田雙慧 程 赫 張 洋 劉 聰 夏德安 魏志剛

（1. 林木遺傳育種國家重點實驗室，東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150040；2. 國家林業(yè)和草原局鹽堿地研究中心，中國林業(yè)科學(xué)研究院，北京

100091）

類胡蘿卜素是廣泛存在于光合生物和非光合生物（如細(xì)菌與真菌）中的一類異戊二烯化合物，在生物體生長發(fā)育過程中具有重要作用［1～2］。如葉綠體和有色體中的類胡蘿卜素，在植物光合作用中發(fā)揮著光吸收、傳遞電子和清除三線態(tài)氧及超氧陰離子等作用［3～4］。此外，類胡蘿卜素衍生產(chǎn)物玉米黃質(zhì)醛可轉(zhuǎn)化為植物激素脫落酸（abscisic acid，ABA），在植物非生物脅迫響應(yīng)和種子發(fā)育等多個生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用［5～6］。

類胡蘿卜素代謝途徑中，類胡蘿卜素裂解氧化酶（carotenoid cleavage oxygenases，CCO）可特異性催化裂解類胡蘿卜素分子多烯鏈的共軛雙鍵從而形成各種脫輔基類胡蘿卜素及其衍生物［5，7］。CCO 含 有 一 個RPE65（retinal pigment epithelial membrane protein）結(jié)構(gòu)域，而且Fe2+能夠激活其催化活性［8～13］。根據(jù)底物是否形成環(huán)氧結(jié)構(gòu)，CCO 可以進(jìn)一步分為類胡蘿卜素裂解雙加氧酶（carotenoid cleavage dioxygenases，CCD）和9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶（nine-cis-epoxycarote noid dioxygenases，NCED）［14］。植物中，第一個參與前體黃素生物合成的類胡蘿卜素裂解酶NCED 來自于脫落酸激素缺陷型玉米（Zea maysLinn）突變體［15］。擬南芥（Arabidopsis thaliana）基因組CCD家族 可 分 成CCD1、CCD4、CCD7和CCD8四 個 亞族［9，16］，其中CCD1 和CCD4 主要作用于9，10（9’10’）雙鍵的切割，可催化C40（類胡蘿卜素）和C27（類萜）形成如β-紫羅蘭酮和香葉基丙酮類C13 和C14 化合物，在氣味性狀的形成中具有重要作用［17～18］；CCD7 和CCD8 能夠連續(xù)氧化β-胡蘿卜素產(chǎn)生獨角金內(nèi)酯激素合成前體［19～21］，在分枝形成、側(cè)根形成、種子萌發(fā)以及干旱和鹽脅迫響應(yīng)等生物學(xué)過程中起重要作用［22］。大豆（Glycine max）CCD在鹽、干旱、低溫及高溫脅迫下，表達(dá)水平發(fā)生了明顯的變化，表明大豆CCD參與其非生物脅的迫響應(yīng)過程［23］。甘藍(lán)（Brassica oleracea）CCD1和CCD4對干旱和鹽分脅迫均具有較高響應(yīng)能力［10］。蘋果（Malus domestica）CCD在鹽和干旱脅迫下表達(dá)量均發(fā)生明顯變化，表明MdCCD參與蘋果非生物脅迫響應(yīng)過程［24］。上述結(jié)果表明，CCD家族基因在植物生長發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)中具有重要生物學(xué)功能。然而，目前為止，尚無全基因組水平鑒定毛果楊CCD家族基因的研究。

毛果楊（Populus trichocarpa）是首個被全基因組測序的木本植物，也是研究生長發(fā)育、材質(zhì)材性、逆境脅迫響應(yīng)和其它重要性狀分子機(jī)制的模式植物。本項研究在全基因組水平鑒定出毛果楊CCD家族成員的基礎(chǔ)上，對其系統(tǒng)進(jìn)化、同源關(guān)系、選擇壓力在進(jìn)化中的作用、基因結(jié)構(gòu)、順式作用元件和編碼蛋白保守基序等特征進(jìn)行了分析。此外，利用實時熒光定量PCR，對PtrCCD家族成員的組織表達(dá)特性以及干旱與鹽脅迫的響應(yīng)特性進(jìn)行分析。上述結(jié)果將為進(jìn)一步闡明PtrCCD家族基因在其生長發(fā)育與逆境脅迫響應(yīng)中的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毛果楊CCD家族成員鑒定及基本特征分析

