陽春苗，王秋玲，梁芳，黃艷紅，覃日宏，楊小良

（廣西中醫(yī)藥大學賽恩斯新醫(yī)藥學院，廣西南寧 530223）

無患子，又名油患子、洗手果，為無患子科無患子屬植物，以根與果入藥，主產(chǎn)于我國廣東、廣西、臺灣等長江流域以南地區(qū)[1]。無患子果皮為無患子假種皮，三萜類皂苷是其主要成分，具有抗炎抗菌、清熱化痰、鎮(zhèn)痛、降壓、降膽固醇等藥理作用，也有類肥皂的作用，是醫(yī)藥和日化行業(yè)的一種重要原料，具有良好的市場開發(fā)前景。

文獻報道的從無患子中提取皂苷的方法有多種[2]，其中超聲提取法時間短、操作方便簡單、提取效率高，在天然產(chǎn)物提取中應(yīng)用廣泛。本研究采用Box-Behnken響應(yīng)面法對無患子果皮皂苷的超聲輔助提取工藝進行優(yōu)化，以期為無患子果皮的開發(fā)利用提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

野生無患子果皮，采集于廣西南寧市邕寧區(qū)，經(jīng)鑒定為無患子科植物無患子Sapindus mukorossi Gaertn.的果皮。

1.2 儀器與試劑

高速多功能粉碎機，永康市鉑歐五金制品有限公司；XS105DU電子分析天平，梅特勒-托利多公司；KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；HH-S6數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市醫(yī)療器械廠；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。

齊墩果酸標準品，上海源葉生物科技有限公司；95%乙醇、冰乙酸、甲醇，分析純，西隴化工股份有限公司；香草醛，分析純，天津市光復(fù)精細化工研究所；高氯酸，分析純，上海朗源化工有限公司。

1.3 方法

無患子果皮中的三萜皂苷主要是齊墩果酸型[3]，本實驗以齊墩果酸標準品作為對照品，測定超聲提取法得到的無患子果皮總皂苷含量。

1.3.1 標準曲線的繪制

精密稱取齊墩果酸標準品10 mg，以甲醇溶解后定容至100 mL，得齊墩果酸標準溶液濃度為0.1 mg/mL。取齊墩果酸標準溶液0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL加入6支比色管中，每個濃度設(shè)3個平行樣品，置于70 ℃水浴中揮干甲醇，隨后加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL為顯色劑，搖勻，于70 ℃恒溫水浴鍋中加熱15 min，冰水浴中冷卻3 min，加入5 mL冰醋酸為溶劑，搖勻。以空白溶液作參比，用紫外可見分光光度計在400～600 nm掃描光譜，確定最大吸收波長后以此波長為條件測定吸光度[4]。以橫坐標為齊墩果酸對照品質(zhì)量濃度，縱坐標為吸光度繪制標準曲線，求出回歸方程。

1.3.2 供試品溶液的制備

采摘當年成熟無患子果實，取果皮置于烘箱中60 ℃烘干、粉碎，過20目篩。準確稱取無患子果皮粉末1 g，置于25 mL錐形瓶中，按照設(shè)定的乙醇濃度、物料比和提取時間進行超聲提取，過濾得提取液，將提取液用甲醇定容稀釋100倍即得樣品溶液。精密量取0.2 mL樣品溶液置于比色管，用“1.3.1”處理齊墩果酸標準品的相同方法得到無患子果皮提取物待測溶液，于“1.3.1”下測得的最大吸收波長下測定吸光度，代入回歸方程，計算樣品中總皂苷的得率。

1.3.3 單因素實驗設(shè)計

對乙醇濃度、物料比、提取時間3個影響無患子果皮皂苷提取效果的參數(shù)進行單因素實驗，分別考察乙醇濃度30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%；物料比 1∶ 10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40，（g∶mL）；提取時間10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min 等不同條件對皂苷得率的影響[5]。

1.3.4 響應(yīng)面實驗設(shè)計

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，運用Design-Expert 8.0.6分析軟件，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理，以無患子果皮皂苷得率為響應(yīng)值，以乙醇濃度、物料比、提取時間為自變量，設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化實驗，求出實驗?zāi)Ｐ?，以確定超聲輔助提取無患子果皮皂苷的最優(yōu)工藝[6]。實驗因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計因素及水平

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線

齊墩果酸標準溶液通過香草醛-高氯酸法顯色后在400～600 nm掃描光譜，在547 nm處有最大吸收，得回歸方程為Y=0.058 7X-0.037 4，R2=0.099 91，線性范圍 3～12 μg/mL。

2.2 單因素結(jié)果分析

2.2.1 乙醇濃度影響

按照“1.3.2”無患子果皮皂苷提取處理方法，物料比1∶10、提取時間30 min、乙醇濃度在30%～90%時測得無患子果皮皂苷得率與乙醇濃度的關(guān)系見圖1。

圖1表明，濃度為30%～60%時，皂苷得率隨乙醇濃度的增加而增加，乙醇濃度60%時，得率達到最大為15.33%；乙醇濃度大于60%后，皂苷得率逐漸下降，可能與乙醇濃度增大后溶劑極性降低，雜質(zhì)溶出增多有關(guān)。因此，選擇最佳乙醇濃度為60%。

