葉峰 秦緣 裴曉東 姜浩 施美君 張一揚

摘要?探究氮鉀濃度對煙苗生理生化特性的影響，為煙葉苗期氮鉀營養(yǎng)平衡提供參考依據(jù)。采用水培法，利用基礎(chǔ)Hoagland營養(yǎng)液，設置5個不同氮鉀濃度處理，分析處理間煙苗的生理生化指標差異。結(jié)果表明，氮濃度對煙苗干物質(zhì)、葉綠素的積累有顯著影響，在相同鉀濃度下，隨著氮濃度的增加，煙苗干物質(zhì)、葉綠素含量、根系活力顯著增加。不同氮水平下，低鉀處理間的根系MDA含量、葉片GS活性差異顯著。K+對煙苗葉綠素的合成、根系活力、GS活性有一定的促進作用。高氮水平下，高濃度K+會使根系活力、葉片可溶性蛋白含量下降。

關(guān)鍵詞?氮;?鉀;煙苗

中圖分類號?S572?文獻標識碼?A

文章編號?0517-6611（2021）03-0165-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.03.045

Abstract?To?explore?the?effect?of?nitrogen?and?potassium?concentration?on?the?physiological?and?biochemical?characteristics?of?tobacco?seedlings，and?to?provide?a?reference?for?the?nutritional?balance?of?nitrogen?and?potassium?in?tobacco?seedlings.Using?the?hydroponic?method，under?the?basic?Hoagland?nutrient?solution，5?different?nitrogen?and?potassium?concentration?treatments?were?set?to?analyze?the?differences?in?physiological?and?biochemical?indicators?of?tobacco?seedlings?between?treatments.Nitrogen?concentration?had?a?significant?effect?on?the?accumulation?of?dry?matter?and?chlorophyll?in?tobacco?seedlings.Under?the?same?potassium?concentration，with?the?increase?of?nitrogen?concentration，the?dry?matter，chlorophyll?content，and?root?activity?of?tobacco?seedlings?increased?significantly.Under?different?nitrogen?levels，root?MDA?content?and?leaf?GS?activity?were?significantly?different?between?treatments?with?low?potassium.K+?could?promote?the?chlorophyll?synthesis，root?vitality，and?GS?activity?of?tobacco?seedlings.Under?a?high?nitrogen?level，a?high?concentration?of?K+?would?reduce?root?vitality?and?leaf?soluble?protein?content.

Key?words?Nitrogen;Potassium;Tobacco?seedlings

N、K作為植物主要的營養(yǎng)元素，在植物礦物質(zhì)營養(yǎng)中存在廣泛相互作用，氮素水平過高會使煙草體內(nèi)蛋白質(zhì)的代謝過程延長，拖長煙株的營養(yǎng)生長期[1]。當大量施N而供K不足時，植物會積累蛋白質(zhì)合成的中間產(chǎn)物，蛋白質(zhì)合成速率下降，可溶性氨基酸含量明顯增加，并出現(xiàn)大量異常的含N化合物。研究[2-3]指出棉花幼苗容易受氮素脅迫，抑制地上部（幼苗葉片數(shù)和葉面積的增加等）以及地下部（根表面積、體積、細根0.05～0.20?mmol/L、中等長0.20～0.45?mmol/L的根）的生長，導致幼苗耗水量和干物質(zhì)量減少。

K可促進蛋白質(zhì)的合成，小麥籽粒中蛋白質(zhì)含量和某些氨基酸含量均隨著施K量的增加而增加[4]。K能促進水稻對N素的吸收和積累，但有人認為高濃度K+對NH4+吸收會產(chǎn)生拮抗作用[5]。在烤煙生產(chǎn)中，N/K比對葉片光合作用也有明顯的影響，N、K配合不當會降低品質(zhì)和經(jīng)濟效益[6]。施N能促進棉花和水稻對K+的吸收積累，供應K也會提高N的利用效率[7-8]。植物組織中普遍存在谷氨酰胺合成酶（GS），它是NH4+同化過程中的關(guān)鍵酶，對NH4+有較高的親和力，經(jīng)過GS/谷氨酸合成酶（GOGAT）循環(huán)形成氨基酸。研究[9-11]表明在氮肥供應正常的條件下，GS過量表達對植株生長和光合作用影響并不顯著，但在氮脅迫下，其過量表達能使轉(zhuǎn)基因煙草的株高、根干重和葉表面積顯著增加。兩者對增加作物產(chǎn)量、改善作物品質(zhì)具有重要作用。