利用報道的擬南芥CCD 氨基酸序列比對Phytozome 網(wǎng)站（https：//Phytozom-e.jgi.doe.gov）中的毛果楊基因組數(shù)據(jù)庫，同時在毛果楊數(shù)據(jù)庫檢索已注釋的CCD，將獲得的序列結(jié)果匯總并剔除重復(fù)序列后作為候選基因。為了驗證初始結(jié)果的可靠性，將候選基因的氨基酸序列上傳至HMMER 網(wǎng)站（https：//www.ebi.ac.uk/To-ols/hmmer）以及NCBI保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）鑒定保守結(jié)構(gòu)域，以含有PRE65 結(jié)構(gòu)域為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，并根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域鑒定蛋白類型，最終鑒定出PtrCCD家族全部成員。

從Phytozome 網(wǎng)站中獲得PtrCCD家族成員的染色體位置、基因序列等信息，并根據(jù)與擬南芥同源關(guān)系進(jìn)行命名，染色體位置信息經(jīng)TBtools 軟件進(jìn)行處理。通過ExPasy（https：//web.expasy.org）在線預(yù)測其等電點與分子質(zhì)量［27］。通過Plant-mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/）在線預(yù)測其亞細(xì)胞定位位置［26］。

1.2 PtrCCD家族基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

采用MEGA X 軟件的ClustalW 程序?qū)﹁b定出的PtrCCD與擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、油菜（Brassica napu）、豌豆（Pisum sativum）、牛油果（Persea americana）、菊花（Chry‐santhemum morifolium）、、紅木（Bixa orellana）及菜豆（Phaseolus vulgaris）8 個物種CCD編碼的氨基酸序列進(jìn)行多序列對比，并采用臨近法（Neighborjoining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。其中，bootstrap 設(shè)置參數(shù)1 000 次重復(fù)，得到系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹數(shù)據(jù)，經(jīng)iTOL（https：//itol.embl.de/）網(wǎng)站可視化處理［27～29］。

1.3 PtrCCD家族同源基因Ka和Ks分析

利用Blast（https：//blast.ncbi.nlm.nih.go-v/Blast.cgi）相互比對PtrCCD 的CDS 序列，超過300 bp 且同源性超過80%為標(biāo)準(zhǔn)確定為同源基因?qū)?，同源關(guān)系通過TBtools 分析。同時，利用TBtools 計算同源基因之間的同義替換率（synonymous substitutions rates，Ks）、非同義替換率（nonsynonymous substitution rates，Ka）以及Ka/Ks 比率，并以此分析PtrCCD家族基因進(jìn)化過程中的選擇壓力［30～31］。

1.4 PtrCCD 家族基因結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白保守型基序分析

從毛果楊數(shù)據(jù)庫（https：//geno-me.jgi.doe.gov/portal/pages/dynamicOrganismDownload.jsf？organism=Ptrichocarpa）下載基因組數(shù)據(jù)后，通過TBtools軟件提取各PtrCCD家族各基因外顯子、內(nèi)含子長度及位置信息并進(jìn)行可視化處理［32］。

利用Motif Elicitation 網(wǎng)站MEME 程序（http：//meme-suite.org/tools/meme）分析PtrCCD保守基序并用TBtools進(jìn)行可視化處理［32］。

1.5 PtrCCD 家族基因啟動子區(qū)順式作用元件分析

在Phytozome 網(wǎng)站（https：//Phytozom-e.jgi.doe.gov）下載PtrCCD家族各基因起始密碼子前2 000 bp 的序列作為啟動子區(qū)域匯總，再上傳至Plantcare 網(wǎng) 站（http：//bioin-formatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare）進(jìn)行順式作用元件在線分析［33］。