2.2.2 物料比影響

按照“1.3.2”無患子果皮皂苷提取處理方法，乙醇濃度60%，提取時間30 min，在50 ℃下物料比在1∶10～40時測得無患子果皮皂苷得率與物料比的關(guān)系見圖2。

圖2表明，物料比在1∶10～20，得率呈上升趨勢，在1∶20時得率達到最大為17.43%，說明此條件下的物料濃度差最有利于皂苷的溶出，隨后逐漸下降，可能是其他雜質(zhì)溶出也增加后影響了皂苷的得率。因此，選擇最佳料液比為1∶20。

圖2 物料比對無患子皂苷得率的影響

2.2.3 提取時間影響

按照“1.3.2”無患子果皮皂苷提取處理方法，乙醇濃度60%、物料比1∶20、50 ℃條件下提取時間分別為10～60 min時，測得無患子果皮皂苷得率與提取時間的關(guān)系見圖3。

圖3表明，在10～30 min提取時間內(nèi)，時間越長無患子果皮皂苷得率越高，30 min時得率最大為17.40%，繼續(xù)增加提取時間得率略有下降。說明超聲時間30 min使皂苷在物料和溶劑之間的傳遞已到達平衡，繼續(xù)增加時間不僅皂苷溶出量不會增多，反而會使分子結(jié)構(gòu)遭到破壞。因此，選擇最佳提取時間為30 min。

圖3 提取時間對無患子皂苷得率的影響

2.3 響應(yīng)面實驗結(jié)果與分析

2.3.1 回歸模型建立與分析

根據(jù)試驗設(shè)計方案，共設(shè)計了17個試驗點，由12個析因試驗和5個中心試驗組成，試驗方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計方案及結(jié)果

根據(jù)表2的實驗設(shè)計進行多元回歸擬合分析，以無患子果皮皂苷得率（Y）為指標，擬合后獲得了三因素的二次多項回歸模型為：Y=-6.053 25+0.230 73A+0.992 05B+0.407 55C+0.005 25AB+0.001 2AC-0.005 1BC-0.003 2425A2-0.027 97B2-0.006 467 5C2

為了檢驗無患子果皮皂苷提取工藝回歸方程的有效性，對軟件建立的模型進行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 回歸結(jié)果方差分析

表3顯示，該模型P=0.000 7＜0.001，說明回歸模型差異顯著。失擬項P=0.080 1＞0.05，模型失擬項沒有顯著性差異，擬合性良好可以用于分析實驗結(jié)果。決定系數(shù)R2=0.953 7，說明回歸模型與實際測量值具有較高相關(guān)性，超聲提取無患子果皮皂苷可以用此回歸方程進行結(jié)果預(yù)測。通過表中各因素P值可知，3個因素對超聲提取無患子皂苷得率的影響從大到小依次為B（料液比）、A（乙醇濃度）、C（提取時間）。顯著性影響因素包括A、B、AB、BC、A2、B2、C2，而C、AC為不顯著因素，一次項總體影響顯著（P＜0.05），二次項總體影響極其顯著（P＜0.001）。

為了直觀反應(yīng)分析結(jié)果，利用Design－Expert8.0.6軟件繪制響應(yīng)面分析圖與等高線圖，結(jié)果如圖4所示。

圖4 各因素交互作用對響應(yīng)值的效應(yīng)面與等高線

2.3.2 無患子果皮皂苷超聲提取最優(yōu)工藝驗證

根據(jù)模型回歸方程確定超聲輔助提取無患子果皮皂苷的最佳工藝條件為：乙醇濃度69.43%，物料比1∶21.56，提取時間29.44 min，在此條件下皂苷得率為16.19%。對最佳工藝進行3次重復(fù)平行驗證實驗，結(jié)果皂苷平均得率為16.17%（RSD=0.928%），與模型預(yù)測結(jié)果吻合較好。實驗結(jié)果表明，優(yōu)化的皂苷提取工藝穩(wěn)定可行，重復(fù)性良好，響應(yīng)面法優(yōu)化的參數(shù)具有一定的實用價值。

3 結(jié)論

本實驗在單因素實驗中，研究了不同因素對超聲輔助提取無患子果皮皂苷得率的影響，依據(jù)單因素實驗結(jié)果選取了對得率影響較大的乙醇濃度、物料比和提取時間3個因素進行響應(yīng)面考察，且確定各因素的水平設(shè)置。實驗通過響應(yīng)面優(yōu)化超聲提取無患子果皮皂苷的提取工藝，結(jié)果顯示，乙醇濃度和物料比對得率的影響顯著，提取時間影響不顯著。經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化得出超聲提取無患子果皮皂苷的最佳工藝條件為乙醇濃度69.43%、物料比1∶21.56、提取時間29.44 min，此條件下的得率為16.19%，通過驗證實驗，實際得率值為16.17%，RSD值為0.928%，此法適用于優(yōu)化超聲提取無患子果皮皂苷，為無患子資源的進一步綜合開發(fā)利用提供了實驗依據(jù)。