張博慧，賈戴輝，許俊彥

（寶船生物醫(yī)藥科技（上海）有限公司藥物分析部門，上海 201203）

吐溫80又名聚山梨酯80，其化學名為聚氧乙烯20山梨醇酐單油酸酯，作為助溶劑、乳化劑和穩(wěn)定劑，常用于治療性單克隆抗體注射液制劑中[1]。近年來，關(guān)于吐溫80能夠誘發(fā)過敏反應的報道越來越多[2-6]，建立一種準確有效的測定吐溫80含量的方法尤為重要。

目前，用于檢測吐溫80含量的方法主要有比色法[7]、高效液相色譜-蒸發(fā)光散射（HPLC-ELSD）檢測法[8]、水解法[9]、質(zhì)譜法[10-11]等。比色法因?qū)υO(shè)備要求比較低而應用廣泛，但該方法耗時、重復性較差，且對蛋白濃度較高樣品適用性差；HPLC-ELSD法檢測結(jié)果較準確，應用范圍較廣，但是ELSD系統(tǒng)易受蛋白污染而影響檢測結(jié)果；水解法是將吐溫80水解成油酸，利用高效液相色譜-紫外檢測器檢測，該方法耗時較長，易受油酸穩(wěn)定性的影響；質(zhì)譜法需要使用昂貴的儀器，因此使用范圍受限。本研究建立了采用高效液相色譜儀配備熒光檢測器檢測單克隆抗體中吐溫80含量的方法，并進行了方法學驗證。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試品單抗1、單抗2、單抗3均為寶船生物醫(yī)藥科技（上海）有限公司生產(chǎn)的單克隆抗體注射液；Humira（修美樂）購自雅培公司；Opdivo（歐狄沃）購自百時美施貴寶公司；Erbitux（愛必妥）購自默克公司。

1.2 試劑與儀器

吐溫80（藥用級）購自威爾藥業(yè)；十水四硼酸鈉（ACS試劑級）、N-苯基-1-萘胺（NPN， 98%）均購自Sigma公司；氯化鈉（HPLC級）購自阿拉丁公司；乙腈（ACN， HPLC級）購自Fisher公司；反應線圈（Reaction coil 750 μL）購自賽默飛公司；1260高效液相色譜儀，安捷倫，配備熒光檢測器。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件

柱溫箱溫度25 ℃，樣品盤溫度5 ℃，熒光檢測器λex=350 nm、λem=420 nm；流動相為 0.15 mol/L氯化鈉、0.025 mol/L十水四硼酸鈉、5.0% ACN、5.0 mol/L NPN、2.5 mg/L吐溫80；流速1.5 mL/min；進樣量10 μL；等度洗脫。

1.3.2 除蛋白試驗

（1）分別將1倍、3倍、5倍和7倍體積的乙醇-氯化鈉飽和溶液以及5倍體積的乙醇、乙腈加入樣品中，震蕩后離心，取上清測蛋白濃度。將上清干燥后用超純水復溶，上機檢測吐溫80含量。

（2）由3名實驗人員分別用5倍體積的乙醇-氯化鈉飽和溶液沉淀蛋白，進行吐溫80含量的測定。

1.3.3 蛋白干擾試驗

將不含吐溫80的樣品用超純水稀釋至蛋白濃度分別為20 mg/mL、30 mg/mL、40 mg/mL、50 mg/mL和60 mg/mL，應用“1.3.1”色譜條件直接進樣分析。

1.3.4 方法驗證

1.3.4.1 專屬性

分別取陰性對照樣品（不含吐溫80，蛋白濃度20 mg/mL）、不含吐溫80的稀釋緩沖液、濃度為0.1 mg/mL的吐溫80標準液和單抗1進行吐溫80含量檢測，驗證各樣品色譜圖在吐溫80保留時間內(nèi)的出峰情況。