1.6 PtrCCD家族基因表達(dá)特性分析

實驗材料：野生型毛果楊來自東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點實驗室，組織培養(yǎng)擴(kuò)繁。將組培苗在1 個月大小時移栽到土壤中，在25℃、長日照（光照16 h/黑暗8 h）溫室中培養(yǎng)3周。

組織表達(dá)特異性分析：在Phytozome 網(wǎng)站中下載各PtrCCD在毛果楊根、莖和葉的表達(dá)量。同時，進(jìn)一步采集溫室中培養(yǎng)3 周大小毛果楊的根、莖和葉組織用于qRT-PCR 驗證。采用2-ΔΔCT計算相對表達(dá)量并利用TBtools可視化［34，36］。

干旱脅迫響應(yīng)特性分析：上述在溫室中培養(yǎng)3周大小的毛果楊幼苗隨機(jī)分成3 組，每組包含3 棵毛果楊幼苗。干旱處理5、7 d，并以正常澆水處理作為對照組。分別采集上述處理組內(nèi)各植株材料的根、莖和葉組織。

鹽脅迫響應(yīng)特性分析：將上述在溫室中培養(yǎng)3周大小的毛果楊幼苗隨機(jī)分成7 組，每組包含5 棵毛果楊幼苗。用100 mmol·L-1NaCI 處理3、6、12、24、36 及72 h，并以水處理作為對照組。分別采集上述處理組內(nèi)各植株材料的根、莖和葉組織。

RNA 提取、反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR：利用植物總RNA 提 取 試 劑 盒（MiniBEST，TaKaRa）提 取 總RNA，然后采用PrimeScriptTMRT reagent Kit（Perfect Real Time，TaKaRa）試劑盒反轉(zhuǎn)錄RNA 獲得cDNA 用于qRT-PCR。根據(jù)熒光定量引物設(shè)計原則，設(shè)計PtrCCD家族基因定量引物，以PtrActin為內(nèi)參基因（見表1）。在賽默飛ABI 7500 實時熒光定量PCR 儀上進(jìn)行試驗，體系如下：2×TransStart TOP/Tip Green qPCR Supermix 10 μL、上下游混合引物（10 μmol·L-1）0.4 μL，cDNA 1.5 μL，Passive Reference Dye（50×）0.4 μL，加ddH2O 至20 μL。反應(yīng)條件：94℃30 s；94℃5 s，60℃15 s，72℃35 s，循環(huán)40 次；95℃15 s，60℃1 min，95℃30 s。PtrCCD家族基因及內(nèi)參PtrActin定量引物見表1。每組處理重復(fù)3 次，采用2-ΔΔCT法計算相對表達(dá)量并利用TBtools可視化［3］。

2.3 兩組AECOPD患者血凝血因子檢查結(jié)果 兩組AECOPD患者血凝血因子水平比較，D-二聚體、血漿黏度、全血黏度低、高切均有統(tǒng)計學(xué)差異，患者病情與D-二聚體、血漿黏度、全血黏度低、高切呈正相關(guān)，見表3。

表1 PtrCCD家族基因qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences for qRT-PCR of PtrCCD gene family

2 結(jié)果與分析

2.1 PtrCCD及其編碼蛋白基本特性

根據(jù)已報道的擬南芥CCD 氨基酸序列對比毛果楊基因組數(shù)據(jù)庫得到19個候選基因。以是否含有完整RPE65 結(jié)構(gòu)域為標(biāo)準(zhǔn)篩選，剔除8 個不具完整RPE65 結(jié)構(gòu)域的蛋白基因，共得到11 個PtrCCD（見表2）。根據(jù)它們與擬南芥CCD的直系同源關(guān)系分別命名為PtrCCD4a到PtrCCD8b（見圖1 和表2）。PtrCCD家族基因編碼蛋白氨基酸殘基數(shù)在331～626、分子質(zhì)量在37.86～70.42 kDa、理論等電點在5.75～8.42；亞細(xì)胞定位預(yù)測表明，PtrCCD4i編碼蛋白在葉綠體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞質(zhì)中均有分布，而其它家族基因編碼蛋白均定位于細(xì)胞質(zhì)（見表2）。

