王孟珂 田夢(mèng)妮 畢泉鑫 劉肖娟 于海燕 王利兵

（中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，國(guó)家林業(yè)局林業(yè)培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091）

文冠果（Xanthoceras sorbifoliumBunge）無患子科（Sapindaceae）文冠果屬（Xanthoceras），灌木或小喬木，奇數(shù)羽狀復(fù)葉。主要分布在我國(guó)北部，西至新疆、寧夏，北至內(nèi)蒙，南至河南［1］。文冠果是我國(guó)特有的木本油料作物，種子含油率較高，高達(dá)66.39%，脂肪酸組成良好，可作為理想的食用和工業(yè)用油樹種，國(guó)家林業(yè)局已將其列為生物質(zhì)柴油原料基地建設(shè)的主要樹種［2～3］。然而，在我國(guó)文冠果主要分布的“三北”地區(qū)降雨量匱乏，干旱脅迫已是影響文冠果生長(zhǎng)、品質(zhì)以及產(chǎn)量的最為重要的因素之一［4］。

在非生物脅迫中，干旱脅迫對(duì)植物的危害較大，其中氣孔調(diào)節(jié)是抵御干旱脅迫和適應(yīng)環(huán)境的機(jī)制之一［5］，植物體與外界進(jìn)行氣體和水分交換都是通過氣孔來實(shí)現(xiàn)，氣孔的大小、密度和導(dǎo)度對(duì)干旱條件都有著適應(yīng)性分化，因此氣孔特征在一定意義上可以作為抗旱性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［6～7］。有研究表明，通過植物對(duì)干旱環(huán)境的不同響應(yīng)，評(píng)價(jià)其抗旱性，在現(xiàn)有的種質(zhì)資源中篩選出抗旱的優(yōu)良種質(zhì)，是一種可以實(shí)施的方法［8～9］。通常采用主成分分析、隸屬函數(shù)值和聚類分析等方法對(duì)氣孔性狀進(jìn)行評(píng)價(jià)，從而評(píng)估植物的抗旱性［10～11］。

文冠果分布較廣，種質(zhì)資源豐富，不同的種質(zhì)資源的耐旱性差異明顯，但是目前我國(guó)對(duì)文冠果資源的抗旱評(píng)價(jià)較少，本研究是課題組在對(duì)我國(guó)文冠果資源全面調(diào)查分析的基礎(chǔ)上［4］，收集108 份文冠果種質(zhì)資源，觀測(cè)氣孔的12項(xiàng)指標(biāo)，綜合采用隸屬函數(shù)值法、聚類分析法和主成分分析法對(duì)文冠果種質(zhì)資源進(jìn)行抗旱性篩選與評(píng)價(jià)，篩選出抗旱的種質(zhì)資源，可以為文冠果抗旱機(jī)制、相關(guān)基因挖掘等研究提供理想的材料，同時(shí)為抗旱育種、大規(guī)模栽培以及產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)地內(nèi)蒙古自治區(qū)鄂爾多斯市鄂托克前旗的文冠果良種繁育基地（107°29'，38°11），屬中溫帶溫暖型干旱、半干旱大陸性氣候。2017 年7 月，選取天氣晴朗的上午，對(duì)108 株長(zhǎng)勢(shì)良好的8 年生實(shí)生文冠果的葉片進(jìn)行采樣。于每株樹的正南方向選取無病害且長(zhǎng)勢(shì)良好的成熟復(fù)葉片3～5 片，取中間小葉片20 片，放入FAA 固定液（70%酒精90 mL+冰醋酸5 mL+福爾馬林5 mL）中儲(chǔ)存。

1.2 試驗(yàn)方法

用離析液使葉片解離。將FAA 固定液中的葉片取出，經(jīng)50%、70%、85%、95%濃度的乙醇梯度分別脫水15 min，在每個(gè)葉片的左端、右端、底端和尖端各取0.5 cm×0.5 cm 大小的4 個(gè)正方形葉片置于試管中，并用蒸餾水沖洗，沸水浴7～8 min 后取出，待溫度冷卻至室溫后，用解離液（冰醋酸∶30%雙氧水=1∶1）將試管中的蒸餾水替換，換液后置于60℃烘箱7～9 h，待到葉片變?yōu)榘咨胪该鳡詈笥谜麴s水沖洗，毛筆刷除葉肉部分，剩余葉片的下表皮用番紅—固綠染色［12］。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