筆者采用水培法，比較在不同氮鉀供應水平下煙苗的生長情況，結(jié)合生理、形態(tài)指標，研究氮鉀濃度對煙苗生理生化特性的影響，說明煙苗營養(yǎng)吸收的差異，為煙葉氮鉀營養(yǎng)平衡、提高肥料的利用率及配合施用提供營養(yǎng)診斷和合理施肥依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?試驗材料?供試品種為K326。

1.2?試驗設計?采用改良的Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)，改良后營養(yǎng)液成分：MgSO4·7H2O?0.5?mmol/L、KH2PO4?0.25?mmol/L、CaCl2?1.25?mmol/Lol/L、Fe-EDTA?25?μmol/L、H3BO3?29?μmol/L、MnCl2·4H2O?11.43?μmol/L、CuSO4·5H2O?0.4?μmol/L、ZnSO4·7H2O?0.8?μmol/L、H2MoO4·H2O?0.7?μmol/L。

以NH4NO3為唯一氮源，K2SO4為主要鉀源，設置5個不同氮鉀濃度處理（表1），根據(jù)試驗設計的培養(yǎng)條件加入相應濃度的NH4NO3和K2SO4，T1（NH4NO3?1.25?mmol/L）、T2（NH4NO3?3?mmol/L）、T3（NH4NO3?3?mmol/L、K2SO4?3?mmol/L），T4（NH4NO3?1.25?mmol/L、K2SO4?3?mmol/L），CK（NH4NO3?1.875?mmol/L、K2SO4?0.75?mmol/L），選取長勢良好、均勻一致的7葉1心煙苗，移入黑色塑料容器中（容器深約11?cm），塑料容器上覆蓋具孔蓋板，每個容器12株，用海綿固定在蓋板上。每隔3?d換一次營養(yǎng)液，并用Ca（OH）2調(diào)節(jié)pH于6.0～6.2。連續(xù)培養(yǎng)15?d，每個處理設3次重復。挑選具有代表性樣品用于測定生物量、根系活力等（將暫時來不及測定的樣品，放于-80?℃冰箱中保存）。

1.3?測定項目與方法

1.3.1?煙株生物量。用離子水沖洗植株，吸干水分，先分出根、莖和葉，再編號裝入信封，置于70?℃烘箱48?h，在千分之一天平稱重、記錄。

1.3.2?GS含量測定（試劑盒法）。

稱取約0.1?g組織，加入1?mL?提取液進行冰浴勻漿。8?000?g、4?℃離心10?min，取上清，置冰上待測。酶標儀預熱30?min以上，調(diào)節(jié)波長至540?nm，蒸餾水調(diào)零。測定管中依次加入160?μL試劑一、70?μL?試劑三、70?μL樣本提取液;對照管中依次加入160?μL試劑二、70?μL試劑三、70?μL樣本提取液，混勻，準確水浴30?min。再加入100?μL試劑四，靜置10?min后，5?000?g、常溫離心10?min，取200?μL上清液至96孔酶標板中，測定540?nm處的吸光值A(chǔ)。ΔA=A測定管-A對照管。GS活力單位（1?g組織在反應體系中1?min使540?nm下吸光值變化0.005定義為一個酶活力單位）按樣本鮮重計算：

式中，V反總為反應體系總體積，0.4?mL;V樣為加入樣本體積，0.07?mL;V樣總為加入提取液體積，1?mL;T為反應時間，30?min;W為樣品質(zhì)量，g。

