鄭剛，王奇，肖金星，楊志堅，陳沖，趙小立*

（1.浙江大學舟山海洋研究中心，浙江舟山 316100；2.浙江大學生命科學學院，浙江杭州 310058）

膠原蛋白酶是能在一定的pH和溫度下切割膠原蛋白主體螺旋多肽鏈的酶類[1]；膠原蛋白降解酶指的是一類能降解天然非變性膠原蛋白的酶[2]。膠原蛋白酶是重要的商業(yè)化酶，許多細菌來源的膠原蛋白酶已被成功鑒定和表征。盡管海洋中的生物資源豐富，但是這些商業(yè)化酶中很少有海洋來源，特別是海洋細菌。本研究旨在篩選出一株產膠原蛋白酶的海洋細菌，提高水產品加工廠中廢棄物的利用率。通過透明圈法篩出一株產膠原蛋白酶菌株，通過肉眼初步觀察其形態(tài)學特征，隨后提取其16S rRNA序列進行比對，以確定其種屬來源；同時構建進化樹，確定其親緣關系。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

UNIVERSAL HOOD凝膠成像儀，BIO-RAD；eStain L1蛋白染色儀，金斯瑞；R 134 a冷凍離心機，Eppendorf；H1850R醫(yī)用離心機、TG16-WS臺式高速離心機，湖南湘儀；DW-86L386超低溫冰箱，青島海爾；YXQ-LS-50 S Ⅱ高壓蒸汽滅菌鍋、SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱，上海博訊；eclipse E200光學顯微鏡，Nikon；HS-840超凈工作臺，蘇凈安泰；UV-1800分光光度計，Shimadzu；ZQZY-88CN搖床，上海知楚；AL204電子天平、FiveEasy pH計，METTLER TOLEDO。

1.2 材料與試劑

葡萄糖（99%），瓊脂粉、蛋白胨、酵母粉、Triton X-100為分析純，購自上海生工；明膠，三氯乙酸、乙二醇甲醚為分析純，購自阿拉?。欢€原茚三酮，分析純，購自源葉生物；水合茚三酮，分析純，購自阿法埃莎公司；乙酸、乙酸鈉、氯化鈣等為分析純，購自國藥公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、5×非變性蛋白上樣緩沖液，購自上海碧云天。

1.3 溶液制備

劃線培養(yǎng)基：1.0%明膠、1.0%酵母粉、1.0%葡萄糖，加去離子水至1 000 mL，調節(jié)pH至7.5，115 ℃下高溫滅菌20 min；固體培養(yǎng)基還需加入1.5%的瓊脂。

種子發(fā)酵培養(yǎng)基：1.5%蛋白胨、1.5%的葡萄糖、1.0%的酵母粉，再加上七水硫酸鎂0.2 g、磷酸氫二鉀0.1 g、磷酸二氫鉀0.5 g、氯化鈣0.2 g，加去離子水至1 000 mL，調節(jié)pH至7.5，115 ℃下高溫滅菌20 min。

基礎發(fā)酵培養(yǎng)基：0.5%明膠、1.0%蛋白胨、1.0%氯化鈉、1.5%的葡萄糖，加去離子水至1 000 mL，調節(jié)pH至7.5，115 ℃下高溫滅菌20 min。

2 mol/L pH 5.4的乙酸緩沖液：86 mL 2 mol/L的乙酸鈉與14 mL 2 mol/L乙酸混勻，調節(jié)pH至5.4。

茚三酮顯色液：稱取0.85 g水合茚三酮和0.166 8 g二水還原茚三酮，溶于100 mL乙二醇甲醚中，現配現用，避光保存。

0.1 mol/L pH 7.5的Tris-HC1（50 mmol/L氯化鈣）緩沖液：稱取1.21 g Tirs用少量去離子水溶解，并加入0.555 g氯化鈣，調節(jié)pH為7.5，定容至100 mL。

底物溶液：2 g/L的明膠溶液。

洗脫液：稱取0.605 g Tris、0.555 g氯化鈣，吸取2.5 mL Triton X-100溶液，加水混勻定容至100 mL，調節(jié)pH為7.5。

孵育液：稱取1.0%明膠、0.5%氯化鈉，加去離子水至1 000 mL，調節(jié)pH至7.5，115 ℃下高溫滅菌20 min。固體培養(yǎng)基還需加入1.5%的瓊脂。

