林俊濤，劉俊，徐紫丹，吳澤承，楊安平，陳鑫，劉靖

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院，廣東佛山 528000）

齲病是口腔常見(jiàn)病，已被世界衛(wèi)生組織列入人類三大重點(diǎn)防治疾病之一[1]。在政府“預(yù)防為主、防治結(jié)合、中西醫(yī)并重”的方針政策下，口腔疾病防治體系逐步健全。變異鏈球菌為常見(jiàn)的致齲菌，因其具有極強(qiáng)的產(chǎn)酸能力[2]，可以腐蝕牙釉質(zhì)，破壞牙齒結(jié)構(gòu)。因此，抑制變異鏈球菌生長(zhǎng)繁殖對(duì)口腔齲齒的預(yù)防和治療將有重要意義。唾液鏈球菌在牙菌斑厭氧鏈球菌中占比大[3]，其菌量減少會(huì)導(dǎo)致口臭，過(guò)多也會(huì)破壞口腔內(nèi)正常的生態(tài)系統(tǒng)[4]。

降真香，又名沙柑木、山油柑、沙塘木等，為蕓香科山油柑屬植物降真香，以根、果、葉入藥，為我國(guó)廣東、云南、廣西、海南等地區(qū)的地道藥材[5]。Lesueur等[6]研究發(fā)現(xiàn)，降真香揮發(fā)油具有廣譜抗菌活性。降真香所含的山油柑等化學(xué)成分對(duì)人體多種細(xì)菌均具有抑制作用，但未見(jiàn)其對(duì)變異鏈球菌（Streptococcus mutans，Sm）、唾液鏈球菌（Streptococcus saliva，Ssa）生長(zhǎng)抑制作用的研究報(bào)道。本研究探究降真香乙醇提取物的氯仿萃取物與乙酸乙酯萃取物對(duì)變異鏈球菌和唾液鏈球菌的抑菌效果，為降真香在口腔領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器

氯仿、乙酸乙酯，分析純，廣州試劑廠；氨芐西林（AMP），北京唯尚立德公司；BHI培養(yǎng)基，Oxoid公司；

MK3&4MK2酶標(biāo)儀，Bio Tek公司；Thermo 3111/8038二氧化碳培養(yǎng)箱，Thermo Fisher Scientific公司。

1.2.1 試驗(yàn)材料

降真香乙醇提取物的氯仿萃取物（0.47 g/mL）、乙酸乙酯萃取物（0.40 g/mL），由佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院楊安平課題組提供，10% DMSO溶解；變異鏈球菌ATCC 25175和唾液鏈球菌ATCC 7073由佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院微生物研究室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 藥液的制備

取20 μL氯仿萃取物加入BHI培養(yǎng)基1 260 μL配成兩管體積為1 280 μL、濃度為7.34 mg/mL的藥液；取40 μL乙酸乙酯萃取物加入BHI培養(yǎng)基1 240 μL配成兩管體積為1 280 μL、濃度為12.5 mg/mL的藥液。取氨芐西林1 μL加入BHI培養(yǎng)基999 μL配成1 000 μL濃度為1 μg/mL的藥液作陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.2 菌液制備

將復(fù)蘇48 h后的變異鏈球菌菌種和唾液鏈球菌菌種接種到含BHI培養(yǎng)基的平板中，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜（37 ℃、5% CO2）培養(yǎng)16～18 h，用移液槍刮取適量菌種，配制0.5麥?zhǔn)蠞岫龋?×108）菌液1 mL梯度稀釋至106（1.5 mL），直接打入平板（做標(biāo)記），取106管1.5 mL+BHI培養(yǎng)基13.5 mL各配置成15 mL終濃度為1×105菌液。

1.2.3 倍比稀釋法

將“1.2.1”中配備的氯仿萃取物藥液按2倍稀釋法溶于BHI液體培養(yǎng)基中，將菌懸液與含藥液的培養(yǎng)基按1∶1的體積比加入96孔板中；使各孔終質(zhì)量濃度分別為3.670 mg/mL、1.835 mg/mL、0.918 mg/mL、0.459 mg/mL、0.229 mg/mL、0.115 mg/mL、0.057 mg/mL、0.029 mg/mL；將乙酸乙酯萃取物同上方法處理，使其各孔終質(zhì)量濃度分別為6.25 mg/mL、3.125 mg/mL、1.563 mg/mL、0.781 mg/mL、0.391 mg/mL、0.195 mg/mL、0.098 mg/mL、0.049 mg/mL；另選兩孔作陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照藥物為1 μL/mL氨芐西林。每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h、20 h，觀察結(jié)果。

1.2.4 抑菌率的測(cè)定

將藥液與菌懸液加入96孔板十字混勻后，置于酶標(biāo)儀上測(cè)定0 h的初始OD600值，于12 h、20 h再次測(cè)定OD600值，按照公式（1）計(jì)算抑菌率。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