1.3.3?MDA含量（試劑盒法）。稱取約0.1?g組織，加入1?mL提取液，進行冰浴勻漿;8?000?g、4?℃離心10?min，取上清，置冰上待測。測定步驟：①依次吸取0.3?μL?MDA檢測工作液、100?μL各樣本提取液、100?μL試劑三于1.5?mL離心管中混勻;②混合液在100?℃水浴中保溫30?min（蓋緊，防止水分散失），置于冰浴中冷卻，10?000?g、25?℃離心10?min;③吸取200?μL上清液于96孔酶標板中，測定其在450、532和600?nm處的吸光度。植物組織中MDA含量，按照樣品質(zhì)量計算：

式中，W為樣品質(zhì)量（g）。

1.3.4?葉綠素含量。葉綠素易溶于有機溶劑，故采用丙酮乙醇混合浸提法[12]，將無水乙醇和丙酮按1∶1制成混合提取液，稱取同一部位新鮮葉片0.25?g，剪碎后放入裝有20?mL混合液的玻璃瓶中，確保葉片全部浸到混合提取液中，蓋上瓶蓋，置于28～30?℃恒溫箱過夜，在此期間搖晃數(shù)次，次日若觀察到完全變白的葉片組織，即可取出玻璃瓶，用紫外分光光度計測定在波長470、663、645?nm下的光密度值。

1.3.5?可溶性蛋白質(zhì)含量。采用考馬斯亮藍法[13]，在稀酸溶液下，游離狀態(tài)呈紅色的馬斯亮藍G250會與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)結(jié)合變?yōu)榍嗌谝欢ǖ鞍踪|(zhì)濃度范圍內(nèi)（1～100?μg），蛋白質(zhì)的含量與色素結(jié)合物在波長595?nm下的光吸收成正比。①制作標曲。②提取粗酶。稱取鮮樣0.5?g放入研缽中，加入少量去離子水和石英砂研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入10?mL離心管，重復用去離子水潤洗研缽數(shù)次，將液體倒入離心管并定容至刻度線，將離心管置于離心機中以5?000?g離心10?min，得到蛋白質(zhì)提取液。③測定。分別用移液槍吸取0.5?mL樣品提取液，加入0.5?mL蒸餾水，放入2支試管（即2個平行管）再加入5.0?mL考馬斯亮藍溶液反應5?min后，以0.5?mL蒸餾水加5.0?mL考馬斯亮藍溶液作為參比，測定595?nm下的吸光度值。蛋白質(zhì)含量計算公式：

式中，W為查得標準曲線值，μg;VT為提取液體積，?mL;Vi為測定用提取液量，mL;W為制備提取液時所用樣品干重，g。

1.3.6?根系活力測定。

根系活力測定用氯化三苯基四氮唑（TTC）法[13]，稱取根樣品0.5?g，放入扁形玻璃稱量器皿（40?mm×25?mm）中，加入磷酸緩沖液（1/15?mol/L，pH?7.0）和0.4%TTC溶液各5?mL，保證根充分浸沒在混合溶液內(nèi)，在37?℃下暗保溫1～2?h，然后再加入1?mol/L硫酸2?mL，終止反應。（空白試驗需要先加硫酸后加根樣品，37?℃下暗保溫后不加硫酸，其他操作相同），最后將根取出，吸干水分后置于研缽，加入少量石英砂后少量分次加入乙酸乙酯充分研磨根，提取出TTF（三苯基甲），把紅色提取液移入10?mL試管，用乙酸乙酯標定至刻度線，在紫外分光光度計485?nm下比色，以空白為參比，得到光密度，計算四氮唑還原量。

1.4?數(shù)據(jù)分析

采用Excel?2010、SPSS?22.0（statistics?package?for?social?science）統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析，GraphPadprism?7作圖。

