梁軍，宋艷，劉俊希，苑宏宇，黃曉瑩,夏永剛*，匡海學(xué)*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040; 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

類葉牡丹(CaulophyllumrobustumMaxim.)，別名紅毛七、威嚴(yán)仙、紅毛細(xì)辛等，為小檗科紅毛七屬多年生草本植物，根及根莖為主要藥用部位。類葉牡丹曾記錄于《中藥大辭典》，其性溫，味苦辛，歸肝、胃經(jīng)，具有理氣止痛、祛風(fēng)活血的功效[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明類葉牡丹具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗腫瘤和抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等作用[2-5]。廣泛生長(zhǎng)于東北地區(qū)、西北地區(qū)、西南地區(qū)等的林下或者山溝陰處。在陜西地區(qū)，與桃兒七、鐵牛七、朱砂七等并稱為“太白七藥”，被記載于《本草綱目》，“凡杖撲傷損，瘀血淋漓者，隨即嚼爛，罨之即止，青腫者即消散”，所以也是治跌打、除風(fēng)濕的民間常用藥[6]。

類葉牡丹皂苷G(Cauloside G)是類葉牡丹中主要的特征性成分，目前對(duì)于Cauloside G的組織分布研究鮮有報(bào)道，在課題組前期對(duì)類葉牡丹皂苷成分的化學(xué)及質(zhì)譜分析的基礎(chǔ)上[7-11]，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行Cauloside G的組織分布研究，建立了一種UPLC-MS/MS法，測(cè)定Cauloside G在大鼠體內(nèi)各主要臟器中的分布特點(diǎn)及組織藥物濃度隨時(shí)間變化的動(dòng)態(tài)規(guī)律，為類葉牡丹中三萜皂苷類成分的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 藥品與試劑

對(duì)照品Cauloside G，自制，經(jīng)高效液相-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(HPLC-ELSD)檢測(cè)，純度>98%；內(nèi)標(biāo)偽薯蕷皂苷(IS)購(gòu)自于成都曼思特生物科技有限公司；乙腈和甲醇均為色譜級(jí)，購(gòu)自于Thermo Fisher, Geel, Belgium；甲酸購(gòu)自于Dikma,Lake Forest,USA；其他試劑均為分析級(jí)。水為純凈水，經(jīng)Milli-Q純化過濾后使用。肝素鈉購(gòu)自中國(guó)惠世生化試劑有限公司。

1.2 儀器

4000 QTRAP三重四級(jí)桿線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)AB Sciex公司)；組織勻漿機(jī)(上海凈信公司);Mettler-Toledo AB265-S天平(瑞士梅特勒托利多公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康清潔級(jí)SD大鼠，雄性，體質(zhì)量180～220g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證編號(hào)為SYXK(黑)2013-012。本實(shí)驗(yàn)符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

2 實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

類葉牡丹皂苷G液相色譜條件：色譜柱采用 ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 mm×150 mm,1.8 μm)、HSS T3預(yù)柱(2.1 mm×5 mm,1.8 μm)；流動(dòng)相A：水(含0.1%甲酸)，流動(dòng)相B：乙腈(含0.1%甲酸)，梯度洗脫，洗脫程序?yàn)?～4 min,30%～90% B;4～4.1 min,90%～30% B;4.1～5 min，30%～30% B。柱溫35 ℃ ,流速0.3 mL·min-1,進(jìn)樣量5 μL。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)；ESI-負(fù)離子模式，多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。