使用Motic DigiLabll 顯微數(shù)碼影像系統(tǒng)拍照觀察，Motic Iamges Plus 2.0 測(cè)量氣孔長(zhǎng)度（SL），包括氣孔孔隙長(zhǎng)軸長(zhǎng)度（LAS）、氣孔孔隙短軸長(zhǎng)度（SAS）、氣孔寬度（SW）、氣孔面積（SA）、氣孔周長(zhǎng)（SC）、氣孔開口面積（ASO）、氣孔開口周長(zhǎng)（CSO）、葉片面積（S）以及單位面積氣孔數(shù)量（Q），測(cè)量20個(gè)視野。根據(jù)上述指標(biāo)計(jì)算氣孔密度（SD）、氣孔總面積占葉片面積比例（SP）、氣孔開口面積指數(shù)（SOI）和氣孔面積指數(shù)（SAI）。SOI 指理論上葉片氣孔的最大開口面積與葉片面積的比值。其中：

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

運(yùn)用Microsoft Excel、Rstudio與SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，根據(jù)108株文冠果的葉片的氣孔特征進(jìn)行系統(tǒng)聚類、方差分析及主成分分析，采用Tamhane’s T2（M）法進(jìn)行多重比較，運(yùn)用隸屬函數(shù)分析法對(duì)文冠果抗旱性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)［13］，隸屬函數(shù)值越大，抗旱性就越強(qiáng)；反之，抗旱性就越弱。計(jì)算隸屬函數(shù)值的公式如下：

式中：Ypq為第p組的第q個(gè)指標(biāo)的抗旱隸屬函數(shù)值；λpq為第p組的第q個(gè)指標(biāo)測(cè)定值；λqmax為第q個(gè)指標(biāo)的最大值；λqmin為第q個(gè)指標(biāo)的最小值；Yˉp為第p組植物的抗旱隸屬均值；n為所測(cè)指標(biāo)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱環(huán)境對(duì)文冠果葉片氣孔的影響

對(duì)文冠果葉片氣孔各性狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析表明氣孔特征、氣孔面積占葉面積比例和氣孔面積指數(shù)等性狀變幅不同（見表1），變異系數(shù)在10.12%～836.93%，說明供試材料的108 份文冠果種質(zhì)資源存在明顯差異。其中氣孔開口面積指數(shù)在各材料之間存在較明顯的差異，變異系數(shù)為836.93%，氣孔長(zhǎng)相比于其他性狀在各材料中的變異系數(shù)較低為10.12%。對(duì)葉片氣孔各性狀進(jìn)行方差分析，108份文冠果種質(zhì)資源各性狀均存在極顯著差異（P＜0.01），即文冠果不同種質(zhì)資源葉片氣孔的各性狀對(duì)干旱環(huán)境均有不同程度的響應(yīng)。

表1 108份文冠果葉片氣孔12個(gè)性狀變化統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistics of 12 characters of stomata in 108 X.sorbifolium

2.2 氣孔的相關(guān)性分析

對(duì)108 份文冠果氣孔各性狀進(jìn)行相關(guān)性分析（見表2），可以看出大多數(shù)性狀間存在顯著（P＜0.05）或極顯著相關(guān)（P＜0.01）。其中氣孔面積與氣孔長(zhǎng)、氣孔空隙長(zhǎng)軸長(zhǎng)、氣孔寬、氣孔周長(zhǎng)、氣孔開口周長(zhǎng)、氣孔面積占葉面積比例、氣孔面積指數(shù)和氣孔開口面積指數(shù)存在極顯著相關(guān)。氣孔空隙短軸長(zhǎng)和氣孔開口面積與氣孔密度成負(fù)相關(guān)（R=-0.496、R=-0.443）。說明在干旱環(huán)境中，葉片氣孔的各性狀間大多數(shù)存在相關(guān)性，但單個(gè)的抗旱性狀不能有效的評(píng)價(jià)文冠果種質(zhì)資源的抗旱性，應(yīng)對(duì)多種性狀全面的準(zhǔn)確評(píng)價(jià)干旱下文冠果的特性。

表2 干旱地區(qū)108份文冠果種植資源葉片氣孔特征12個(gè)性狀之間的相關(guān)性分析Table 2 Analysis of the correlation between 12 traits of stomata in 108 X.sorbifolium in arid area

2.3 抗旱性狀的主成分分析

為篩選適合在干旱地區(qū)種植的文冠果種質(zhì)資源，將氣孔的12項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，包括氣孔長(zhǎng)度、氣孔空隙長(zhǎng)軸長(zhǎng)度、氣孔寬度、氣孔空隙短軸長(zhǎng)度、單個(gè)氣孔周長(zhǎng)、單個(gè)氣孔面積、單個(gè)氣孔開口面積、氣孔密度、氣孔面積占葉面積比例、氣孔面積指數(shù)和氣孔開口面積指數(shù)。分析結(jié)果見表3，其中特征值大于1 的主成分共3 個(gè)，累計(jì)貢獻(xiàn)率高達(dá)93.408%，說明這3 個(gè)主成分能夠反映文冠果氣孔特征的絕大部分信息。其中第Ⅰ主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率為70.586%，為主要綜合因子，除氣孔空隙短軸長(zhǎng)度與其相關(guān)性較弱外，其他變量均與其密切相關(guān)且為正相關(guān)，其中單個(gè)氣孔面積和氣孔密度的特征值較高。第Ⅱ主成分中氣孔開口面積指數(shù)特征值較高，第Ⅲ主成分中氣孔面積指數(shù)特征值較高。氣孔小且密度大有利于減少水分蒸發(fā)同時(shí)滿足自身所需的生理反應(yīng)。