2?結(jié)果與分析

2.1?氮鉀濃度對煙苗生物量的影響

由表2可知，在低水平氮下，隨著鉀濃度的增加，除根冠比，地上部干重、根系干重、總干重都有增大，高鉀較低鉀處理分別高16%、5.6%、15.56%，低鉀、高鉀處理間差異不顯著，且均低于對照，低鉀處理的根冠比高于高鉀;高氮水平下，低鉀處理的地上部干重、總干重與高鉀、對照差異顯著，分別高出高鉀27.87%、25.64%，高出對照62.5%、58.8%，說明在高濃度氮下，一定濃度的鉀能促進煙苗干物質(zhì)的積累，低鉀和高鉀處理的根系干重差異不顯著，與對照差異顯著，較對照分別高29.2%、20.8%;鉀濃度相同時，隨著氮濃度的增加，地上部干重、根系干重、總干重增幅較大，在低濃度鉀下，高氮處理顯著高于低氮，較低氮高91.4%、72%、90.6%，在高濃度鉀下，高氮也顯著高于低氮處理，較低氮高29.1%、52.6%、31.3%，低水平鉀下的煙苗干物質(zhì)增幅顯著高于高水平鉀，不同鉀水平下高氮處理的根冠比均大于低氮，隨著氮水平的增加，煙苗干物質(zhì)量增大，表明氮濃度對煙苗干物質(zhì)的積累有顯著影響。

2.2?氮鉀濃度對煙苗葉綠體色素的影響

葉綠素是與光合作用（photosynthesis）有關(guān)的一類重要色素。光合作用是通過合成一些有機化合物將光能轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W能的過程。葉綠素具有吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化光能的作用[14]。由表3可知，在低水平氮下，低鉀、高鉀處理與對照間差異不顯著，但均低于對照，隨著鉀濃度的提高，煙苗的葉綠素a含量、葉綠素b含量、葉綠素總量、葉綠素濃度都有增加。高鉀較低鉀處理分別高1.3%、4.4%、2%、2.3%，對照較低鉀處理分別高14.1%、12.1%、13.6%、13.6%;高氮水平下，低鉀、高鉀處理葉綠素a含量、葉綠素b含量、葉綠素總量、葉綠素濃度都高于對照，低鉀處理的葉綠素a含量、葉綠素b含量、葉綠素總量、葉綠素濃度與高鉀差異顯著，只有葉綠素b與對照差異顯著，低鉀較高鉀處理分別高25.8%、30.4%、26.6%、26%;在低鉀水平下，隨著氮濃度的增加，葉綠素a含量、葉綠素b含量、葉綠素總量、葉綠素濃度都有增加，高氮處理顯著高于低氮處理，較低氮處理分別高24.3%、31.9%、26.3%、26.6%。

2.3?氮鉀濃度對煙苗可溶性蛋白的影響

可溶性蛋白是調(diào)節(jié)植物滲透的重要營養(yǎng)物質(zhì)，可溶性蛋白的積累與增加有利于提高細胞的保水能力，保護細胞生物膜以及膜內(nèi)生命物質(zhì)。由圖1可知，煙苗葉片和根系可溶性蛋白含量有顯著差異。在不同氮水平下，煙苗葉片可溶性蛋白含量隨著鉀濃度的增加略有下降，低氮水平下，低鉀較高鉀處理高3.6%，與對照差異不顯著;高氮水平下，低鉀、高鉀處理差異不顯著，低鉀較高鉀處理高2.3%，低鉀、高鉀處理與對照間可溶性蛋白含量差異顯著，較對照分別高17.0%、14.4%;在相同鉀濃度下，葉片可溶性蛋白含量隨著氮濃度的增加而增多，在不同氮水平下，煙苗根系可溶性蛋白含量表現(xiàn)出與葉片相同的趨勢，低鉀處理與高鉀處理間差異不顯著，低鉀處理與對照間差異顯著，低氮水平下，較對照高19.2%，高氮水平下，較對照高20.1%。處理間根系可溶性蛋白含量增幅大于葉片。

