朱淑敏，屈三甫，呂頌雅

（1.武漢大學(xué) 病毒學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430072；2.武漢大學(xué) 中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，湖北武漢 430072）

手足口病是一種由腸道病毒引起的全球性傳染病之一，流行無明顯地區(qū)性，全年均可發(fā)生，一般夏秋季為發(fā)病高峰。主要病癥為發(fā)熱，手、足、口、臀部出現(xiàn)散在皰疹、斑丘疹，皰疹周圍有炎癥紅暈，可伴有咳嗽、食欲不振等癥狀。部分病例僅表現(xiàn)為皮疹或皰疹性咽峽炎，一般預(yù)后良好；部分重癥患者可出現(xiàn)腦膜炎、腦炎、腦脊髓炎、神經(jīng)源性肺水腫等并發(fā)癥，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡[1-2]。

多種腸道病毒能引起手足口病，其中主要有柯薩奇病毒A組（Coxsakievirus A，CVA）中CVA4、CVA5、CVA6、CVA7、CVA9、CVA10、CVA16型，柯薩奇病毒B組（Coxsakievirus B，CVB）中的CVB1、CVB2、CVB3、CVB5型，?？刹《窘M（Echovirus，E）中E1、E7、E9、E19、E29、E30以及腸道病毒71型（Enterovirus 71）[3]。CVA16和EV71是手足口病的兩種主要致病病原體。盡管大多數(shù)CVA16感染是自限性的，在嬰兒和五歲以下兒童中引起輕度癥狀，但嚴(yán)重的并發(fā)癥如心肌炎、無菌性腦膜炎、肺炎和死亡的病例越來越多[4]。

2015年12月3日，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）批準(zhǔn)了首個(gè)用于預(yù)防重癥手足口病的EV71全病毒滅活疫苗[5]。目前，有3種滅活EV71疫苗已經(jīng)在臨床試驗(yàn)中證明對(duì)EV71-HFMD和EV71相關(guān)疾病起到了實(shí)質(zhì)性的預(yù)防作用，但EV71疫苗對(duì)CVA16沒有交叉保護(hù)作用[6]。

5年病毒學(xué)監(jiān)測(cè)顯示，手足口病病例中因EV71、CVA16和其他腸道病毒所致者分別占43.73%、22.04%和34.22%[7]。這突出了開發(fā)CVA16疫苗以防止CVA16傳播的重要性。然而，了解CVA16的流行情況是研制CVA16疫苗的基本條件。

CVA16屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，是具有二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)的單股正鏈RNA病毒。腸道病毒的RNA基因組由3類區(qū)域組成：非編碼區(qū)包括5′非翻譯區(qū)（5′UTR）和3′非翻譯區(qū)（3′UTR）；結(jié)構(gòu)區(qū)P1包括VP1、VP2、VP3和VP4；非結(jié)構(gòu)區(qū)P2和 P3包 括 2A、2B、2C、3A、3B、3C和 3D[8]。其中VP1 作為病毒中和抗原決定簇編碼基因主要所在部位，因而在研究病毒的變異方面更有意義。根據(jù)VP1基因序列的差異性，CVA16可以分成3種基因型：A、B1和B2。B1基因型還可進(jìn)一步被分成B1a、B1b和B1c基因型[9]。

本研究將從中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心獲取的一份手足口病臨床樣本進(jìn)行分型鑒定，對(duì)VP1區(qū)進(jìn)行測(cè)序，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，確定該病毒株型，為該病毒的進(jìn)一步研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

Vero E6細(xì)胞與手足口病臨床樣本均來源于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2 儀器與試劑

MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胰酶，賽默飛世爾公司；胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司；青霉素-鏈霉素混合溶液（100×），碧云天生物技術(shù)有限公司；二甲基亞砜（DMSO），西格瑪奧德里奇有限公司；氯仿、異丙醇、無水乙醇，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

生物安全柜，新加坡藝思高科技有限公司；倒置熒光顯微鏡、普通倒置顯微鏡，奧林巴斯（中國(guó)）有限公司；NanoDrop 2000c超微量分光光度計(jì)，賽默飛世爾公司；真空泵，其林貝爾公司；離心機(jī)，海蒂詩(shī)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 病毒分離

將Vero E6細(xì)胞復(fù)蘇，采用10%胎牛血清FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)至狀態(tài)良好穩(wěn)定，將細(xì)胞傳代培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到70%時(shí)，在Vero E6細(xì)胞上接種臨床樣本，在37 ℃ CO2培養(yǎng)箱用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h，更換維持液。每日觀察細(xì)胞狀態(tài)及有無致細(xì)胞病變效應(yīng)（Cytopathic Effect，CPE）現(xiàn)象的出現(xiàn)，若7 d內(nèi)細(xì)胞沒有發(fā)生病變，則進(jìn)行盲傳，直至細(xì)胞出現(xiàn)CPE，30%～50%的細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，收集上清，并保存于-80 ℃冰箱中。若盲傳三代仍無CPE出現(xiàn)，則樣品作廢。

1.3.2 RNA提取與VP1序列的獲取

細(xì)胞接種樣品出現(xiàn)CPE后，收取上清，使用Trizol試劑提取RNA，經(jīng)RT-PCR獲取CDNA。設(shè)計(jì)CVA16、EV71的VP1引物（表1）用于病毒VP1序列擴(kuò)增測(cè)序，PCR所有產(chǎn)物均經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，出現(xiàn)目標(biāo)條帶的PCR產(chǎn)物送送去武漢擎科公司測(cè)序。

表1 研究中使用的PCR引物

1.3.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

從GenBank下載22個(gè)已經(jīng)基因分型的CVA16和一個(gè)EV71國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株的VP1基因序列。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室分離的1個(gè)序列，共24條序列用于系統(tǒng)發(fā)育分析。

導(dǎo)出可于MEGA-X分析軟件的meg.格式，用MEGA-X中的Clustal W程序?qū)VA16毒株進(jìn)行VP1全序列比對(duì)。采用鄰接法建立基于部分VP1基因的系統(tǒng)發(fā)育樹。使用500次重復(fù)的bootstrap分析評(píng)估每個(gè)分支的統(tǒng)計(jì)支持，用P距離模型計(jì)算遺傳距離。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞病變

顯微鏡下觀察不同處理下細(xì)胞狀態(tài)，結(jié)果見圖1。將臨床樣品接種到Vero E6細(xì)胞上盲傳三代后，出現(xiàn)了CPE效應(yīng)。

圖1 100×顯微鏡下觀察不同處理下細(xì)胞狀態(tài)

2.2 根據(jù)VP1序列進(jìn)行病毒系統(tǒng)發(fā)育分析

GDV227的VP1區(qū)域系統(tǒng)發(fā)育分析見圖2。利用MEGA-X軟件采用鄰近法對(duì)GDV227株和其他GenBank已發(fā)表的CVA16病毒進(jìn)行VP1基因的進(jìn)化分析，結(jié)果顯示，GDV227為B1b型株。

圖2 GDV227的VP1區(qū)域系統(tǒng)發(fā)育分析

3 結(jié)論

本研究對(duì)來源于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）的一株手足口病病毒的VP1基因進(jìn)行了測(cè)序及進(jìn)化樹分析，結(jié)果表明該毒株為CVA16 B1b型毒株。本鑒定結(jié)果為該病毒的進(jìn)一步研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，對(duì)開展以基因分型為依據(jù)的分子流行病學(xué)調(diào)查、分析和完善手足口病毒流行特點(diǎn)和規(guī)律以及疫苗研發(fā)提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。