1.4 產膠原蛋白酶菌株的篩選

1.4.1 初篩

在浙江舟山水產品加工廠污水處理廠中，采集不同處理池的污水和污泥以及近海域的海水。在無菌環(huán)境中，分別取1 mL污水、海水和1 g污泥樣品，使用0.9%的生理鹽水溶液對樣品進行連續(xù)10倍的梯度稀釋。取0.2 mL不同稀釋倍數的樣品均勻涂布在明膠初篩選培養(yǎng)基平板上，于30 ℃下恒溫培養(yǎng)。由于膠原蛋白酶可以降解明膠，而35%的三氯乙酸溶液會使蛋白質變性。因此，當明膠被水解后，菌落周圍的培養(yǎng)基在三氯乙酸作用下會形成肉眼可見的透明圈，以透明圈的大小作為篩選產膠原蛋白酶菌產酶能力的標準。通常情況下，透明圈直徑的大小與菌株產酶能力成正比。因此，挑取透明圈較大、長勢較好的單菌落再培養(yǎng)，作為進一步篩選工作的出發(fā)菌株。

1.4.2 復篩

經過菌株初篩后，分離得到一定數目的菌株。分別取少量菌液點在明膠初篩培養(yǎng)基平板中央，并將平板置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d后，取出平板，均勻涂布35%的三氯乙酸溶液，觀察并記錄平板上形成透明圈的情況。選取透明圈直徑與菌落比值（HC值）較大的初篩菌株進行后續(xù)研究。進一步將所選菌株接入種子培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min條件下在氣浴搖瓶中培養(yǎng)至OD值達到1.0后得到種子培養(yǎng)液。隨后，取2.5 mL不同樣品的種子培養(yǎng)液分別接種至50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中（裝液量為50 mL發(fā)酵液的250 mL錐形瓶）繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)2 d后收集得到的發(fā)酵液（取2 mL樣品，于12 000 r/min、4 ℃下離心10 min，取上清液）。由于茚三酮顯色液檢測甘氨酸濃度時，會受到發(fā)酵液中存在的其他氨基酸分子的干擾，影響實驗的準確度。因此，收集得到的上清液還需進行進一步的處理：經過10 kD、0.5 mL的超濾管超濾，用無菌水沖洗3次，12 000 r/min、4 ℃下離心10 min，再將酶液定容至原體積，即為最終需要檢測的樣品。由于此過程會有酶損耗，實際酶活會比測量值大。每組樣品重復3次平行實驗。

1.5 酶活測定

1.5.1 標準曲線

取6只相同規(guī)格的試管，依次加入濃度為0 mmol/L、0.06 mmol/L、0.12 mmol/L、0.18 mmol/L、0.24 mmol/L、0.30 mmol/L的甘氨酸標準溶液1.0 mL。然后加入1 mL乙酸緩沖液并混勻，加入1 mL茚三酮顯色液，混合后沸水浴15 min，隨后放在自來水中冷卻5 min，加入3 mL 60%乙醇，充分混合后，使用分光光度計在570 nm下測量吸光值。以甘氨酸濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線。

1.5.2 樣品測定

以0.2%的明膠溶液為底物，反應體系為：0.2%的明膠溶液50 μL和0.1 mol/L、pH 7.5的Tris-HCl（含50 mmol/L CaCl2）溶液50 μL混合，粗酶液25 μL，在37 ℃反應0.5 h，加入10%三氯乙酸溶液125 μL終止反應。隨后，加入乙酸緩沖液250 μL，混勻，再加入茚三酮顯色液250 μL，混勻。再將混合溶液置入沸水浴中15 min，后于冷水中冷卻5 min，再加入60%乙醇750 μL。充分混合后，使用分光光度計測量溶液在570 nm下的吸光值。由于茚三酮顯色液不是很穩(wěn)定，在顯色1 h內需測完OD值，否則結果不準確。茚三酮顯色法可以測定體系中的水溶性氨基酸和短肽。通常在采用該方法時會以甘氨酸為標準氨基酸進行檢測。酶活力單位定義為：在37 ℃、pH 7.5條件下，每分鐘水解膠原蛋白產生相當于1 μmol甘氨酸所需的酶量為1個酶活力單位U。為了盡量減小誤差，要求發(fā)酵液現取現測[3]。

