張漫露，伍勇，陳存，潘旬，徐坤，薛飛龍

（成都師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院 特色園藝生物資源開(kāi)發(fā)與利用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 611130）

蘭花[1]（Cymbidiumssp）為中國(guó)十大名花之一，具有良好的觀賞、藥用以及食用價(jià)值。蘭花全花皆可入藥[2]，有調(diào)氣和中、止咳、明目、化咳止痰、潤(rùn)肺養(yǎng)陰的功效。蘭花原來(lái)主要用于觀賞，但隨著科技的進(jìn)步與發(fā)展，對(duì)蘭花的研究利用也逐漸發(fā)展起來(lái)。例如，對(duì)蘭科植物精油的提取以及香氣成分的分析[3]，對(duì)蘭花固體清新劑的制作[4]及揮發(fā)油抗菌活性的研究[5]。我國(guó)蘭花年產(chǎn)量在2010年就已經(jīng)達(dá)到1.8億株，隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展和栽培技術(shù)的成熟，2018年蘭花年產(chǎn)量已突破2番。2020年，我國(guó)的精油產(chǎn)量已達(dá)到20 t。隨著精油在化妝品、食品領(lǐng)域的不斷運(yùn)用，消耗量也越來(lái)越大，對(duì)于蘭花精油蒸餾提取中的副產(chǎn)物的利用意識(shí)也越來(lái)越強(qiáng)烈。蘭花產(chǎn)量大，精油提取率低，副產(chǎn)物產(chǎn)量約占原液的70%，具有清幽的香氣。有關(guān)副產(chǎn)物的研究中，石雙妮等[6]發(fā)現(xiàn)玫瑰花精油提取副產(chǎn)物中含有黃酮類化合物及人體所需的礦物質(zhì)元素。

蘭花精油提取過(guò)程中產(chǎn)生副產(chǎn)物，包括除去殘?jiān)奶崛∫海ê?jiǎn)稱提取液）和經(jīng)冷凝所得的蒸餾冷凝液（簡(jiǎn)稱蒸餾液）。目前，關(guān)于蘭花精油的研究資料還較少，特別是其副產(chǎn)物的研究基本是空白。因此，借鑒玫瑰花副產(chǎn)物的研究方法來(lái)研究蘭花精油副產(chǎn)物。對(duì)現(xiàn)有蘭花精油蒸餾提取副產(chǎn)物的礦物質(zhì)元素含量、黃酮含量以及抗氧化性進(jìn)行分析，充分發(fā)掘副產(chǎn)物的潛在價(jià)值。

1 材料與方法

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

JA3003型電子分析天平，上海良平儀器儀表有限公司；DHG-9030A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Xuman-2000y型粉碎機(jī)，永康市鉑歐五金制品有限公司；MJ-03DT型超聲波清洗機(jī)，長(zhǎng)沙明杰儀器有限公司；RE-52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海榮亞生化儀器廠；721G型分光光度計(jì)、AA320N型火焰原子吸收光譜儀，上海儀電分析儀器有限公司。

1.2.2 試劑

蘆丁，HPLC級(jí)，安徽酷爾生物工程有限公司；無(wú)水乙醇，分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；亞硝酸鈉，分析純，天津市亞泰聯(lián)合化工有限公司；硝酸鋁，分析純，東莞市喬科化學(xué)有限公司；氫氧化鈉、抗壞血酸，分析純，無(wú)錫市亞泰聯(lián)合有限公司；DPPH，Biotech Grade級(jí)，合肥巴斯夫生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蒸餾提取精油獲得副產(chǎn)物

將冷凍的蘭花在60 ℃干燥160 min，并用功率為800 W粉碎機(jī)粉碎2 min，過(guò)100目篩后放在干燥潔凈的瓶中保存[9]。準(zhǔn)確稱取10 g蘭花粉末于250 mL燒杯中，按照1∶12的比例加入120 mL蒸餾水。浸泡2 h后在溫度為50 ℃、功率為350 W的條件下進(jìn)行超聲波處理50 min。

將超聲后的混合液倒入蒸餾燒瓶中，組裝蒸餾裝置，將蒸餾燒瓶置于100 ℃的沸水中蒸餾4 h（或6 h），收集蒸餾冷凝液（體積為V1）。將蒸餾燒瓶中的混合物抽濾，濾液置于燒瓶中，在40 ℃條件下旋蒸并用正己烷萃取精油，并將正己烷揮發(fā)完全，得到精油，稱量其重量。將旋蒸機(jī)另一端的副產(chǎn)物（即提取液）收集于離心管中，量取其體積（V2），按照以上方法多批次獲得精油副產(chǎn)物，保存于4 ℃冰箱，用于后續(xù)礦物質(zhì)含量、黃酮物質(zhì)含量、生物活性的檢測(cè)與分析。按照公式1計(jì)算精油副產(chǎn)物得率。

