李浪，吳桐宇，姚宇峰，黃青麗，嚴(yán)繼舟*

（1.南昌大學(xué) 資源環(huán)境與化工學(xué)院，江西南昌 330031；2.上海賽唐生物技術(shù)有限公司，上海 201308）

目前，治療性重組單克隆抗體（mAb）和Fc融合蛋白在生物制藥市場(chǎng)上占據(jù)主導(dǎo)地位，其市場(chǎng)份額占所有生物治療制劑的35%[1]。mAB等復(fù)雜重組蛋白的生產(chǎn)需要能夠進(jìn)行翻譯后修飾的宿主細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，所以目前的治療性重組蛋白主要由哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)生產(chǎn)[2]。中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO細(xì)胞）能夠在化學(xué)成分明確的無血清培養(yǎng)基中穩(wěn)定持續(xù)生長(zhǎng)，具有良好懸浮培養(yǎng)適應(yīng)力且能進(jìn)行高密度、大量、分批補(bǔ)料培養(yǎng)，經(jīng)過數(shù)十年的發(fā)展和技術(shù)優(yōu)化，目前已經(jīng)成為商業(yè)化生產(chǎn)治療性重組蛋白的首選工程細(xì)胞[3]。2006—2014年，歐盟和美國(guó)批準(zhǔn)上市的112種生物藥物中，有65種是由CHO細(xì)胞表達(dá)生產(chǎn)的[4-5]。而2015—2018年，歐盟和美國(guó)共批準(zhǔn)上市了68種治療性單克隆抗體藥物，其中57種是由CHO細(xì)胞表達(dá)生產(chǎn)的[6]。

CHO細(xì)胞能將表達(dá)的重組蛋白分泌到培養(yǎng)基中，并且超過15%的上清蛋白是目標(biāo)產(chǎn)物[7]。工業(yè)化的CHO細(xì)胞能夠在無血清的培養(yǎng)基中懸浮生長(zhǎng)，以排除血清中不確定的蛋白成分對(duì)重組蛋白的影響。但工業(yè)化生產(chǎn)重組蛋白的方式主要是分批補(bǔ)料培養(yǎng)，活細(xì)胞分泌或死亡細(xì)胞裂解釋放的蛋白質(zhì)會(huì)隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而逐漸積累在培養(yǎng)基中，不可避免地會(huì)對(duì)重組蛋白的質(zhì)量造成影響。

外泌體是由生物活細(xì)胞分泌的細(xì)胞外小囊泡，其中包裹著蛋白質(zhì)、DNA和RNA，能夠介導(dǎo)細(xì)胞間的通信[8-9]。有研究發(fā)現(xiàn)，外泌體也能包裹重組蛋白[10]。因此，外泌體中的蛋白質(zhì)組成與重組蛋白的質(zhì)量也息息相關(guān)，而且外泌體的內(nèi)含物的成分與細(xì)胞種類和狀態(tài)有關(guān)。

為了確定CHO-K1（倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞亞株）細(xì)胞能夠分泌外泌體，同時(shí)鑒定無血清培養(yǎng)條件下CHO-K1細(xì)胞培養(yǎng)上清及外泌體中蛋白質(zhì)的組成成分及性質(zhì)，本研究采用膜親和結(jié)合分離技術(shù)從CHO-K1的培養(yǎng)上清中分離出外泌體，并用透射電鏡復(fù)染法對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，同時(shí)運(yùn)用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)CHO-K1細(xì)胞的培養(yǎng)上清以及提取到的外泌體進(jìn)行蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析，并對(duì)鑒定到的蛋白質(zhì)進(jìn)行基因本體論（GO）注釋分析，為進(jìn)一步研究CHO宿主細(xì)胞蛋白對(duì)重組蛋白的影響提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系來源

CHO-K1細(xì)胞系，購(gòu)于賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司，初始為貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞，經(jīng)無血清馴化后轉(zhuǎn)為懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞。無血清馴化后的細(xì)胞凍存于上海賽唐生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 儀器與試劑

FS-150N超聲儀，上海生析；1129 BBC 8生物安全柜，山東博科生物；QP-160 CO2培養(yǎng)箱，濟(jì)南鑫貝西生物；L530RL醫(yī)用離心機(jī)，湖南湘儀；CKX53緊湊型細(xì)胞培養(yǎng)顯微鏡，OLYMPUS；T75培養(yǎng)瓶，CORNING；3 kDa超濾離心管，Millipore；8～14 kDa透析袋，國(guó)藥；Q Exactive質(zhì)譜儀，Thermo Fisher；Easy-nLC 1000液相色譜儀，Thermo Fisher；CHO細(xì)胞無血清培養(yǎng)基CHO Grow? CD、培養(yǎng)基DMEM/F-12和L-谷氨酰胺，上海源培生物；胰酶-EDTA消化液，Bio-channel；胎牛血清（Fetal bovinc serum），GIBCO；磷酸鹽緩沖液（PBS），海利克思；聚乙二醇 6000（PEG 6000），國(guó)藥；外泌體提取試劑盒（exoRNeasy Serum/Plasma Starter Kit），QIAGEN。

