左明明，胡時先，朱美霞，陳婷

(新疆華春藥業(yè)醫(yī)藥研究院，新疆 烏魯木齊 830000)

太子神悅膠囊為國家五類新藥，處方由太子參、葛根、淫羊藿三味藥材組成，具有補(bǔ)腎填精、溫補(bǔ)腎陽之功效，用于治療中輕度抑郁癥。太子神悅膠囊處方君藥太子參(RadixPseudostellariae)為石竹科植物孩兒參的干燥塊根,具有生津潤肺，益氣健脾的功效?，F(xiàn)代藥效學(xué)研究表明，太子參具有抗疲勞、抗應(yīng)激、增強(qiáng)耐氧能力等作用[1-3]。研究表明，太子參藥材有效部位為多糖成分，小分子糖和低聚糖,如葡萄糖、蔗糖、麥芽糖等[4-5]。余煊[6]對太子神悅膠囊的作用機(jī)制研究表明：太子神悅和其成分淫羊藿苷單體能夠有效提高五羥色胺(5-HT)合成限速酶色氨酸羥化酶II(TPH2)的表達(dá),進(jìn)而升高腦內(nèi)5-HT胺含量。宋宇昕[7]針刺結(jié)合太子神悅膠囊治療心脾兩虛型郁證的臨床療效研究表明：根據(jù)中醫(yī)癥候療效判定標(biāo)準(zhǔn),針?biāo)幗M總有效率為90%。

本實驗主要研究了太子神悅膠囊處方藥材提取工藝，確定最佳提取工藝參數(shù)，開展工藝驗證，為太子神悅膠囊制劑批量規(guī)模生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀(Waters 515系，996 PDA檢測器)，調(diào)溫電熱套(上海予英儀器有限公司)，RE旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器),十萬分之一電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，DHG電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(常州金壇良友儀器有限公司)，UV-1800紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)，752紫外光柵分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，萬分之一電子天平(上海中生科技有限公司),HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)，SHZ-D(III)雙表雙抽循環(huán)水真空泵(鄭州市亞榮儀器有限公司)，ZF-6(ZF-1)三用紫外分析儀(上海精密儀器儀表有限公司)。

1.2 材料

原料：太子參葛根淫羊藿。溶劑：水、食用乙醇。試藥：苯酚(AR)，濃硫酸(AR)，乙腈(色譜純)。對照品：淫羊藿苷對照品，葛根素對照品，D-無水葡萄糖(中國藥品生物制品檢定所)。

2 方法

2.1 太子神悅膠囊太子參藥材提取工藝研究

2.1.1 綜合得分計算方法

綜合得分：D=A×0.4+B×0.6

A：干膏量/最大干膏量×100；B：干膏中有效成分含量/最大干膏有限成分含量×100。

2.1.2 太子參多糖含量測定法

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備[8]，結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=6.321 3x+0.021 2(R2=0.999 6),葡萄糖在0.057 6～0.192 mg/mL之間線性關(guān)系良好。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法檢測樣品含量，計算多糖提取率。

2.1.3 太子參藥材多糖含量測定

精密稱取太子參樣品粗粉0.5 g，用80%乙醇提取1 h，過濾，藥渣用飲用水90 ℃提取2 h，過濾，藥渣加蒸餾水洗滌數(shù)次，洗液并入濾液，蒸餾水定容于100 mL容量瓶中。再取50 mL加蒸餾水定容于100 mL備用，以硫酸苯酚法檢測。

2.1.4 單因素試驗

2.1.4.1 提取溶劑的選擇

太子參主要有效成分為多糖物質(zhì)，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[8-9]，太子參提取溶劑采用純化水、20%乙醇、50%乙醇以及75%乙醇，進(jìn)行單因素試驗：取4份太子參藥材各60 g，破碎后置2 000 mL原底燒瓶中，分別加入20倍量純化水、20%乙醇、50%乙醇以及75%乙醇回流提取3次，2 h/次。合并濾液。以出膏率和總多糖含量為指標(biāo)計算綜合得分。試驗結(jié)果見表1。