1.6 菌種分離純化

經過菌株的復篩后，將得到的菌液通過劃線法在明膠劃線培養(yǎng)基上進行純培養(yǎng)，得到單菌落。

1.7 菌種的保存

將劃線得到的單菌落接種入種子培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為30℃、180 r/min。菌液OD值達到1.0后，取1 mL的菌液與等體積的50%甘油混合，后將混合液移至凍存管，保藏于-80 ℃冰箱中備用。

1.8 生長曲線和產酶曲線的繪制

取凍存管中的菌液，在平板上劃線活化菌株。挑取生長良好的單菌落接種至種子培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min條件下的氣浴搖瓶中培養(yǎng)至OD值達到1.0后得到種子培養(yǎng)液。再取種子液以5%的接種量轉接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，同樣的條件下繼續(xù)培養(yǎng)。從接種時起第一次取樣，然后每隔2 h取樣一次。每次取樣4 mL發(fā)酵液進行檢測：2 mL樣品用于檢測菌株生長情況，以新鮮培養(yǎng)基作為參照測定菌液在OD600下的吸光值；2 mL樣品用于檢測發(fā)酵液中的產酶情況，即采用茚三酮法檢測發(fā)酵液中的酶活。每組樣品重復3次平行實驗。

1.9 菌落和細胞的形態(tài)觀察

取凍存管中的菌液，在平板上劃線活化菌株。挑取生長良好的單菌落接種至種子培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min條件下的氣浴搖瓶中培養(yǎng)至OD值達到1.0后得到種子培養(yǎng)液。取菌液制片后在光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、繁殖方式和運動能力等特征情況。同時，將菌液稀釋后再次劃線，以期得到生長良好、便于觀察的單菌落。30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待平板上長出生長良好的單菌落后，對菌落的形貌特征進行觀測記錄。

1.10 生理生化試驗分析

以《伯杰氏細菌鑒定手冊》和《常用細菌系統(tǒng)鑒定手冊》中所介紹的菌種分類鑒定方法，對篩選得到菌株進行生理生化特征分析。

1.11 分子生物學鑒定

取2 mL篩選得到的菌株種子液，送至杭州擎科生物公司進行菌屬鑒定，并對鑒定結果進行分析。

1.12 明膠酶譜鑒定

在常規(guī)的SDS-PAGE分離膠中加入溶度為1%的明膠，使明膠在分離膠中的終濃度達到0.1%，明膠SDS-PAGE體系如表1所示。上樣緩沖液為非變性還原條件，將發(fā)酵上清液離心后超濾，和上樣緩沖液混勻后靜置10 min，在冰浴的條件下電泳。電泳結束后，搖晃條件下將凝膠在洗脫液中浸泡復性45 min，2次；再在孵育液中搖晃溫浴30 min，2次。之后將凝膠取下來，在蛋白染色儀中染色、脫色，觀察水解帶的出現[4]。

表1 明膠SDS-PAGE體系

2 結果與分析

2.1 菌種篩選

本實驗主要以是否能水解明膠作為初步篩選產膠原蛋白酶菌株的依據。試驗從海水樣中經過菌液富集、平板涂布以及菌株挑選等常規(guī)步驟入手，根據初篩培養(yǎng)基平板上菌株形成透明圈的大小，最終成功分離到了10株具有明顯水解明膠能力的菌株。將這些菌依次命名為YQ-1至YQ-10菌，并利用復篩方法進一步測定每種菌株發(fā)酵液中的產酶活力大小，實驗結果如圖1所示。

圖1 各菌種酶活和對應HC值的大小

根據所測得各菌種所產膠原蛋白酶酶活的高低，結合相對應的菌落水解圈大小，最終確定以菌株YQ-1作為出發(fā)菌種進行后續(xù)的試驗研究，此時該菌的酶活為（12.4±0.4）U/mL，其形成的水解圈如圖2所示。

圖2 菌株YQ-1水解圈

2.2 甘氨酸標準曲線

測定不同濃度甘氨酸的OD570值，制成由圖3所示的甘氨酸標準曲線。該標準曲線可以標定膠原蛋白酶活力，通過曲線擬合得到線性標準方程為y=5.152x，R2=0.995 9＞0.99，數值可用。