表2 PtrCCD及其所編碼蛋白特征Table 2 Characteristics of PtrCCD and their encoded proteins

2.2 PtrCCD家族進(jìn)化特性

為了解PtrCCD家族的進(jìn)化歷史，構(gòu)建11 個PtrCCD 與擬南芥、水稻等8 個物種CCD 家族基因編碼蛋白序列的進(jìn)化樹（見圖1）。根據(jù)擬南芥CCD基因家族進(jìn)化關(guān)系，將PtrCCD 家族基因分為CCD4和CCD8兩個亞家族，其中CCD4包含9 個 基 因，CCD8包 含2 個 基 因。每 個CCD亞 族中，親緣關(guān)系較近的物種CCD多處于同一分支中，如CCD1亞族中，豆科PvCCD1a、PvCCD1b、PsCCD1和BoCCD1、十字花科AtCCD1和BnCCD1分在同一分支。同時，我們也發(fā)現(xiàn)PtrCCD8a、PtrCCD8b與OsCCD8b、PtrCCD4a～PtrCCD4i與 水稻與OsCCD4a與OsCCD4b處于同一進(jìn)化分枝，表明該植物CCD 基因家族在不同物種間較為保守，其進(jìn)化晚于草本與木本、單子葉與雙子葉植物的進(jìn)化。

2.3 PtrCCD家族基因的擴(kuò)張與收縮

為分析PtrCCD家族在進(jìn)化過程中是否存在擴(kuò)張與收縮現(xiàn)象，利用TBtools 軟件分析了家族各基因在染色體位置。結(jié)果見圖2 表明：毛果楊11個PtrCCD不均勻分布在1、4、5、6、9、18 和19 號染色體上，其中1號染色體有2個基因，9號染色體上有4個基因，其余染色體上均僅有1個PtrCCD。

PtrCCD家族共線性分析以及序列Blastn 分析表 明，PtrCCD4a和PtrCCD4b、PtrCCD4a和PtrCCD4c、PtrCCD4b和PtrCCD4c、PtrCCD4d和PtrCCD4e以及PtrCCD8a和PtrCCD8b分別具有共線性關(guān)系（見圖3），且同源片段長度遠(yuǎn)大于300 bp，同源性超過80%，其中PtrCCD4a和PtrCCD4c同源性最高（見表3）。據(jù)此，我們推測上述基因?qū)κ怯捎诨蚱螐?fù)制而形成的旁系同源基因。此外，1 號染色體上由PtrCCD4a和PtrCCD4c形成基因 簇，9 號 染 色 體 上 由PtrCCD4h、PtrCCD4i和PtrCCD4g形成的基因簇（見圖2），表明上述基因是由基因串聯(lián)復(fù)制事件演化而來。

為了闡明選擇壓力在PtrCCD家族進(jìn)化中的作用，利用TBtools 分析了PtrCCD家族同源基因的Ks 值、Ka 值和Ka/Ks 值。結(jié)果（見表3）發(fā)現(xiàn)，5 對同源基因Ka/Ks均遠(yuǎn)小于1，表明PtrCCD家族在進(jìn)化過程中經(jīng)歷了較強(qiáng)的純化選擇。

表3 同源PtrCCD的Ka/Ks比值及同源性Table 3 Ka/Ks values and homologous status of homologous PtrCCD