表1 提取溶劑單因素試驗結(jié)果表

2.1.4.2 料液比的影響

以飲用水為提取溶劑，取4份60 g量太子參藥材置2 000 mL圓底燒瓶中，分別加入8倍量、12倍量、15倍量及20倍量飲用水。提取3次，2 h/次，合并濾液，取樣。以出膏率和總多糖含量為指標(biāo)計算綜合得分。試驗結(jié)果見表2。

表2 太子參提取料液比單因素試驗結(jié)果表

2.1.4.3 提取時間的影響

以飲用水為提取溶劑，取4份60 g量太子參藥材置2 000 mL圓底燒瓶中，加入20倍量飲用水。提取時間分別為1 h、2 h、3 h、4 h，提取3次，合并濾液，取樣。以出膏率和總多糖含量為指標(biāo)計算綜合得分。試驗結(jié)果見表3。

表3 太子參提取次數(shù)單因素試驗結(jié)果表

2.1.4.4 提取次數(shù)的影響

以飲用水為提取溶劑，取4份60 g量太子參藥材置2 000 mL圓底燒瓶中，加入20倍量飲用水。分別提取1、2、3、4次，2 h/次，合并濾液，取樣。以出膏率和總多糖含量為指標(biāo)計算綜合得分。試驗結(jié)果見表4。

表4 太子參提取次數(shù)單因素試驗結(jié)果表

2.1.5 正交試驗

根據(jù)太子神悅膠囊太子參提取單因素實驗結(jié)果，選料液比、提取時間、提取次數(shù)3個因素，采用L9(34)正交試驗，對太子參藥材提取工藝進(jìn)行考察，確定太子參多糖提取的最佳工藝。實驗因素與水平如表5所示。

表5 正交試驗因素水平表

2.1.6 正交試驗結(jié)果

以提取液干膏率和多糖含量為評價指標(biāo)，計算綜合評價得分。由表6可知，影響太子參多糖提取的各因素主次順序：提取次數(shù)>料液比>提取時間。 太子參最佳工藝為A1B2C2，即料液比為8倍量，提取次數(shù)3次，提取時間3 h。由表7方差分析表明，因素B為顯著因素，隨著提取次數(shù)增加，所得干膏總量增加，但有效部位太子參多糖含量逐漸降低。因此，確定太子參藥材提取的最佳工藝為：取太子參，加入8倍量的飲用水提取3次，3 h/次。

2.1.7 太子參多糖提取最佳工藝驗證

根據(jù)太子參多糖提取正交試驗結(jié)果，以確定的最佳提取工藝開展三批小試驗證。即：取太子參藥材60 g，破碎后置1 000 mL圓底燒瓶中，加入8倍量的飲用水提取3次，3 h/次。

表6 太子參提取正交試驗結(jié)果表

表7 太子參提取正交試驗方差分析表

表8 太子參提取工藝驗證

試驗結(jié)果表8顯示，三批工藝驗證試驗太子參提取液干膏率均值24.7%，多糖含量均值51.54%，RSD%<1,實驗結(jié)果平行。證明太子參藥材提取工藝穩(wěn)定可行。

2.2 太子神悅膠囊葛根、淫羊藿提取工藝研究

2.2.1 綜合得分計算方法

綜合得分：F=A×0.2+B×0.2+C×0.2+D×0.4

A：干膏量/最大干膏量×100；B：干膏中葛根素含量/干膏最大葛根素含量×100;C：干膏中總黃酮含量/干膏最大總黃酮含量×100(干膏總黃酮含量以葛根素計);D：干膏中淫羊藿苷含量/干膏最大淫羊藿苷含量×100

2.2.2 葛根素含量測定法

照高效液相色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄VI D)測定。

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑。乙腈-0.5%磷酸水(10∶90)為流動相；檢測波長為250 nm；柱溫45 ℃。理論塔板數(shù)按葛根素峰計算應(yīng)不低于3 000。