圖3 甘氨酸標準曲線

由此可得酶活（U/mL）計算公式如公式（1）所示。

式（1）中，75為甘氨酸的相對分子質量；N為稀釋倍數；30為反應時間。

2.3 菌株YQ-1生長曲線和酶活力曲線

圖4為菌株YQ-1的生長曲線，可以看出其依次經歷了遲滯期、對數期、穩(wěn)定期、衰亡期4個不同的生長時期。從菌株的生長曲線不難發(fā)現，目標菌在培養(yǎng)4 h后，呈現出明顯的指數式增長趨勢；接近14 h時，生長速度則逐漸放緩，隨即達到穩(wěn)定期；穩(wěn)定期持續(xù)10 h后進入衰亡期。而菌株在8 h左右才開始產酶，是由于發(fā)酵培養(yǎng)基中含有明膠，在前幾個小時，菌株產酶量較低，明膠還沒有被降解，培養(yǎng)基中明膠含量高導致溶液呈膠狀，無法測出酶活，在發(fā)酵8 h后，溶液的明膠含量降低，才能檢測出酶活，在40 h左右酶活達到最大，此時菌體濃度開始顯著下降，說明菌體濃度顯著影響菌株產酶。

圖4 YQ-1菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長曲線和產酶曲線

2.4 菌落和細胞的形態(tài)特征

菌株YQ-1在明膠培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)2 d后，出現質地均一的菌落。同時可以觀察到：菌落呈淡黃色，外輪廓規(guī)整且不黏稠，中間凸起，似水滴狀。鏡檢發(fā)現為短桿狀、有鞭毛，革蘭氏陰性。菌落形態(tài)效果如圖5及6所示。

圖5 YQ-1涂布平板形成的菌落形態(tài)

圖6 YQ-1顯微鏡形態(tài)圖

2.5 生理生化試驗結果及分析

以《伯杰氏細菌鑒定手冊》和《常用細菌系統(tǒng)鑒定手冊》中所介紹的菌種分類鑒定方法，對菌株YQ-1進行生理生化特征分析。結果顯示此菌為好氧菌，能對大部分的糖類和少數的醇類合理利用，具有水解酪素、明膠的能力，繁殖速度快，無淀粉酶活力，對生存環(huán)境的溫度要求不高，具體結果如表3所示。

表3 生理生化試驗結果

2.6 分子生物學鑒定

培養(yǎng)并收集YQ-1菌菌液，采用CTAB/NaCl法提取基因組DNA，采用通用引物以基因組DNA為模版進行PCR擴增后得到基因序列的長度為1 396 bp，利用Genbank中的BLAST程序檢索結果表明該菌與嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的相似度極高，幾乎接近100%，因此將其確定為Stenotrophomonas maltophilia YQ-1。同時選擇合適的模式菌株16S rRNA基因序列應用Clustal W (Version 2.0)進行多序列比對，再用Mega 7.0軟件構建出YQ-1菌16S rRNA基因系統(tǒng)進化樹如圖7所示。

圖7 基于16S rRNA序列構建嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌YQ-1與近源菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

3.7 明膠酶譜鑒定結果

活性膠原蛋白變性后以明膠的方式存在，明膠酶和膠原蛋白酶有一定的相似性，活性膠原蛋白容易變性，不易溶解。因此，以明膠為活性底物，制備明膠SDSPAGE，對嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌YQ-1發(fā)酵液進行明膠酶活性分析，產生的胞外明膠酶結果如圖8所示。可以看出，該菌株胞外至少產生2種不同的明膠活性的酶。

圖8 明膠酶活性電泳分析

3 結論

本文從海水樣中篩選出一株能在明膠平板上產生透明圈的菌株，綜合菌株的形態(tài)、生理生化以及16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹分析等方面的試驗結果，菌株YQ-1被鑒定為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌屬；形態(tài)為圓形、淡黃色。對該菌進行產酶試驗發(fā)現，其能夠產生過氧化氫酶、能分解酪素、無淀粉酶活性，能對大部分的糖類和少數的醇類合理利用；此菌為好氧菌，繁殖速度快，生長周期短，對生存環(huán)境的溫度要求不高；該菌還能產生至少2種具有明膠活性的酶。目前，有關膠原蛋白酶活力體系比較成熟的是來源于溶組織梭菌，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的研究報道很少，沒有相關的膠原蛋白酶活力的系統(tǒng)，具備深入優(yōu)化研究的價值。