1.2 方法

1.2.1 CHO-K1細(xì)胞無血清培養(yǎng)馴化

為了確保收集到的上清蛋白均來自CHO-K1細(xì)胞，需要先將細(xì)胞馴化至無血清、無蛋白質(zhì)成分的化學(xué)成分限定培養(yǎng)基中。用胰酶-EDTA消化復(fù)蘇后的貼壁細(xì)胞，以1∶2～5的比例分裝到75% DMEM/F-12（A）和25% CHO Grow? CD（B）的混合培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)并及時(shí)傳代，待細(xì)胞完全適應(yīng)當(dāng)前混合比例的培養(yǎng)基后，將細(xì)胞傳至下一個(gè)混合比例的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。重復(fù)上述操作，直到細(xì)胞完全適應(yīng)無血清培養(yǎng)基?；旌吓囵B(yǎng)基的混合比例為75%A+25%B、50%A+50%B、25%A+75%B、5%A+95%B、100%B。待細(xì)胞完全適應(yīng)無血清培養(yǎng)基后，每周按時(shí)傳代兩次。

1.2.2 上清蛋白質(zhì)的提取

當(dāng)CHO-K1細(xì)胞完全適應(yīng)無血清培養(yǎng)基后，待細(xì)胞活力達(dá)到95%以上，細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)70%～80%時(shí)，取20瓶細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，5 000 r/min離心10 min，回收上清。將上清轉(zhuǎn)移到透析袋中，用PEG 6000于4 ℃包埋處理，并及時(shí)更換PEG 6000，當(dāng)透析袋中的液體濃縮到合適體積后，將溶液轉(zhuǎn)移至3 kDa的超濾離心管中進(jìn)行超濾濃縮，并用1×PBS進(jìn)行緩沖液置換，最終將溶液濃縮至1 mL。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)表達(dá)具有時(shí)空性，因此再取培養(yǎng)72 h后的細(xì)胞20瓶，按上述方法操作回收上清蛋白進(jìn)行第二次質(zhì)譜檢測(cè)。

1.2.3 外泌體的分離純化

實(shí)驗(yàn)采用QIAGEN公司的exoRNeasy Serum/Plasma Starter Kit試劑盒收集CHO-K1培養(yǎng)上清中的外泌體。按“1.2.2”的方法濃縮細(xì)胞培養(yǎng)上清，用0.8 μm的過濾器過濾，將上清樣品和外泌體試劑盒中的XBP緩沖液在離心管中按1∶1比例混合，輕輕將離心管上下顛倒5次，混合均勻后加到exoEasy自旋柱上，500 g離心10 min。丟棄濾過液并將離心柱放回原來的收集管中。向離心柱中加入10 mL外泌體試劑盒中的XWP緩沖液，5 000 g離心5 min，棄去過濾液和收集管。將離心柱轉(zhuǎn)移至新的收集管中，向柱中加入400 μL外泌體試劑盒中的XE緩沖液，孵育1 min，500 g離心5 min，收集洗脫液。將洗脫液重新上樣至離心柱上，孵育1 min，500 g離心5 min，收集洗脫液并轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，洗脫液中即為外泌體。

1.2.4 外泌體的鑒定

對(duì)收集到的外泌體采用透射電鏡負(fù)染法進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。質(zhì)譜鑒定外泌體蛋白成分，確定是否有外泌體的標(biāo)志蛋白。

1.2.5 外泌體蛋白質(zhì)的提取

收集得到的外泌體，用超聲儀破碎：80 W超聲2 s，停10 s，循環(huán)60次。12 000 g離心10 min。再取傳代72 h后的細(xì)胞20瓶按上述方法提取外泌體蛋白質(zhì)重復(fù)進(jìn)行第二次蛋白質(zhì)檢測(cè)。

1.2.6 nano LC-ESI-MS-MS質(zhì)譜檢測(cè)