表3 文冠果氣孔結(jié)構(gòu)指標(biāo)主成分荷載矩陣Table 3 principal component load matrix of stomatal structure index of X.sorbifolium

2.4 抗旱性聚類分析及種質(zhì)資源篩選

根據(jù)氣孔長(zhǎng)度、氣孔空隙長(zhǎng)軸長(zhǎng)度、氣孔寬度、氣孔空隙短軸長(zhǎng)度、氣孔周長(zhǎng)、氣孔面積、氣孔開口面積、氣孔開口周長(zhǎng)、氣孔密度、氣孔面積占葉面積比例、氣孔面積指數(shù)和氣孔開口面積指數(shù)對(duì)108份種質(zhì)資源用離差平方和法進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖1。當(dāng)歐式距離為5 時(shí)，108 份種質(zhì)資源可分為三個(gè)類群，并對(duì)三個(gè)類群采用隸屬函數(shù)值進(jìn)行抗旱性分析，第一個(gè)類群為抗旱節(jié)水型，綜合評(píng)價(jià)值為0.9，占供試材料的29%；第二個(gè)類群為中間型，抗旱性居中，綜合評(píng)價(jià)值0.46，占供試材料的45%；第三個(gè)類群為敏感性，抗旱性較差，綜合評(píng)價(jià)值0.22，占供試材料的26%。

干旱環(huán)境中3 組類型的葉片氣孔形態(tài)差異明顯（見圖2），抗旱性較強(qiáng)的A 組氣孔形態(tài)較小且密度較大，氣孔開度較?。豢购敌詾橹虚g型的B 組氣孔形態(tài)較大，氣孔密度和氣孔開度介于A 組和B組之間；抗旱性較差的C組氣孔開度較大。

將聚類分析得到的3 組氣孔的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行方差分析（見表4），氣孔長(zhǎng)度、氣孔空隙長(zhǎng)軸長(zhǎng)度、氣孔寬度、氣孔空隙短軸長(zhǎng)度、單個(gè)氣孔周長(zhǎng)、單個(gè)氣孔面積、單個(gè)氣孔開口面積、氣孔密度、氣孔面積占葉面積比例、氣孔面積指數(shù)存在極顯著差異（P＜0.01），單個(gè)氣孔開口周長(zhǎng)存在顯著差異（P＜0.05），其中氣孔長(zhǎng)度、氣孔寬度、單個(gè)氣孔周長(zhǎng)和單個(gè)氣孔面積在B 組最高分別為51.12 μm、39.65 μm、294.87 μm、1 605.43 μm2，在A 組中最低分別為47.08 μm、27.75 μm、251.57 μm、1 044.12 μm2；氣孔空隙長(zhǎng)軸長(zhǎng)度、氣孔空隙短軸長(zhǎng)度、單個(gè)氣孔開口周長(zhǎng)和單個(gè)氣孔開口面積在C 組最高分別為27.37 μm、6.57 μm、124.45 μm、144.87 μm2，A 組最低分別為23.24 μm、3.49 μm、101.07 μm、66.84 μm2；氣孔密度在A 組最高為475.39 個(gè)·μm-2，C 組最低為238.89 個(gè)·μm-2；氣孔面積占葉面積比例在B 組最高為60.79%，C 組最低為26.99%；氣孔面積指數(shù)在A組最高為1.05%，C組最低為0.58%。

表4 3種類型的文冠果氣孔的方差分析Table 4 Analysis of variance of three types of X.sorbifolium

對(duì)12個(gè)指標(biāo)采用隸屬函數(shù)值法進(jìn)行抗旱性分析，隸屬函數(shù)值越大抗旱性越強(qiáng)，從表5 中可知A組的綜合評(píng)價(jià)值最高為0.902，C 組的綜合評(píng)價(jià)值最低為0.221，因此在這些種質(zhì)資源中抗旱性為A組＞B 組＞C 組。初步篩選出No.84、No.82、No.92、No.81、No.85、No.4、No.2、No.1、No.86、No.99、No.71、No.95、No.96、No.76、No.75、No.28、No.87、No.106、No.100、No.107、No.97、No.104、No.98、No.105、No.101、No.108、No.102、No.78、No.25、No.73和No.103，共31份種質(zhì)資源適宜栽種在較為干旱的地區(qū)，為抗旱種質(zhì)資源。