2.4 PtrCCD家族基因結(jié)構(gòu)以及編碼蛋白結(jié)構(gòu)特征

為了解PtrCCD家族各基因系統(tǒng)進(jìn)化和基因結(jié)構(gòu)以及其編碼蛋白中保守基序之間的關(guān)系，結(jié)合PtrCCD家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹對各基因結(jié)構(gòu)以及編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)域的分布進(jìn)行了分析。結(jié)果（見圖4）表明，PtrCCD家族各個基因的內(nèi)含子、外顯子分布方式在保持家族共有特征的同時，在進(jìn)化過程中也產(chǎn)生了明顯的分化。多數(shù)處于同一進(jìn)化分支上的基因結(jié)構(gòu)較為相似，如PtrCCD8a和PtrCCD8b均 含 有6 個 外 顯 子。 同 時，除 了PtrCCD4i、PtrCCD4g和PtrCCD4f外，其它家族基因都含有UTR結(jié)構(gòu)。

PtrCCD家族各基因編碼蛋白保守基序分析表明，PtrCCD家族編碼蛋白共含有20 個基序，其中Motif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 9 和Motif 11 為家族共有基序（見圖6）。此外，不同基因編碼蛋白所含基序數(shù)量與種類存在一定的差異，但處于相同進(jìn)化分支的基因編碼蛋白具有相似的基序組合（見圖6）。上述結(jié)果表明，PtrCCD家族基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)在具有保守性的同時也產(chǎn)生了一定的分化。同時，處于同一進(jìn)化分枝蛋白所含保守基序的數(shù)量與分布模式基本相同。

2.5 PtrCCD家族基因啟動子元件特征

表4 PtrCCD家族基因啟動子區(qū)域順式作用元件Table 4 Cis acting elements in promoter sequence of PtrCCD family genes

為分析PtrCCD家族基因的進(jìn)化對其啟動子元件的影響，我們進(jìn)一步結(jié)合PtrCCD家族進(jìn)化樹對各成員啟動子所含元件進(jìn)行比較分析。結(jié)果（見表4）表明，PtrCCD家族同一進(jìn)化分枝中，各基因啟動子所含元件的數(shù)量與種類基本相同；不同進(jìn)化分枝中，各基因啟動子所含元件存在種類和數(shù)量上的差異，如PtrCCD8a啟動子中含有元件數(shù)量最多（16 個），而PtrCCD4b啟動子中含有元件的數(shù)量最少（0 個）。上述結(jié)果表明，PtrCCD家族基因啟動子序列在進(jìn)化過程中，在保守性的基礎(chǔ)上，也產(chǎn)生了一定的分化，從而導(dǎo)致不同進(jìn)化分枝基因啟動子中元件的種類和數(shù)量產(chǎn)生了分化。

2.6 PtrCCD家族基因的表達(dá)特異性

為了解PtrCCD家族基因在楊樹生長發(fā)育中和響應(yīng)環(huán)境中的潛在作用，先從Phytozome 網(wǎng)站收集的PtrCCD家族各基因在不同組織的表達(dá)量進(jìn)行分析。結(jié)果（見圖6A）表明，根部組織中，PtrCCD4c、PtrCCD4g和PtrCCD8a表達(dá)量高；莖部組織中，PtrCCD4c、PtrCCD4b和PtrCCD8a表達(dá)量低；葉部組織中，PtrCCD4b表達(dá)量最高。此外，利用qRT-PCR 技術(shù)進(jìn)一步對PtrCCD家族各基因在根、莖和葉組織器官中的表達(dá)量進(jìn)行了分析，結(jié)果（見圖6B）表明，PtrCCD家族基因在根、莖和葉組織器官中表達(dá)存在差異，并與Phytozome 網(wǎng)站中PtrCCD家族各基因的表達(dá)整體吻合。上述結(jié)果表明，PtrCCD家族各基因在楊樹不同組織器官的發(fā)育過程扮演不同角色。

為了確定PtrCCD家族基因的干旱脅迫響應(yīng)特性，我們利用qRT-PCR 技術(shù)分析了干旱脅迫下5 d、7 d 時PtrCCD家族各基因在根、莖和葉組織中的表達(dá)量。結(jié)果表明，PtrCCD家族各基因?qū)Ω珊得{迫均具有明顯響應(yīng)特性，同一分支基因響應(yīng)干旱脅迫表達(dá)模式基本相同，但各基因的響應(yīng)能力大小不同。在莖中多數(shù)PtrCCD家族基因隨著干旱脅迫時間的延長表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，而在葉中，多數(shù)PtrCCD基因隨脅迫時間的延長則表現(xiàn)為下降趨勢（見圖7）。上述結(jié)果表明，PtrCCD家族基因在楊樹生長發(fā)育和干旱脅迫響應(yīng)具有不同作用。