1.3.4.2 精密度

平行取6份單抗1進行吐溫80含量檢測，計算6個結(jié)果的保留時間和吐溫80含量的RSD值進行重復性驗證；由另一名實驗人員重復該操作，計算兩名實驗人員12個結(jié)果的保留時間和吐溫80含量的RSD值，并進行中間精密度驗證。

1.3.4.3 準確度

配制吐溫80含量分別為0.05 mg/mL、0.10 mg/mL和0.80 mg/mL，蛋白含量均為20 mg/mL的樣品進行HPLC檢測，統(tǒng)計各濃度樣品的吐溫80回收率。

1.3.4.4 線性和范圍

將吐溫80標準品分別稀釋至濃度為0.800 mg/mL、0.400 mg/mL、0.200 mg/mL、0.100 mg/mL、0.050 mg/mL和0.025 mg/mL，進行吐溫80含量檢測。以吐溫80含量為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制回歸方程，并計算R2。符合精密度、準確度和線性的吐溫80含量范圍即為該方法的檢測范圍。

1.3.4.5 耐用性

將樣品置于樣品儲存室（5±3）℃內(nèi)，分別于0 h、8 h、24 h和48 h進行吐溫80含量檢測，計算各時間點相對于0 h的吐溫80含量的相對差值。應用不同批號的反應線圈分別進行吐溫80含量的檢測，計算兩個結(jié)果的相對差值。

1.3.5 單克隆抗體注射液中吐溫80含量的測定

應用“1.3.1”色譜條件對6種單克隆抗體注射液進行吐溫80含量的檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 除蛋白研究

為了消除蛋白對檢測結(jié)果的影響，對供試品（單抗1，蛋白濃度20 mg/mL，吐溫80含量0.1 mg/mL）進行除蛋白研究。用不同有機試劑（乙醇、乙腈、乙醇-氯化鈉飽和溶液）及不同比例的乙醇-氯化鈉飽和溶液沉淀蛋白，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，雖然用乙醇沉淀蛋白后吐溫80檢測結(jié)果最高，但是由于其除蛋白效果較差，吐溫80含量結(jié)果偏高有可能是受到蛋白的干擾所致。用乙腈及不同比例的乙醇-氯化鈉飽和溶液除蛋白效果良好，5倍體積的乙醇-氯化鈉飽和溶液吐溫80回收率相對較好。

表1 不同種類和比例有機試劑除蛋白試驗結(jié)果

由3名實驗人員分別平行制備6個樣品，考察除蛋白操作的重復性。，試驗結(jié)果見表2。表2結(jié)果表明，吐溫80的回收率低，重復性差。

表2 不同實驗人員吐溫80檢測結(jié)果

2.2 蛋白質(zhì)干擾試驗

由于除蛋白操作重復性差，吐溫80含量回收率低，因此考慮用直接進樣的方法進行上機檢測，這需要研究蛋白質(zhì)對檢測的干擾。選擇與單抗1吐溫80含量一致的0.1 mg/mL吐溫80標準品作為參比，計算不同蛋白濃度樣品峰面積與0.1 mg/mL吐溫80標準品峰面積的比值，結(jié)果見表3和圖1。結(jié)果表明，在蛋白含量為20～60 mg/mL，蛋白的干擾均較小。值得注意的是，蛋白含量越高，對檢測的干擾越大，因此對于高濃度的蛋白樣品，若選擇該方法進行吐溫80含量的檢測，需要首先評估蛋白對檢測結(jié)果的干擾程度，決定該方法是否適用。

圖1 蛋白干擾試驗

表3 蛋白干擾試驗

2.3 方法學驗證

2.3.1 專屬性

圖2顯示，供試品和0.1 mg/mL吐溫80標準品保留時間和峰面積一致；陰性對照樣品峰和稀釋緩沖液幾乎無干擾（由于流動相中添加了一定比例的吐溫80，所以稀釋緩沖液在吐溫80保留時間內(nèi)出現(xiàn)倒峰，屬正?，F(xiàn)象）。

