吳澤承，張嘉嘉，彭紫嫣，林俊濤，楊安平，劉靖

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院，廣東佛山 528000）

口腔癌在全國(guó)癌癥發(fā)病率排名第六[1]，是人體頭頸部的常見腫瘤之一。其中，舌鱗狀細(xì)胞癌的占有量高達(dá)90%，且預(yù)后較差，是患癌患者死亡的主要原因之一[2]。地榆屬薔薇科薔薇亞科植物在全世界有30余種左右，分布于歐洲、亞洲以及北美；我國(guó)有7種，南北各省均有分布[3]。地榆在我國(guó)始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為中品。地榆屬植物中主要含三萜類、黃酮類、鞣質(zhì)類、酚類以及無(wú)機(jī)微量元素和糖類等化學(xué)成分[4]，其中地榆皂苷Ⅰ含量在3.1%～7.7%，地榆皂苷Ⅱ含量在0.16%～0.87%[5]。地榆皂苷Ⅱ分子式為C35H56O8，結(jié)構(gòu)式如圖1所示，是地榆中含有的一種三萜皂苷類化合物，有升高紅細(xì)胞、收縮血管、抗真菌等作用，臨床上用于治療炎癥、燙傷等疾病[6]。同時(shí)，王振龍等[7]研究發(fā)現(xiàn)地榆皂苷Ⅱ作用于癌細(xì)胞，能夠激活癌細(xì)胞中線粒體的凋亡通路，從而達(dá)到抑制細(xì)胞增殖的作用,地榆皂苷Ⅱ?qū)τ谌橄侔┘?xì)胞株MDA-MB-231、乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、卵巢癌細(xì)胞株SKOVE3、胰腺癌細(xì)胞株Capan-1以及肝癌細(xì)胞株HepG2等細(xì)胞系均有增殖抑制作用。目前，對(duì)地榆皂苷Ⅱ抗口腔癌的作用未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)采用臨床最常使用的抗腫瘤藥物紫杉醇作為陽(yáng)性對(duì)照組，觀察地榆皂苷Ⅱ?qū)θ松圜[癌細(xì)胞CAL27增殖能力的影響。

圖1 地榆皂苷Ⅱ結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人舌鱗癌細(xì)胞CAL27細(xì)胞系，武漢普諾賽生命科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基，批號(hào)C11995500BT，Gibco公司；胎牛血清，批號(hào)1928700，BI公司；紫杉醇注射液，批號(hào)0031180202，上海創(chuàng)諾制藥有限公司；地榆皂苷Ⅱ，批號(hào)20181223，佛山市普達(dá)美生物醫(yī)藥科技有限公司；雙抗P/S，批號(hào)J190007，Gibco公司；CCK-8試劑盒，批號(hào)PH687，同仁化學(xué)研究所；胰酶，批號(hào)2062475，Gibco公司。

Thermo 3111/ 8038二氧化碳培養(yǎng)箱，Thermo Fisher Scientific公司；IC 1000細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，上海睿鈺生物科技有限公司；MK3&4MK2酶標(biāo)儀，Bio Tek公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將舌鱗癌細(xì)胞CAL27細(xì)胞系培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。穩(wěn)定后細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，培養(yǎng)2 d后，用胰酶消化，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀顯示每毫升的細(xì)胞個(gè)數(shù)及細(xì)胞活性，待細(xì)胞數(shù)達(dá)到大于（5.0～7.0）×106個(gè)/mL、活性高于90%時(shí)，取細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 溶液配制

配制濃度為6 mg/mL的紫杉醇原液，摩爾濃度為7 030 μmol/L，用培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行梯度稀釋，得到濃度為2 μmol/L、4 μmol/L、6 μmol/L、8 μmol/L、10 μmol/L的紫杉醇溶液。

配制濃度為100 mg/mL的地榆皂苷Ⅱ原液，摩爾濃度為165 000 μmol/L，用培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行梯度稀釋，得到濃度為33 μmol/L、66 μmol/L、99 μmol/L、132 μmol/L、165 μmol/L的地榆皂苷Ⅱ溶液。