2.2 對(duì)照品溶液配制

母液配制:精密稱取Cauloside G為1.00 mg，用甲醇定容至1 mL EP管中，得到 1.00 mg/mL 母液，貯存于4 ℃冰箱中待用。

標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液配制：分別精密移取上述標(biāo)準(zhǔn)品母液(1.00 mg/mL)，用甲醇稀釋得到100.0、10.0、1.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。取大鼠心、肝、脾、腎、腦的空白組織勻漿液200 μL，分別精密加入Cauloside G和偽薯蕷皂苷內(nèi)標(biāo)，配制成相當(dāng)于大鼠各組織藥物濃度的系列溶液：心(2.2、4.3、8.7、17.3、34.7、69.4、138.8和277.5 ng/mL)；肝(8.7、17.3、34.7、69.4、138.8、277.5、555.0和1 110.0 ng/mL)；脾(4.3、8.7、17.3、34.7、69.4、138.8、277.5和555.0 ng/mL)；腎(4.3、8.7、17.3、34.7、69.4、138.8277.5和555.0 ng/mL)；腦(2.2、4.3、8.7、17.3、34.7、69.4、138.8和277.5 ng/mL)，所有標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液4 ℃條件下儲(chǔ)存。

質(zhì)控樣品(QC)工作液配制：精密吸取Cauloside G標(biāo)準(zhǔn)品工作液(1.00 mg/mL)適量，同法配制低、中、高濃度混合質(zhì)控(QC)樣品工作液，分別為心(2.2、22.3、277.5 ng/mL)，肝(11.1、111.1、1 110.0 ng/mL)，脾(5.56、55.5、555.0 ng/mL)，腎(5.56、55.5、555.0 ng/mL)，腦(2.2、22.3、277.5 ng/mL)，所有工作液4 ℃條件下儲(chǔ)存。

內(nèi)標(biāo)及工作液的配制：精密稱取偽薯蕷皂苷1.01 mg，用甲醇定容至1 mLEP管中，配置成濃度1.00 mg/mL母液。精密吸取偽薯蕷皂苷母液，用甲醇稀釋得到100.0、10.0、1.0 μg/mL工作液。再精密吸取內(nèi)標(biāo)工作液，配制成200 ng/mL內(nèi)標(biāo)工作液，貯存于4 ℃冰箱中備用。

2.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

將30只雄性SD大鼠按照5個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)分成5組，每組6只，除空白組給予等量的生理鹽水外，其余各組按照150 mg/kg劑量、單次灌胃給予Cauloside G，于給藥后0.5、1、2、4和6 h分別腹主靜脈采血后處死，立即解剖大鼠，摘取心、肝、脾、腎及腦等組織樣品，用生理鹽水沖洗至表面無(wú)血污后，濾紙吸干水分，-20 ℃保存待勻漿。

2.4 組織樣品的預(yù)處理

取-20 ℃保存的心、肝、脾、腎、腦組織樣品，室溫解凍后，精密稱重后，加入定量的生理鹽水(1 g組織加入5 mL生理鹽水)，用組織勻漿器充分勻漿。取200 μL血漿和空白血漿分別加入400 μL甲醇，渦旋1 min，再加入1 mL甲醇，渦流混旋1 min后，在4 ℃下12 000 r/min離心10 min，取上清液，40 ℃氮?dú)饬飨麓蹈?，殘?jiān)蛹状?00 μL復(fù)溶，以12 000 r/min離心10 min，取上清液，5 μL注入LC-MS/MS系統(tǒng)進(jìn)行分析。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 選擇性

取各組織空白生物樣品、加入標(biāo)準(zhǔn)品Cauloside G和IS的心、肝、脾、腎、腦組織樣品及大鼠給藥單體Cauloside G典型的色譜圖如圖1所示。結(jié)果表明，各組織中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)于單體Cauloside G的檢測(cè)沒有干擾。

注:A：空白生物樣品；B:加入標(biāo)準(zhǔn)品Cauloside G和IS的組織樣品；C：大鼠給藥Cauloside G的各組織樣品。圖1 各組織典型的色譜圖

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和最低定量限

如表1所示，是類葉牡丹皂苷Cauloside G在心、肝、脾、肺、腎、腦的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、線性范圍最低定量限(LOQ)。在線性范圍內(nèi)，其線性相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.99，表明Cauloside G相應(yīng)濃度與其峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值具有良好的線性關(guān)系。LOQ是分析方法靈敏度的評(píng)價(jià)方法，LOQ滿足準(zhǔn)確度為101.3%～105.30%，RSD<2.13 %，足以用于組織分布的分析。