對照品溶液的制備:精密稱取葛根素對照品加甲醇制成每1 mL含80 μg的葛根素溶液。

供試品溶液的制備:取原料藥粉末約32 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加80%乙醇，超聲處理2～5 min，搖勻并定容至刻度。用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取濾液，即得。

測定法:分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各5 μL，分別注入液相色譜儀，測定，即得。

2.2.3 總黃酮含量測定法(以葛根素計)

照品溶液的制備：精密稱取葛根素對照品適量，加無水乙醇制成1 mL中含葛根素0.1 mg的溶液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密吸取葛根素對照溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，用無水乙醇溶解并定容至刻度，搖勻。以無水乙醇作為空白在紫外分光光度計250 nm處測定吸收度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程。

樣品的測定：取原料藥粉末，精密稱定10 mg，置50 mL容量瓶中，各加入80%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻。再精密吸取1 mL，置25 mL容量瓶中，加80%乙醇 稀釋至刻度，搖勻。照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項下的方法，測定吸收度，根據(jù)回歸方程計算供試品溶液中總黃酮的含量，即得。

2.2.4 淫羊藿苷含量測定法

照高效液相色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄VI D)測定。

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗:用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑。乙腈-水(27∶73)為流動相；檢測波長為270 nm；柱溫30 ℃。理論塔板數(shù)按淫羊藿苷峰計算應(yīng)不低于1 500。

對照品溶液的制備:精密稱取淫羊藿苷對照品適量加甲醇制成制成濃度為0.154 mg/mL的淫羊藿苷溶液。

供試品溶液的制備:取原料藥粉末約64 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加入80%乙醇超聲處理5～10 min，搖勻并定容至刻度，經(jīng)微孔濾膜(0.45 μm)濾過，濾液備用。

測定法:分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

2.2.5 單因素試驗

2.2.5.1 提取溶劑的選擇

太子神悅膠囊處方藥材葛根、淫羊藿主要提取的有效部位為黃酮類化合物及苷類化合物，根據(jù)兩類化合物特點設(shè)計采用30%乙醇、60%乙醇、80%乙醇以及95%乙醇為提取溶劑。通過單因素試驗確定兩味藥材最佳乙醇提取濃度。

試驗方法：取葛根藥材40 g,淫羊藿藥材20 g，混合后置2 000 mL原底燒瓶中，分別加入20倍量30%乙醇、60%乙醇、80%乙醇以及95%乙醇回流提取3次，2 h/次。合并濾液。以出膏率、總黃酮含量、葛根素含量、淫羊藿苷含量為指標(biāo)計算綜合得分。試驗結(jié)果見表9。

表9 提取溶劑單因素試驗結(jié)果表

2.2.5.2 料液比的影響

以80%乙醇為提取溶劑，取葛根藥材40 g,淫羊藿藥材20 g，混合后置2 000 mL原底燒瓶中，分別加入8倍量、12倍量、15倍量及20倍量80%乙醇。提取3次，2 h/次，合并濾液，取樣。以出膏率、總黃酮含量、葛根素含量、淫羊藿苷含量為指標(biāo)計算綜合得分。試驗結(jié)果見表10。

表10 料液比單因素試驗結(jié)果表

2.2.5.3 提取時間的影響

以80%乙醇為提取溶劑，取葛根藥材40 g，淫羊藿藥材20 g，混合后置2 000 mL原底燒瓶中，加入20倍量80%乙醇提取，提取時間分別為1 h、2 h、3 h、4 h，提取3次，合并濾液，取樣。以出膏率、總黃酮含量、葛根素含量、淫羊藿苷含量為指標(biāo)計算綜合得分。試驗結(jié)果見表11。

表11 料液比單因素試驗結(jié)果表

2.2.5.4 提取次數(shù)的影響

以80%乙醇為提取溶劑，取葛根藥材40 g,淫羊藿藥材20 g，混合后置2 000 mL原底燒瓶中，提取次數(shù)分別為1次、2次、3次、4次，合并濾液，取樣。以出膏率、總黃酮含量、葛根素含量、淫羊藿苷含量為指標(biāo)計算綜合得分。試驗結(jié)果見表12。