圖2 專屬性試驗色譜圖

2.3.2 精密度

2.3.2.1 重復性

重復性試驗結(jié)果見表4，由結(jié)果可知，6個結(jié)果中保留時間和吐溫80含量的RSD值分別為0.5%和0.4%。

表4 重復性試驗結(jié)果

2.3.2.2 中間精密度

中間精密度結(jié)果見表5，由結(jié)果可知，2名操作人員12個結(jié)果中保留時間和吐溫80含量的RSD值分別為0.4%和2.2%，說明該方法的精密度良好。

表5 中間精密度試驗結(jié)果

2.3.3 準確度

準確度試驗結(jié)果見表6，結(jié)果表明3個濃度水平的樣品回收率分別為105%、98%和108%，在90%～110%，說明該方法的準確度較高。

表6 準確度試驗結(jié)果

2.3.4 線性和范圍

線性試驗結(jié)果如表7所示，結(jié)果表明在0.025～0.800 mg/mL范圍內(nèi)，吐溫80含量和峰面積線性關(guān)系良好，標準曲線為Y=2×108X-4×106，線性相關(guān)系數(shù)R2為0.999 1。由以上結(jié)果可知，符合重復性、準確度和線性的檢測范圍為0.05～0.80 mg/mL。

表7 線性試驗結(jié)果

2.3.5 耐用性

2.3.5.1 樣品穩(wěn)定性

樣品穩(wěn)定性試驗結(jié)果見表8，結(jié)果表明樣品在儀器樣品儲藏室（2～8 ℃）中放置8 h、24 h和48 h后，吐溫80含量與0 h的相對差值分別為3.0%、4.0%和1.0%，說明樣品在儀器樣品儲藏室內(nèi)放置48 h后對檢測結(jié)果幾乎無影響。

表8 樣品穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.3.5.2 反應線圈批次

反應線圈批次試驗結(jié)果見表9，結(jié)果表明應用不同批次的反應線圈的相對差值為3.3%，說明反應線圈批次對檢測結(jié)果無影響。

表9 反應線圈批次試驗結(jié)果

2.4 方法適用性研究

應用本方法對6種單克隆抗體注射液進行吐溫80含量的檢測，檢測結(jié)果見表10。結(jié)果顯示實測值與理論值的偏差介于0%～15%，準確度較高。

表10 方法適用性研究結(jié)果

在HPLC-FLD方法中，吐溫80膠束可被熒光基團NPN標記，在波長為350 nm的紫外光激發(fā)下發(fā)出波長為420 nm的熒光信號，經(jīng)熒光檢測器檢測后形成色譜圖。該方法會在流動相中添加一定比例的吐溫80，這樣保證了檢測過程中吐溫80含量均大于臨界膠束濃度，從而使檢測結(jié)果更準確[12]。該方法為單克隆抗體注射液中吐溫80含量的測定提供了另一種不同原理的檢測方法，具有分析時間短、操作簡便易行、重復性好、準確可靠以及成本低等優(yōu)點。

3 結(jié)論

本研究表明，中低濃度蛋白含量（＜60 mg/mL）的樣品對吐溫80含量檢測結(jié)果幾乎無干擾，而高濃度的單克隆抗體注射液，蛋白質(zhì)的干擾是不能忽略的，因此消除蛋白對檢測的干擾，提高高濃度蛋白含量樣品的準確性，仍然是本方法需要關(guān)注和研究的內(nèi)容。本研究針對HPLC-FLD法檢測單克隆抗體注射液中吐溫80含量進行了專屬性、精密度、準確度、線性和范圍、耐用性的驗證，并采用不同的單抗注射液進行了該方法的適用性研究，證明該方法適用于中低濃度蛋白含量（＜60 mg/mL）單克隆抗體注射液中吐溫80含量的檢測。