胞組），放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μL CCK-8，孵育3 h，波長為450 nm條件下測定各孔吸光度（OD）值，根據(jù)公式（1）計算細(xì)胞增殖抑制率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS Statistics 25統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果以（±s）表示。不同濃度藥物組、空白組和對照組比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 淫羊藿苷和β-環(huán)糊精淫羊藿苷包合物對SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響

不同濃度的ICA和ICA包合物對Hep-G2細(xì)胞的增殖作用見表1。如表1所示，在藥物作用24 h時，對照組與不同濃度的淫羊藿苷藥物組、β-環(huán)糊精淫羊藿苷包合物組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），表明不同濃度的淫羊藿苷和β-環(huán)糊精淫羊藿苷包合物均對SMMC-7721細(xì)胞具有一定的抑制作用，呈劑量依賴性。同濃度β-環(huán)糊精淫羊藿苷包合物組淫羊藿苷含量是淫羊藿苷組的1%，但對SMMC-7721細(xì)胞的抑制作用明顯，表明β-環(huán)糊精淫羊藿苷包合物能夠有效提高淫羊藿苷抑制SMMC-7721增殖的能力。

表1 不同濃度的ICA和ICA包合物對SMMC-7721細(xì)胞的增殖作用

2.2 淫羊藿苷和β-環(huán)糊精淫羊藿苷包合物對Hep-G2細(xì)胞增殖的影響

不同濃度的ICA和ICA包合物對Hep-G2細(xì)胞的增殖作用見表2。如表2所示，在藥物作用24 h時，正常對照組與不同濃度的淫羊藿苷藥物組、β-環(huán)糊精淫羊藿苷包合物組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；表明不同濃度的淫羊藿苷和β-環(huán)糊精淫羊藿苷包合物均對Hep-G2細(xì)胞均具有一定的抑制作用，且呈劑量依賴性。同濃度β-環(huán)糊精淫羊藿苷包合物組淫羊藿苷含量是淫羊藿苷組的1%，但對Hep-G2細(xì)胞的抑制作用高于淫羊藿苷組，表明β-環(huán)糊精淫羊藿苷包合物能夠明顯提高淫羊藿苷抑制Hep-G2增殖的能力。

表2 不同濃度的ICA和ICA包合物對Hep-G2細(xì)胞的增殖作用

肝癌全球發(fā)病率高，死亡率高[5]，是我國常見的一種惡性腫瘤[6]。淫羊藿苷是從淫羊藿屬植物莖葉中提取的黃酮類有效成分，作為一種具有極其廣泛的藥理作用的中藥單體，具有良好的開發(fā)前景。淫羊藿苷對腦缺血和缺氧癥狀有保護作用[7]，可用于治療帕金森病和阿爾茲海默癥等[8-9]，可幫助骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，改善骨質(zhì)疏松[10]；治療乳腺疾病[11]，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。但由于淫羊藿苷水溶性不佳，生物利用度低，限制了其在臨床與基礎(chǔ)研究里的應(yīng)用價值，因此提高淫羊藿苷的水溶性是當(dāng)前研究的熱點。β-環(huán)糊精是一種優(yōu)秀的藥物包合材料，結(jié)構(gòu)中存在特定的疏水空腔，可以與膽固醇和磷脂等細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)通過主-客體相互作用，促進脂質(zhì)的外流并且調(diào)節(jié)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)[12]。它能夠促進藥物吸收的同時還可以減輕藥物對機體的刺激，同時還作為緩釋和靶向制劑的載體[13]。同時β-環(huán)糊精不僅對藥物具有良好的增溶效果，它在提高生物利用度的同時還能減低藥物的毒性，而且其安全性已被廣泛認(rèn)可[14]。

3 結(jié)語

本實驗顯示，不同劑量的淫羊藿苷和β-環(huán)糊精淫羊藿苷包合物對SMMC-7721細(xì)胞和Hep-G2細(xì)胞均具有一定的增殖抑制作用，特別是對Hep-G2細(xì)胞。含藥量較少的包合物組抑制效果明顯，表明β-環(huán)糊精淫羊藿苷包合物能夠提高淫羊藿苷藥物對這兩種肝癌細(xì)胞的抑制作用，具有較為廣闊的開發(fā)前景。