申春艷，張建瑞，杜姍姍，張玉超，周鵬飛，劉 景，王興玲

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心 鄭州 450052

隨著胚胎培養(yǎng)體系逐步完善，輔助生殖技術(shù)的臨床妊娠率逐年增高，其安全性也越來越受到人們的關(guān)注。如何降低輔助生殖技術(shù)的多胎率已經(jīng)引起廣泛關(guān)注，最簡單的方法就是減少胚胎移植數(shù)目。有專家[1]認(rèn)為全面單胚胎移植的時代已經(jīng)到來。目前單胚胎移植在臨床中的應(yīng)用多為單囊胚移植，但是由于囊胚培養(yǎng)額外增加了胚胎在體外的培養(yǎng)時間，有可能導(dǎo)致患者無可移植囊胚，從而造成其在臨床的全面推廣仍有一定的困難。有研究[2]結(jié)果顯示，采用胚胎時差成像系統(tǒng)培養(yǎng)(time-lapse)技術(shù)進(jìn)行選擇性單胚胎移植可以獲得與單囊胚移植相似的臨床結(jié)局，且可以降低單卵雙胎率。目前，單卵裂期胚胎移植開始逐步受到人們關(guān)注。如何選擇最優(yōu)的卵裂期胚胎進(jìn)行移植，使其達(dá)到不劣于單囊胚移植的臨床妊娠率是其推廣的必要條件。

目前，胚胎選擇的方法已經(jīng)不局限于胚胎的形態(tài)學(xué)評估，time-lapse技術(shù)及胚胎植入前遺傳學(xué)檢測等均已經(jīng)在臨床普遍應(yīng)用[3-4]。無創(chuàng)的胚胎植入前遺傳學(xué)檢測如培養(yǎng)液游離DNA檢測及拉曼光譜檢測等技術(shù)也日趨成熟。但是，由于工作量及經(jīng)濟(jì)等因素，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)評估仍然占據(jù)著絕對的主導(dǎo)地位。胚胎的形態(tài)學(xué)評估一般包括第1天的原核評估及第2天和第3天的卵裂評估，在選擇胚胎時一般以第1天的原核數(shù)及第3天的胚胎評分作為其是否可利用的依據(jù)，第2天胚胎形態(tài)學(xué)評估較少被考慮到。有研究[5]認(rèn)為第2天發(fā)育到4個細(xì)胞(C)的胚胎可以獲得較高的妊娠率，第3天為8C的妊娠率最高，第3天≥8C移植時其臨床妊娠率顯著高于<8C時。本文回顧性分析了2016年1月至2019年5月在本中心進(jìn)行新鮮周期移植的單卵裂期胚胎移植第2天、第3天細(xì)胞數(shù)與臨床妊娠率及繼續(xù)妊娠率情況，報道如下。

1 對象與方法

1.1研究對象選取2016年1月1日至2019年5月31日在本中心進(jìn)行新鮮周期單卵裂期胚胎移植的患者560例，對其臨床資料進(jìn)行回顧性分析。納入標(biāo)準(zhǔn)為：新鮮周期至少有1枚正常受精的可利用胚胎，并進(jìn)行了移植。排除移植胚胎受精方式為晚補(bǔ)救的周期。

1.2受精方法根據(jù)患者個體情況促排卵。取卵日行超聲引導(dǎo)下卵泡穿刺術(shù)，在體視顯微鏡下分揀出卵冠丘復(fù)合物，沖洗干凈，置于內(nèi)有受精培養(yǎng)液的中央井皿中等待受精。若精子質(zhì)量好，患者應(yīng)用絨毛膜促性腺激素(hCG)后38～40 h進(jìn)行體外受精(IVF)，受精后4～6 h進(jìn)行短時觀察，若短時觀察2極體的卵子數(shù)小于1/3認(rèn)為受精低下或失敗，對明確1極體的卵子進(jìn)行補(bǔ)救卵泡漿內(nèi)單精子顯微注射(ICSI)。若精子質(zhì)量差，患者在應(yīng)用hCG后40 h左右進(jìn)行ICSI注射，然后將卵子放入卵裂培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。次日觀察原核，判定受精情況，以2原核為正常受精。第2天及第3天均進(jìn)行卵裂觀察，第3天對胚胎進(jìn)行評分，結(jié)合臨床對胚胎進(jìn)行移植。卵裂培養(yǎng)液、囊胚培養(yǎng)液均為20 μL/滴， 每滴放置1～2個胚胎，礦物油覆蓋，過夜平衡。

1.3觀察指標(biāo)第2天主要記錄胚胎細(xì)胞數(shù)、碎片等級、是否多核、細(xì)胞均一度及是否有其他異常，不進(jìn)行胚胎評級。第3天主要記錄胚胎細(xì)胞數(shù)、碎片等級、細(xì)胞均一度、是否有空泡粗顆粒及其他異常，并綜合以上情況及胚胎是否停止發(fā)育進(jìn)行胚胎評級。