表5 文冠果氣孔結(jié)構(gòu)指標(biāo)的抗旱性評(píng)價(jià)Table 5 drought resistance evaluation of stomatal structure index of X.sorbifolium

3 討論

氣孔是高等植物與外界進(jìn)行CO2和水氣傳輸?shù)闹饕ǖ篮驼{(diào)節(jié)器官，調(diào)節(jié)著植物的碳同化和水分散失的平衡關(guān)系［14］。氣孔調(diào)節(jié)是抵御干旱和適應(yīng)環(huán)境的主要機(jī)制之一［15］，在干旱環(huán)境中，氣孔會(huì)較早關(guān)閉來減少葉片中水分的散失［16］。高光合效率的植物一般氣孔小而多，密度大，靈活性高，這些特征可使葉片減少水分散失，從而保持充足的水分供應(yīng)來提高光合效率，植物的光合效率越高，表明植物的抗旱性越強(qiáng)［17］。氣孔面積指數(shù)決定氣孔導(dǎo)度的變化，一般氣孔導(dǎo)度隨水勢(shì)的下降而減?。?8］，從達(dá)到減少水分散失的目的，氣孔面積占葉面積比例和氣孔面積指數(shù)均與葉片的氣孔導(dǎo)度呈顯著的線性正相關(guān)關(guān)系，較高的氣孔開口面積指數(shù)有利于植物保持體內(nèi)與外部環(huán)境的水分平衡［19～23］，有研究表明輕度干旱會(huì)使細(xì)胞受抑制，葉面積減少［14］，氣孔密度增加，在重度干旱下葉片受影響嚴(yán)重，氣孔數(shù)目減少?gòu)亩黾託饪酌芏龋?4～26］。本研究表明，文冠果在適應(yīng)干旱環(huán)境下會(huì)降低氣孔長(zhǎng)度和寬度，從表1中可知抗旱性強(qiáng)的A 組類型的文冠果氣孔長(zhǎng)度和氣孔寬度在三組中最小，但氣孔密度最高。干旱敏感型的C 組的氣孔面積指數(shù)、氣孔密度在三組中最低，C 組的種質(zhì)資源在干旱地區(qū)的失水率可能較高，適應(yīng)干旱能力較差。在干旱環(huán)境中A 組的調(diào)節(jié)能力要比C 組強(qiáng)。該結(jié)果與砂生槐（Sophora moorcroftiana）、赤皮青岡（Cyclobalanopsis gilva）幼苗、德國(guó)補(bǔ)血草（Linminoium tataricum）和番茄（Lycopersicon escul‐entum）等［27～30］相似。

近年來，對(duì)逆境下植物的生長(zhǎng)機(jī)制的相關(guān)研究越來越多，如低溫脅迫、鹽脅迫、重金屬脅迫等，但最為常見的是干旱脅迫［31］，干旱作為植物生長(zhǎng)過程中的主要制約因素之一，會(huì)阻礙植物的呼吸作用、光合作用和氣孔運(yùn)動(dòng)等，進(jìn)而影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育和生理代謝［32］。植物對(duì)干旱脅迫下的響應(yīng)，表現(xiàn)在多個(gè)性狀中，如主根的長(zhǎng)短、葉片的厚度及氣孔的導(dǎo)度等，有研究學(xué)者表明單一性狀無法準(zhǔn)確對(duì)植物的抗旱性做出準(zhǔn)確評(píng)價(jià)［33］。采用主成分分析法確定各指標(biāo)的權(quán)重，用隸屬函數(shù)法對(duì)篩選出來的指標(biāo)進(jìn)行抗旱性評(píng)價(jià)。

本研究的主要目的是評(píng)估文冠果葉片氣孔特征可否作為評(píng)價(jià)抗旱性的依據(jù)。結(jié)果表明本研究方法可以充分了解氣孔性狀在干旱環(huán)境下對(duì)文冠果生長(zhǎng)的影響，明確文冠果不同種質(zhì)資源之間的抗旱性差異。對(duì)來自干旱和半干旱地區(qū)的108 份文冠果種質(zhì)資源材料進(jìn)行研究，測(cè)定的葉片氣孔的12個(gè)性狀指標(biāo)均發(fā)生了不同程度的變化。用主成分分析法進(jìn)一步進(jìn)行分析，得到了3 個(gè)主成分，特征向量載荷最大的是氣孔密度、氣孔開口面積指數(shù)和氣孔面積指數(shù)。通過主成分分析法和隸屬函數(shù)值法相結(jié)合的方法，將多個(gè)性狀簡(jiǎn)單化，較詳細(xì)的反映文冠果種質(zhì)資源的抗旱性信息，確定氣孔面積可作為抗旱鑒定的主要指標(biāo)，同時(shí)篩選出31份抗旱文冠果種質(zhì)資源材料。