表12 提取次數(shù)單因素試驗結(jié)果表

2.2.6 正交試驗

根據(jù)太子神悅膠囊葛根、淫羊藿提取單因素試驗結(jié)果，選料液比、提取時間、提取次數(shù)3個因素，采用L9(34)正交試驗，對葛根、淫羊藿藥材提取工藝進(jìn)行考察，確定葛根、淫羊藿提取的最佳工藝。試驗因素與水平如表13所示。

表13 正交試驗因素水平表

2.2.7 正交試驗結(jié)果

以提取液出膏率、總黃酮含量、葛根素含量、淫羊藿苷含量為評價指標(biāo)，計算綜合評價得分。由表14可知，影響太子參多糖提取的各因素主次順序：提取次數(shù)>料液比>提取時間。葛根、淫羊藿最佳工藝為A2B3C1，即料液比為12倍量，提取次數(shù)3次，提取時間1 h。由表15方差分析表明，因素B為顯著因素，A、C為不顯著因素。因此，確定葛根、淫羊藿藥材提取的最佳工藝為：取處方比例葛根、淫羊藿藥材，加入12倍量的飲用水提取3次，1 h/次。

2.3 葛根、淫羊藿提取最佳工藝驗證

根據(jù)葛根、淫羊藿提取正交試驗結(jié)果，以確定的最佳提取工藝開展三批小試驗證。即：取葛根藥材40 g，淫羊藿藥材20g，混勻后置1 000 mL圓底燒瓶中，加入12倍量的飲用水提取3次，1 h/次。

表14 葛根、淫羊藿提取正交試驗結(jié)果表

表15 葛根、淫羊藿提取正交試驗方差分析表

表16 葛根、淫羊藿提取工藝驗證結(jié)果表

試驗結(jié)果表16顯示，三批工藝驗證試驗總黃酮(以葛根素計)含量均值81.07%，葛根素含量均值62.10%，淫羊藿苷含量均值71.91%，RSD%<1,實驗結(jié)果平行。證明葛根、淫羊藿藥材提取工藝穩(wěn)定可行。

3 結(jié)果

3.1 太子神悅膠囊太子參藥材提取工藝

結(jié)果表明，太子參藥材最佳提取純化工藝如下：取處方量太子參藥材，加8倍量飲用水提取3次，3 h/次，提取液過濾后合并濾液，濾液在80 ℃，0.08 MPa條件下減壓濃縮至相對密度約為1.18～1.19(50 ℃)。

3.2 太子神悅膠囊葛根、淫羊藿藥材提取工藝

結(jié)果表明，葛根、淫羊藿藥材最佳提取純化工藝如下：取處方量葛根和淫羊藿藥材，加入12倍量的80%乙醇，回流提取3次，每次1 h，合并濾液，減壓濃縮(60 ℃,0.06 MPa)，至相對密度約為1.03～1.04(50 ℃)。

4 小結(jié)與討論

太子神悅膠囊的適應(yīng)癥是用于治療中輕度抑郁癥，為國家五類新藥研發(fā)項目，目前已完成三期臨床試驗，即將取得生產(chǎn)批件，上市銷售。太子神悅膠囊中間品制備工藝是否可行關(guān)系到藥品成品質(zhì)量的均一性、穩(wěn)定性。太子神悅膠囊中間品制備工藝經(jīng)過單因素試驗、正交試驗、生產(chǎn)工藝小試驗證、中試驗證及規(guī)模生產(chǎn)驗證，關(guān)鍵生產(chǎn)工藝參數(shù)不斷優(yōu)化、細(xì)化。結(jié)果表明太子神悅膠囊中間品制備工藝穩(wěn)定、可行，具備規(guī)模生產(chǎn)的條件，為產(chǎn)品上市后規(guī)模化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。