1.3.2 原子吸收光譜測(cè)定提取液中的礦物質(zhì)元素

參考袁慶華[7]有關(guān)食品中金屬元素的測(cè)定方法處理樣品并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 分光光度法測(cè)定提取液中的黃酮含量

按照SZDB/Z349-2019[8]方法進(jìn)行樣品處理，利用回歸方程計(jì)算黃酮含量。

1.3.4 提取液生物活性的研究

通過(guò)DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力、還原能力來(lái)綜合評(píng)價(jià)提取4 h和6 h所得副產(chǎn)物的生物活性[9]，并與維生素C進(jìn)行對(duì)比。DPPH自由基清除率、羥自由基清除率[10]、還原能力[11]根據(jù)公式（2）～（4）計(jì)算。

式（2）中，Axo與Ax分別表示樣品反應(yīng)前后在517 nm波長(zhǎng)下的吸光值，而Ao表示對(duì)照組在此波長(zhǎng)下的吸光值；式（3）中，Aso與As分別表示樣品反應(yīng)前后在510 nm波長(zhǎng)下的吸光值，而A1表示對(duì)照組在此波長(zhǎng)下的吸光值；式（4）中，Ai與Aj分別表示樣品反應(yīng)前后在700 nm波長(zhǎng)下的吸光值，A2表示對(duì)照組在此波長(zhǎng)下的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘭花精油提取工藝中副產(chǎn)物的得率

蘭花精油提取工藝中，副產(chǎn)物的含量測(cè)定如表1所示。蒸餾提取4 h和6 h的精油得率分別為24.12%和25.30%，提取時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)于精油的得率影響較小；蒸餾產(chǎn)物中副產(chǎn)物得率約為57%和70%，隨著蒸餾時(shí)間的延長(zhǎng)可以顯著提高副產(chǎn)物得率。

表1 蘭花副產(chǎn)物含量

2.2 副產(chǎn)物提取液中礦物質(zhì)含量

蘭花副產(chǎn)物提取液中的元素測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，在檢測(cè)出的Fe、Zn、Ca、Mg四種元素中，Mg的含量最高，約含有10.17 μg/mL；隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，檢測(cè)出的金屬元素種類沒(méi)有差異，但各元素含量顯著提高。石雙妮等[6]測(cè)得玫瑰花副產(chǎn)物中也含有Ca、Mg元素，但含量高于蘭花副產(chǎn)物。

表2 提取液中的礦物質(zhì)元素

2.3 副產(chǎn)物提取液中黃酮含量

通過(guò)Excel對(duì)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得出其一元回歸方程為Y=0.535 6X+0.002 3，相關(guān)系數(shù)為0.999 1。測(cè)得提取4 h及6 h的提取液中黃酮的濃度分別為0.082 mg/mL和0.142 mg/mL。這與王明皓等人[12]測(cè)得玫瑰花蒸煮水和連翹花中含有黃酮結(jié)果一致，但本實(shí)驗(yàn)中蘭花副產(chǎn)物黃酮含量更低；隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，黃酮含量也顯著增加。

2.4 提取液抗氧化活性

副產(chǎn)物抗氧化活性的分析結(jié)果見(jiàn)表3。維生素C的IC50（DPPH清除率為50%時(shí)的樣品濃度）為0.523 mg/mL，提取4 h和6 h的提取液的IC50分別為0.629 mg/mL、0.533 mg/mL。因此可以得出，提取液的DPPH自由基清除率均低于維生素C，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，提取液清除效果也增強(qiáng)。羥自由基清除實(shí)驗(yàn)中，維生素C的IC50為0.480 mg/mL，兩種提取液清除率均優(yōu)于維生素C，且隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，清除效果明顯增強(qiáng)。還原能力測(cè)定中，維生素C的IC50為0.522 mg/mL，提取4 h和提取6 h的提取液的還原能力雖低于維生素C，但是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，提取液的還原能力增強(qiáng)。

表3 副產(chǎn)物抗氧化活性分析

3 結(jié)語(yǔ)

對(duì)現(xiàn)有蘭花精油蒸餾提取副產(chǎn)物的礦物質(zhì)元素含量、黃酮含量及抗氧化性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)蘭花精油提取副產(chǎn)物具有一定應(yīng)用價(jià)值，提取蒸餾時(shí)間由4 h增加至6 h可顯著提高其生物活性。