為了確定PtrCCD家族基因的鹽脅迫響應(yīng)特性，我們利用qRT-PCR 技術(shù)分析了100 mmol·L-1NaCl 脅迫不同時間（3、6、12、24、48 和72 h）時PtrCCD家族各基因在根、莖和葉組織中的表達(dá)量。結(jié)果（見圖8）表明，PtrCCD家族各基因?qū)aCl 脅迫均具有明顯響應(yīng)特性，同一分支基因響應(yīng)NaCl脅迫表達(dá)模式基本將同，但各基因的響應(yīng)能力大小不同。在根和莖兩組織中多數(shù)PtrCCD家族基因隨著鹽脅迫時間的延長表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢且在脅迫后的12 h 達(dá)到高峰，而在葉中，多數(shù)PtrCCD基因隨脅迫時間的延長則表現(xiàn)為上升、下降再上升的雙峰表達(dá)趨勢且多在e 達(dá)到峰值。上述結(jié)果表明，PtrCCD家族基因在楊樹生長發(fā)育和非生物逆境脅迫響應(yīng)具有不同作用。

3 討論

前期研究表明，CCD家族基因在草本植物生長發(fā)育以及逆境脅迫等生物學(xué)過程中具有重要作用［18，20，22，24～25］，如茄子（Solanum melongena）［14］，辣椒（Capsicum annuum）［34］，甘 藍(lán)（Brassica oleracea）［10］和水稻［12］等。本項研究通過對毛果楊全基因組分析，共鑒定出11 個PtrCCD，可分成為CCD4和CCD8亞族，分別包含包括9 個和2 個基因（見圖1）。擬南芥和水稻中包含四個亞族，豌豆中含有CCD1 和CCD4 兩個亞族，菊花中含有CCD3 和CCD4 兩個亞族，而油菜、牛油果、紅木和菜豆中僅含有CCD1 亞族，說明不同物種間基因存在差異，并且推測在物種進(jìn)化過程中，一些基因的功能被替代，導(dǎo)致毛果楊中只含有CCD4 和CCD8 兩個亞族。擬南芥CCD家族包括CCD1、CCD4、CCD7 和CCD8 亞族，每個亞族含有1 個基因［9］，水稻中含有以上四個亞族，包含8個基因，其中CCD8包含4個基因，CCD4 中包含2 個基因，菜豆中僅含有CCD1一個亞族，其含有兩個基因，油菜、牛油果、紅木中僅含有1 個基因，而毛果楊中含有2 個亞族，11 個CCD基因，因此推測毛果楊CCD家族在進(jìn)化過程中出現(xiàn)了基因擴(kuò)張現(xiàn)象。PtrCCD家族成員不均勻的分布在毛果楊7 條染色體上，其中9 號染色體上最多，有4 個PtrCCD（見圖2），1 號染色體上含有2個PtrCCD，而4、5、6、18 和19 號染色體上僅分布1個PtrCCD；同時，PtrCCD家族11 個基因中有5 對具有旁系同源關(guān)系，且Ka/Ks 比值遠(yuǎn)低于1（見表3），其中僅有PtrCCD4a和PtrCCD4c是由基因串聯(lián)復(fù)制事件演化而來，而其余的4對是由基因組復(fù)制事件演化而來，表明它們在進(jìn)化過程中經(jīng)過了較強(qiáng)的純化選擇，從而導(dǎo)致有害的非同義替換在進(jìn)化過程消失，也進(jìn)一步表明基因復(fù)制是PtrCCD基因家族擴(kuò)張的主要原因（見圖2～3 和表3），這與已報道蘋果CCD家族分析結(jié)果十分相似［34］。同時，本項研究結(jié)果也與基因復(fù)制事件植物基因進(jìn)化的重要機(jī)制的公認(rèn)結(jié)論一致［35，37］