樣本經(jīng)酶解后用Easy nLC液相系統(tǒng)進(jìn)行分離，緩沖液：A液為0.1%甲酸水溶液，B液為0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈為84%）。色譜柱為5 μm C18柱（2 cm×100 μm），分析柱為 3 μm C18柱（75 μm×100 mm），流速300 nL/min，梯度洗脫。經(jīng)色譜分離后的肽段用Q-Exactive質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。質(zhì)譜分析時(shí)間為60 min，正離子模式運(yùn)行，掃描范圍為300～1 800 m/z，質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集方法為每次全掃描（full scan）后采集20個(gè)碎片圖譜（MS2 scan）。二級(jí)質(zhì)譜中動(dòng)態(tài)排除設(shè)置為60.0 s。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

得到原始數(shù)據(jù)采用Mascot 2.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)為中國(guó)倉(cāng)鼠數(shù)據(jù)庫(kù)（Uniprot-CHO）。搜庫(kù)參數(shù)如下：enzyme為Trypsin；missed；cleavage sites設(shè)為2；固定修飾為Carbamidomethyl (C)；動(dòng)態(tài)修飾設(shè)定Oxidation (M)。數(shù)據(jù)庫(kù)檢索鑒定到的蛋白質(zhì)必須通過設(shè)定的過濾參數(shù)FDR≤0.01，score≥20。在得到搜庫(kù)結(jié)果后，滿足unique peptide≥1的為可信蛋白。對(duì)鑒定到的可信蛋白，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因本體論（GO）注釋分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)上清蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定結(jié)果

兩次上清蛋白質(zhì)的質(zhì)譜檢測(cè)總離子流色譜圖見圖1。第一次質(zhì)譜鑒定得到2 697個(gè)蛋白質(zhì)，形成1 281個(gè)蛋白質(zhì)組；第二次質(zhì)譜鑒定得到2 497個(gè)蛋白質(zhì)，形成1 202個(gè)蛋白質(zhì)組。經(jīng)過進(jìn)一步篩選，最終從兩次培養(yǎng)上清樣本中鑒定出蛋白質(zhì)1 243個(gè)。分子量和等電點(diǎn)的分布趨勢(shì)見圖2：培養(yǎng)上清蛋白質(zhì)的分子量范圍在7.4（40S 核糖體蛋白S28，Q99PF7）～559.5（AHNAK蛋白，A0A3L7HVN8）kDa，主要分布在200 kDa以內(nèi)。等電點(diǎn)分布在3.9（酸性富含亮氨酸的核磷蛋白32家族成員A，A0A3L7HQ41）～11.1（組蛋白H2A 1型，G3HDT6），集中分布在4～10。

圖2 上清蛋白質(zhì)分子量及等電點(diǎn)分布

圖1 細(xì)胞培養(yǎng)上清蛋白質(zhì)的質(zhì)譜檢測(cè)總離子流圖

GO注釋結(jié)果如圖3所示，從細(xì)胞成分（CC）上看（圖3A），鑒定到的上清蛋白主要來源于細(xì)胞器和細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，分別占23%和12%。其中標(biāo)志性的細(xì)胞器蛋白如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志蛋白鈣網(wǎng)蛋白（Calreticulin，Q8K3H7）和蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（Protein disulfideisomerase，A0A061I0G5），線粒體標(biāo)志蛋白細(xì)胞色素C（Cytochrome c，G3H2K2）和己糖激酶-1（Hexokinase-1，G3H6T5），溶酶體標(biāo)志蛋白溶酶體相關(guān)膜糖蛋白1和2（Lysosome-associated membrane glycoprotein-1/2，G3HK56/P49130），細(xì)胞膜標(biāo)志蛋白如埃茲蛋白（Ezrin，A0A061IM94）等。除各種細(xì)胞內(nèi)的蛋白外，還有8%的蛋白質(zhì)屬于細(xì)胞外區(qū)域，這些蛋白由細(xì)胞內(nèi)合成后轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，屬分泌蛋白。

圖3 上清蛋白質(zhì)基因本體論注釋結(jié)果

從生物過程（BP）層面來看（圖3B），上清蛋白主要參與細(xì)胞過程（如細(xì)胞死亡、生長(zhǎng)、識(shí)別聚集等過程）和代謝過程，分別占33%和21%。從分子功能來看（圖3C），上清蛋白主要是執(zhí)行分子非共價(jià)結(jié)合功能和催化功能，分別占50%和33%。催化功能則是指具有催化活性的蛋白酶，通過進(jìn)一步的GO注釋發(fā)現(xiàn)，具有水解酶活性的蛋白質(zhì)最多（圖3D）。有研究顯示，這些水解酶是導(dǎo)致重組蛋白質(zhì)量和活性下降的原因之一，如組織蛋白酶D（A0A3L7HWC9）被證明是重組單克隆抗體產(chǎn)生顆粒的原因[11]，基質(zhì)金屬蛋白酶-19（A0A3L7IHE9）會(huì)切割重組蛋白[12-13]，羧肽酶（G3H1D5）則與重組組織型纖溶酶原激活劑（t-PA）、重組人紅細(xì)胞生成素以及重組免疫球蛋白G（IgG）羧基端的賴氨酸和精氨酸異變有關(guān)[14]。