1.2.3 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖狀況

將CAL27細(xì)胞接種于兩塊96孔板，每孔接種6 000個(gè)細(xì)胞，分別加入不同濃度的紫杉醇、不同濃度的地榆皂苷Ⅱ。每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，同一96孔板上設(shè)置空白孔（培養(yǎng)基組）和對(duì)照孔（純細(xì)胞組）。培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μL CCK-8檢測(cè)液，培養(yǎng)箱37 ℃孵育4 h，然后用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處各孔吸光度（OD）值。測(cè)完每板OD值后，將細(xì)胞板繼續(xù)放在二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，觀察藥物作用48 h的各孔OD值，根據(jù)公式（1）計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。采用SPSS0軟件包，采用分析-回歸-Probit分析計(jì)算兩種藥物IC50濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用Prism 6.0繪制抑制率曲線，采用SPSS25.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)計(jì)量資料用（±s）表示，多個(gè)樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異顯著，P＜0.001為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度紫杉醇對(duì)CAL27細(xì)胞增殖的影響

使用CCK-8法檢測(cè)不同濃度紫杉醇對(duì)CAL27細(xì)胞作用24 h和48 h后的生長(zhǎng)抑制率。圖2結(jié)果顯示，隨著紫杉醇藥物濃度的增大，藥物對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；藥物作用時(shí)間48 h的抑制作用與24 h相比有所降低，但也呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。24 h紫杉醇半數(shù)抑制濃度IC50是1.93 μmol/L，48 h紫杉醇半數(shù)抑制濃度IC50是7.66 μmol/L。

圖2 不同濃度紫杉醇對(duì)CAL27細(xì)胞作用24 h和48 h后的生長(zhǎng)抑制率

2.2 不同濃度地榆皂苷Ⅱ?qū)AL27細(xì)胞增殖的影響

使用CCK-8法檢測(cè)不同濃度地榆皂苷Ⅱ?qū)AL27細(xì)胞作用24 h和48 h后的生長(zhǎng)抑制率。圖3結(jié)果顯示，24 h后隨著藥物濃度增大，地榆皂苷Ⅱ?qū)?xì)胞增殖抑制作用呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；藥物作用48 h后的抑制作用與24 h相比有所降低，但也呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。本實(shí)驗(yàn)中，24 h紫杉醇半數(shù)抑制濃度IC50為1.93 μmol/L，48 h紫杉醇半數(shù)抑制濃度IC50是7.66 μmol/L；相同培養(yǎng)條件下，24 h地榆皂苷Ⅱ半數(shù)抑制濃度IC50為24.86 μmol/L，48 h半數(shù)抑制濃度IC50為33.58 μmol/L。紫杉醇和地榆皂苷對(duì)CAL27細(xì)胞的增殖都有抑制作用，且呈現(xiàn)量效關(guān)系。

圖3 不同濃度地榆皂苷Ⅱ?qū)AL27細(xì)胞作用24 h和48 h后的生長(zhǎng)抑制率

比較圖2和圖3，可以發(fā)現(xiàn)相比紫杉醇陽(yáng)性對(duì)照組，地榆皂苷Ⅱ模型組在作用24 h和48 h后的生長(zhǎng)抑制率較為接近，說(shuō)明地榆皂苷Ⅱ 48 h時(shí)的藥效下降幅度不大，藥效更持久。

本實(shí)驗(yàn)采用紫杉醇作為陽(yáng)性對(duì)照組，觀察了地榆皂苷Ⅱ?qū)θ松圜[癌細(xì)胞CAL27增殖能力的影響。結(jié)果顯示，地榆皂苷Ⅱ作用細(xì)胞24 h后隨著藥物濃度增大，對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，與對(duì)照組相比差異極顯著（P＜0.001），劉敏等[2]在研究姜黃素聯(lián)合紫杉醇對(duì)人口腔鱗癌細(xì)胞的增殖抑制及凋亡誘導(dǎo)作用中同樣也采用姜黃素梯度濃度作用于CAL27細(xì)胞，其24 h半數(shù)抑制濃度IC50為55 μmol/L，對(duì)比地榆皂苷Ⅱ半數(shù)抑制濃度IC50為24.86 μmol/L，地榆皂苷Ⅱ體現(xiàn)出更好的抑制增殖能力且用藥量少。同時(shí)，借鑒姜黃素聯(lián)合紫杉醇對(duì)人口腔鱗癌細(xì)胞的增殖抑制及凋亡誘導(dǎo)作用研究，也為本實(shí)驗(yàn)的后續(xù)進(jìn)展提供了一定的方向和思路，有助于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開展。

3 結(jié)語(yǔ)

地榆皂苷Ⅱ?qū)θ松圜[癌細(xì)胞CAL27增殖能力的抑制作用呈現(xiàn)量效關(guān)系，其與紫杉醇的48 h抑制率均低于24 h抑制率，且地榆皂苷各濃度下48 h抑制率比24 h抑制率降低的幅度相對(duì)較小，說(shuō)明地榆皂苷Ⅱ抑制效果相對(duì)持久，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。