PtrCCD家族基因編碼蛋白含有多個基序，而Motif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 9、Motif 11（見圖5）是所有PtrCCD家族基因編碼蛋白均含有的基序，表明這5 個基序是該家族的特征基序，此外，PtrCCD家族基因還含有其他的基序，表明該基因家族生物學(xué)功能的多樣性。在毛果楊PtrCCD基因結(jié)構(gòu)中，同一分支的基因具有較為相似的結(jié)構(gòu)，而不同分支間差異較大，如PtrCCD8a和PtrCCD8b都具有6 個外顯子和5 個內(nèi)含子，PtrCCD4a和PtrCCD4b都具有13 個內(nèi)含子和14 個外顯子，而PtrCCD4d、PtrCCD4e、PtrCCD4h和PtrCCD4i僅含有一個外顯子而不含內(nèi)含子，這與柑橘（Citrus clementina）家族情況相似［38］。上述結(jié)果也預(yù)示著PtrCCD家族不同亞組之間基因功能產(chǎn)生了分化。

PtrCCD家族基因啟動子區(qū)域含有5 種植物激素響應(yīng)元件和6 種非生物脅迫響應(yīng)元件（見表4），如厭氧誘導(dǎo)元件、脅迫響應(yīng)元件和MYB 干旱誘導(dǎo)性結(jié)合位點。同時，各個家族所含元件數(shù)量與種類也存在差異，PtrCCD8a啟動子共含有16 個響應(yīng)元件，而PtrCCD4h僅含有2 個元件。上述結(jié)果表明，PtrCCD家族基因在毛果楊生長發(fā)育與逆境脅迫響應(yīng)中具有重要作用，但各個成員發(fā)揮的作用存在差異。

PtrCCD家族成員的表達(dá)特性分析表明，其中3 個家族成員在根部表達(dá)水平較高，7 個在莖部表達(dá)水平較高，3個在葉部表達(dá)水平較高（見圖6），這可能預(yù)示著各個成員在毛果楊生長發(fā)育過程中發(fā)揮著不同的作用。干旱和NaCl 脅迫后CCD家族qRT-PCR 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，毛果楊CCD 家族基因表達(dá)量均隨著脅迫時間的長短有不同程度的響應(yīng)（見圖7～8），其中PtrCCD8b都表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢；毛果楊在鹽脅迫不同時間下qRT-PCR 分析結(jié)果（見圖8）表明，在根和莖中多數(shù)基因均表現(xiàn)為先上升后下降的表達(dá)趨勢，這與大豆［24］和甘藍(lán)［25］CCD家族在鹽脅迫中表達(dá)情況較為相似；而不同的是，CCD家族在NaCl處理的毛果楊葉片中，表達(dá)量呈現(xiàn)出、上升、下降再上升的雙峰趨勢。鹽脅迫對植物的傷害是一個復(fù)雜的生理生化過程，主要包括滲透脅迫、離子毒害，活性氧脅迫等［39～40］在鹽脅迫環(huán)境下，植物首先受到滲透脅迫并作出相應(yīng)調(diào)整［41］，因此第一階段上升的趨勢可能是基因響應(yīng)滲透脅迫的過程。土壤中的部分金屬離子如Ca2+、Mg2+、Fe2+等沉積，從而抑制植物對這些金屬離子的吸收，引起營養(yǎng)失衡，長期在鹽脅迫環(huán)境下，植物對離子吸收不均衡，容易產(chǎn)生離子毒害［42～43］，而第二階段上升可能是因為某些CCD 家族的基因響應(yīng)離子毒害的過程。以上結(jié)果表明，PtrCCD家族基因在干旱和鹽脅迫情況下具有不同程度的響應(yīng)能力，進(jìn)一步表明該基因家族在非生物脅迫中具有重要作用。本研究對于PtrCCD家族基因生物學(xué)功能的鑒定和抗逆基因資源挖掘具有積極意義。