2.2 外泌體鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果見圖4，電鏡下可見清晰的外泌體囊泡結(jié)構(gòu)，直徑在100 nm左右，屬于外泌體的粒徑范圍（30～200 nm）。

圖4 外泌體形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示，樣本中存在外泌體標(biāo)志蛋白：膜連蛋白（Annexin，A0A3L7HVV8）、四次跨膜蛋白（Tetraspanin，G3HRL6）、腫瘤易感蛋白（TSG，A0A061I931）、Rab蛋白（Rab10/Rab11A，A0A3L7HB32/A0A3L7HV57）、熱休克蛋白90（HSP 90，G3HC84）和熱休克蛋白60（HSP 60，P18687）。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定及標(biāo)志蛋白鑒定結(jié)果，確認(rèn)CHO-K1細(xì)胞能夠分泌外泌體。

2.3 外泌體蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定結(jié)果

第一次外泌體樣本的質(zhì)譜檢測(cè)總離子流色譜圖見圖5A，從中共鑒定出2 202個(gè)蛋白質(zhì)，形成963個(gè)蛋白質(zhì)組；第二次細(xì)胞外泌體樣本的質(zhì)譜檢測(cè)總離子流色譜圖見圖5B，從中鑒定出3 047個(gè)蛋白質(zhì)，形成1 550個(gè)蛋白質(zhì)組。經(jīng)過進(jìn)一步的篩選，最終從兩次鑒定中確定了1 259個(gè)可信蛋白質(zhì)。外泌體蛋白質(zhì)分子量和等電點(diǎn)的分布趨勢(shì)見圖6，其分子量最小為5.6 kDa（40S核糖體蛋白S27，G3H513），最大為4 007 kDa（肌連蛋白，G3HAC6，因分子量過大未在圖5中展示），多數(shù)蛋白質(zhì)的分子量集中分布在200 kDa以內(nèi)。等電點(diǎn)則分布在3～12，4～10的蛋白質(zhì)最多。

圖5 外泌體蛋白質(zhì)的質(zhì)譜檢測(cè)總離子流圖

圖6 外泌體蛋白質(zhì)分子量及等電點(diǎn)分布

對(duì)外泌體蛋白的GO注釋結(jié)果見圖7，外泌體是脫離自細(xì)胞的雙層膜結(jié)構(gòu)小囊泡，因此外泌體中的蛋白質(zhì)主要來源于細(xì)胞器和細(xì)胞中的膜結(jié)構(gòu)，分別占24%和13%（圖7A）。從生物功能方面來看（圖7B），外泌體中的蛋白質(zhì)多數(shù)參與細(xì)胞生理過程和代謝過程，分別占34%和19%。從分子功能來看（圖7C），執(zhí)行分子結(jié)合功能和催化活性的蛋白質(zhì)最多，分別占50%和31%；執(zhí)行催化活性的蛋白質(zhì)中，同樣以水解酶的占比最多（圖7）。

圖7 外泌體蛋白質(zhì)基因本體論注釋結(jié)果

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)將CHO-K1細(xì)胞馴化至無血清的培養(yǎng)基中，完全排除了血清中蛋白質(zhì)成分和外泌體成分對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。采用exoRNeasy Serum/Plasma Starter試劑盒從CHO-K1細(xì)胞的培養(yǎng)上清中提取外泌體，結(jié)合透射電鏡的形態(tài)學(xué)鑒定和標(biāo)志蛋白的質(zhì)譜鑒定確定CHO-K1細(xì)胞能夠分泌外泌體。

從培養(yǎng)上清樣本和外泌體樣本中分別鑒定到蛋白質(zhì)1 243種和1 259種?；虮倔w論注釋結(jié)果顯示，上清蛋白及外泌體蛋白主要來自細(xì)胞器和細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)；分子功能的注釋結(jié)果顯示參與分子結(jié)合和催化活性的蛋白質(zhì)最多，執(zhí)行催化功能的蛋白質(zhì)中以具有水解酶活性的蛋白質(zhì)最多，這些蛋白酶的積累很可能是重組蛋白質(zhì)量和活性下降的原因之一。