1.4研究分組按照第3天細(xì)胞數(shù)分為4～5C組、6C組、7C組、8C組、9C組和≥10C組。根據(jù)第2天細(xì)胞數(shù)分為2C組、3C組、4C組和≥5C組。根據(jù)第2天至第3天增長的細(xì)胞數(shù)分為1C組、2C組、3C組、4C組和≥5C組。臨床妊娠為通過超聲檢查觀察到一個或多個孕囊，包括正常宮內(nèi)妊娠、異位妊娠，可以僅見孕囊未見胎心[6]。繼續(xù)妊娠為超過12周的妊娠[7]。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 22.0進(jìn)行分析，各組臨床妊娠率及繼續(xù)妊娠率的比較采用χ2檢驗(yàn)， 檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1患者一般資料560例患者年齡為21～49(32.9±5.3)歲，體重指數(shù)為16.7～37.4(23.6±3.2) kg/m2，移植日內(nèi)膜厚度為5.0～21.5(10.9±2.3) mm。其中116例為選擇性單胚胎移植(有≥2個可利用胚胎)，444例為被迫性單胚胎移植(該周期僅有1枚可利用胚胎)，兩者之間臨床妊娠率差異有統(tǒng)計學(xué)意義[48.3%(56/116)vs30.4%(135/444)，χ2=13.069，P<0.001]。560枚胚胎其中382枚來源于IVF受精方式，178枚來源于ICSI受精方式，兩者臨床妊娠率差異無統(tǒng)計學(xué)意義[33.2%(127/382)vs36.0%(64/178)，χ2=0.396，P=0.529]?；颊哌x擇性單胚胎移植的原因?yàn)閱谓亲訉m、疤痕子宮等有雙胎高危因素或個人意愿等。

2.2第3天不同胚胎細(xì)胞數(shù)妊娠率比較560個胚胎移植第3天不同細(xì)胞數(shù)組之間的臨床妊娠率及繼續(xù)妊娠率見表1。8C及≥10C組臨床妊娠率及繼續(xù)妊娠率與4～5C、6C、7C組相比，均顯著增高。

表1 第3天不同胚胎細(xì)胞數(shù)的臨床妊娠率及繼續(xù)妊娠率

2.3第2天不同胚胎細(xì)胞數(shù)妊娠率比較第2天4C組的臨床妊娠率及繼續(xù)妊娠率均高于其他組(表2)。

表2 第2天不同胚胎細(xì)胞數(shù)的臨床妊娠率及繼續(xù)妊娠率

2.4第2天至第3天不同細(xì)胞增長數(shù)的妊娠率比較細(xì)胞數(shù)增長為4C和≥5C組的臨床妊娠率及繼續(xù)妊娠率高于其他組(表3)。

表3 第2天至第3天不同細(xì)胞增長數(shù)分組的臨床妊娠率及繼續(xù)妊娠率

2.5第2天與第3天不同胚胎細(xì)胞數(shù)組合的妊娠率比較第2天=4C且第3天=8C、第2天=4C且第3天>8C、第2天<4C且第3天=8C組的臨床妊娠率高于其他組。第2天=4C且第3天=8C、第2天=4C且第3天>8C、第2天<4C且第3天=8C組的繼續(xù)妊娠率高于其他組(表4)。

表4 第2天與第3天不同細(xì)胞數(shù)組合的臨床妊娠率及繼續(xù)妊娠率

3 討論

輔助生殖技術(shù)中，選擇真正具有發(fā)育潛能的胚胎進(jìn)行移植是至關(guān)重要的一環(huán)，雖然目前胚胎評估與選擇技術(shù)日新月異，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)評估仍然是最便捷、經(jīng)濟(jì)及有效的選擇策略。2011年發(fā)布的關(guān)于胚胎形態(tài)學(xué)評估的伊斯坦布爾專家[8]認(rèn)為，胚胎應(yīng)在第2天發(fā)育到4C階段，第3天發(fā)育到8C階段移植，發(fā)育停滯、過快或過慢時，其染色體異常率顯著增高。中國胚胎實(shí)驗(yàn)室關(guān)鍵指標(biāo)專家[5]認(rèn)為第3天發(fā)育至7～9C的胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎，即移植優(yōu)選的胚胎。有研究[9]認(rèn)為細(xì)胞數(shù)目可以作為預(yù)測活產(chǎn)率的獨(dú)立指標(biāo)。有利用time-lapse選擇胚胎的研究[10]表明，胚胎的細(xì)胞數(shù)大于等于8C時，臨床結(jié)局最優(yōu)，同時偶數(shù)組的臨床結(jié)局優(yōu)于奇數(shù)組。有研究[11]顯示，第3天為8C的胚胎囊胚形成率明顯高于其他細(xì)胞數(shù)的胚胎。本研究結(jié)果顯示第2天胚胎細(xì)胞數(shù)為4C、第3天細(xì)胞數(shù)為8C時胚胎臨床妊娠率和繼續(xù)妊娠率高。

研究[12]顯示，正常發(fā)育速度的胚胎妊娠率高于低發(fā)育速度的胚胎，因此胚胎的發(fā)育速度也是評估胚胎質(zhì)量的重要參考指標(biāo)。第2天至第3天的細(xì)胞增長數(shù)量反映了胚胎第2天至第3天的發(fā)育速度，本研究結(jié)果顯示第2天至第3天胚胎細(xì)胞增長數(shù)量4C為最佳。

本文亦比較了第2天及第3天不同胚胎細(xì)胞數(shù)目組合的臨床妊娠率和繼續(xù)妊娠率，根據(jù)結(jié)果，臨床選擇胚胎的順序建議為：①第2天=4C和第3天=8C。② 第2天=4C和第3天>8C。③第2天<4C和第3天=8C。④第2天=4C和第3天<8C。⑤第2天>4C和第3天=8C。⑥第2天≠4C和第3天≠8C。

綜上所述，第2、3天的胚胎細(xì)胞數(shù)及第2天至第3天的胚胎細(xì)胞數(shù)增長均對臨床結(jié)局具有一定程度的預(yù)測意義，第3天胚胎移植時最優(yōu)的選擇為第2天為4C且第3天為8C的胚胎。

本文的局限性在于目前本中心多數(shù)卵裂期胚胎移植仍為2枚卵裂期胚胎移植或單囊胚移植，因此單胚胎移植的周期數(shù)據(jù)量較小，可能導(dǎo)致誤差。