各實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。按照α=0.05的檢驗(yàn)水準(zhǔn)，相關(guān)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。P＜0.05，表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 降真香萃取物對(duì)口腔常見(jiàn)菌生長(zhǎng)12 h的影響

如表1和表2所示，降真香乙醇提取物的氯仿萃取物與乙酸乙酯萃取物對(duì)變異鏈球菌生長(zhǎng)12h的影響隨著氯仿萃取物與乙酸乙酯萃取物濃度增高，OD值逐漸減小，抑菌率上升，對(duì)變異鏈球菌的抑制作用越明顯。經(jīng)秩和檢驗(yàn)，各濃度組OD值總體均數(shù)不全相等，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

表2 乙酸乙酯萃取物濃度對(duì)變異鏈球菌和唾液鏈球菌生長(zhǎng)12 h的抑制作用

表1 氯仿萃取物濃度對(duì)變異鏈球菌和唾液鏈球菌生長(zhǎng)12 h的抑制作用

2.2 降真香萃取物對(duì)口腔常見(jiàn)菌生長(zhǎng)20 h的影響

隨著降真香乙醇提取物的氯仿萃取物與乙酸乙酯萃取物濃度增高，其對(duì)應(yīng)OD值逐漸減少，抑菌率上升，對(duì)變異鏈球菌的抑制效果越明顯。經(jīng)秩和檢驗(yàn)，各濃度組OD值總體均數(shù)不全相等，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），結(jié)果見(jiàn)表3和表4。

表4 乙酸乙酯萃取物濃度對(duì)變異鏈球菌和唾液鏈球菌生長(zhǎng)20 h的抑制作用

表3 氯仿萃取物濃度對(duì)變異鏈球菌和唾液鏈球菌生長(zhǎng)20 h的抑制作用

其中當(dāng)降真香乙醇提取物的氯仿萃取物的濃度為3.670 mg/mL時(shí)，其對(duì)唾液鏈球菌的生長(zhǎng)完全抑制，12 h與20 h均無(wú)菌生長(zhǎng)。

如表1～4所示，對(duì)于變異鏈球菌，在較低藥物濃度時(shí)，兩種萃取物OD均值相差不大；當(dāng)藥物濃度較高時(shí)，氯仿萃取物的抑菌效果明顯優(yōu)于乙酸乙酯萃取物。對(duì)于唾液鏈球菌，也可明顯看出氯仿萃取物的抑菌效果明顯優(yōu)于乙酸乙酯萃取物。

藥物治療如早期采用青霉素等是齲病防治的方法之一，雖然有防齲效果，但是長(zhǎng)期使用廣譜抗生素可能會(huì)引起口腔和腸道正常菌群失調(diào)。氟化物是目前研究最多的防齲藥之一，但氟本身卻具有毒副作用和氟釋放不穩(wěn)定、持久性差等缺點(diǎn)。

近年來(lái)，通過(guò)對(duì)口腔致病菌耐藥性的深入研究，發(fā)現(xiàn)其耐藥性在不斷增強(qiáng)[7]。傳統(tǒng)中草藥中有不少具有清熱解毒、抑菌殺菌作用且毒副作用小的藥物[8]。使用中草藥防齲是目前的研究熱點(diǎn)，而其防齲的機(jī)制主要分為兩個(gè)方面：（1）抑制致齲菌的黏附，改變牙菌斑生物膜的結(jié)構(gòu)；（2）對(duì)牙體組織起到再礦化作用[9]。隨著中草藥在抗菌領(lǐng)域的發(fā)展，單體江等人[10]研究發(fā)現(xiàn)降真香的提取物山油柑對(duì)大腸桿菌、樹(shù)青枯病菌等6種菌均有抑制作用，但對(duì)口腔常見(jiàn)致病菌的作用研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究降真香乙醇提取物的氯仿萃取物與乙酸乙酯萃取物對(duì)變異鏈球菌和唾液鏈球菌的抗菌效果，發(fā)現(xiàn)這兩種不同溶劑萃取降真香乙醇提取物均對(duì)兩種菌群有一定的抑制效果。降真香的提取物為紫黑色，初始濃度狀態(tài)下酶標(biāo)儀無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)量其OD值，故本實(shí)驗(yàn)將其進(jìn)行稀釋處理。其中，氯仿萃取物的抑菌效果整體優(yōu)于乙酸乙酯萃取物，氯仿萃取物在濃度為3.670 mg/mL時(shí)甚至有殺菌作用。

4 結(jié)論

降真香萃取物對(duì)變異鏈球菌和唾液鏈球菌的生長(zhǎng)有很好的抑制作用，為降真香作為口腔疾病預(yù)防藥物或材料的開(kāi)發(fā)提供了一定的依據(jù)，但其防齲機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。