表1 Cauloside G在不同組織中的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及最低定量限(n=6)

2.5.3 準(zhǔn)確度和精密度

待測(cè)物的日內(nèi)和日間精密度的RSD值均低于15%，準(zhǔn)確度(RE)在-14.63 %～14.02%之間。結(jié)果表明，該方法的準(zhǔn)確度和精密度良好。

2.5.4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)

Cauloside G在各組織樣品中的提取回收率為87.45%～95.22%，RSD<7.90%；在三個(gè)不同的濃度基質(zhì)效應(yīng)為71.89%～82.32%，RSD<6.54%。以上結(jié)果表明，本方法能滿足各組織樣品的定量分析要求。

2.5.5 穩(wěn)定性

結(jié)果表明該分析物在4 ℃存儲(chǔ)12 h、-20 ℃儲(chǔ)存2周、-20 ℃儲(chǔ)存并反復(fù)凍融3次等條件下是穩(wěn)定的，準(zhǔn)確度符合要求。

2.6 大鼠灌胃Cauloside G的組織分布研究

各組織按照“2.4組織樣品的預(yù)處理”項(xiàng)下操作，測(cè)定類葉牡丹中Cauloside G成分在大鼠各個(gè)臟器不同時(shí)間點(diǎn)的分布情況，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，大鼠灌胃給予Cauloside G后，Cauloside G在大鼠的心、肝、脾、腎和腦中均有分布。心臟組織中，Cauloside G是在給藥0.5 h后濃度達(dá)到最高值，濃度為(53.7±7.60)ng/mL；肝、脾、腎、腦組織中，Cauloside G是給藥1 h后濃度達(dá)到峰值，濃度分別為(90.1±6.19)ng/mL，(103.2±17.67)ng/mL，(101.8±14.32)ng/mL，(68.2±14.76)ng/mL。

表2 Cauloside G在各組織中不同時(shí)間點(diǎn)的質(zhì)量濃度(n=6,ng/mL)

3 小結(jié)

藥物在體內(nèi)分布的速度決定了藥效發(fā)揮的快慢，分布迅速，藥效產(chǎn)生快，反之分布較慢，藥效產(chǎn)生慢[12]。本文研究表明Cauloside G灌胃給予大鼠后，心臟組織中，Cauloside G在是在給藥0.5 h后濃度達(dá)到最高值，給藥0.5 h后顯示濃度開始下降；肝臟組織中，給藥0.5～1 h內(nèi)Cauloside G的濃度均呈現(xiàn)升高的狀態(tài)，給藥1h后顯示濃度開始下降；脾組織中Cauloside G是在給藥1 h后達(dá)到濃度峰值，濃度為(103.2±17.67)ng/mL，與其他組織相比，對(duì)脾組織表現(xiàn)出了更好的親和力；腎組織中，Cauloside G是在給藥后1 h迅速達(dá)到峰值；腦組織中，Cauloside G在給藥1 h后藥物濃度最高，隨后緩慢下降，在腦組織內(nèi)表現(xiàn)出了緩慢代謝的特性。

總體來(lái)看，Cauloside G在肝、脾、腎這些血流量大的組織中的含量較高，對(duì)這些組織具有很好的親和力，而隨著時(shí)間延長(zhǎng)藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)迅速下降，提示Cauloside G可能通過多途徑代謝；心臟組織中，Cauloside G表現(xiàn)出了分布迅速的特性；在腦組織中，Cauloside G成分也有分布，說明這個(gè)成分能夠透過血腦屏障。本文在一個(gè)選定的有效劑量單次給藥后，測(cè)定Cauloside G在大鼠體內(nèi)不同組織中的分布特點(diǎn)及組織藥物濃度隨時(shí)間變化的動(dòng)態(tài)規(guī)律，為類葉牡丹中三萜皂苷類成分的臨床應(yīng)用和進(jìn)一步解釋其作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。