2.4?氮鉀濃度對煙苗GS活性的影響

谷氨酰胺合成酶（GS）作為氮的供體，參與氮有機物的生物合成，是氮素代謝過程的關(guān)鍵酶[15]。由圖2可知，煙苗葉片與根系中谷氨酰胺合成酶活性有顯著差異。在低氮水平下，隨著鉀濃度的增加，煙苗葉片中谷氨酰胺合成酶活性降低，低鉀、高鉀處理的谷氨酰胺合成酶活性都低于對照，分別較對照低31.1%、36.5%，低鉀處理高于高鉀處理，較高鉀處理高4.1%;在高氮水平下，低鉀、高鉀處理與對照間谷氨酰胺合成酶活性差異顯著，較對照分別高19.7%、41.7%;在相同鉀濃度下，隨著氮濃度的增大，谷氨酰胺合成酶活性增加，低鉀水平下，處理間差異顯著，高氮處理的谷氨酰胺合成酶活性比低氮高41.3%;高鉀水平下，高氮處理顯著高于低氮，較其高74.1%。在低氮水平下，高鉀處理的根系谷氨酰胺合成酶活性較低鉀處理的顯著高15.4%，高鉀處理的谷氨酰胺合成酶活性與對照差異顯著;高氮水平下，低鉀、高鉀處理與對照間差異顯著，分別較對照高63.9%、64.7%。

2.5?氮鉀濃度對煙苗MDA活性的影響

植物細胞質(zhì)膜過氧化的最終產(chǎn)物是MDA，其含量高低可以反映出細胞膜的損傷程度和植物抗逆性的強弱[16]。由圖3可知，各處理間煙苗葉片中的丙二醛活性無顯著差異。在低氮水平下，隨著鉀濃度的增加，低鉀、高鉀處理的煙苗葉片丙二醛活性有所降低，低鉀處理較高鉀處理、對照分別高12.5%、8.6%;在高氮水平下，隨著鉀濃度的增加，處理間煙苗葉片丙二醛活性有

所增加，處理與對照間的丙二醛活性差異不顯著，對照丙二醛活性較低鉀處理高9.8%;在低鉀水平下，各處理間的丙二醛活性差異不顯著，低氮處理較高氮處理高19.1%;在高鉀水平下，高氮處理的丙二醛活性較低氮處理高3.2%。在低氮水平下，隨著鉀濃度的增加，低鉀、高鉀處理的煙苗根系丙二醛活性有所增加，低鉀處理較高鉀處理的丙二醛活性高15.9%，處理與對照間的丙二醛活性差異不顯著;高氮水平下，低鉀處理丙二醛活性顯著高出對照的39.3%，在鉀濃度相同時，隨著氮濃度的增大，丙二醛活性增加。

2.6?氮鉀濃度對煙苗根系活力的影響

根系活力是衡量根系功能的重要指標，直接影響植株的生長以及對養(yǎng)分的吸收。由圖4可知，在鉀濃度相同時，處理間根系活力隨著氮濃度的增大而增大，在低鉀水平下，高氮處理的根系活力顯著高于低氮處理和對照，分別高32.0%、21.7%，在氮濃度相同時，隨著鉀離子濃度的增加，根系活力降低，低鉀處理根系活力較高鉀處理顯著高13.4%。

3?討論

不適宜的N/K比會阻礙烤煙的生長發(fā)育。N和K在植物代謝過程中存在協(xié)同作用，協(xié)同作用常出現(xiàn)在較低濃度養(yǎng)分下，同性離子、陰離子與陽離子之間，為了維持電荷平衡和恢復供應礦質(zhì)養(yǎng)分的需要。干物質(zhì)積累的主要形式是通過煙葉光合與呼吸作用、合成與分解代謝平衡的碳水化合物總量[17]。該試驗中，隨著氮水平的增加，煙苗干物質(zhì)量增大，這與單長卷等[18]研究結(jié)果一致。表明氮濃度對煙苗干物質(zhì)的積累有顯著影響，氮能改變碳水化合物的庫源關(guān)系、能量消耗水平和調(diào)節(jié)光合產(chǎn)物的積累[19]。

該試驗在相同鉀濃度時，隨著氮濃度的增加，葉綠素含量、根系活力顯著增加，煙苗葉片與根系中可溶性蛋白、谷氨酰胺合成酶活性均顯著差異，其中高氮低鉀處理的生理特征表現(xiàn)最好。說明供氮水平能顯著影響葉綠素的合成及其相關(guān)酶的活性[17]。研究認為煙株在正常營養(yǎng)供應水平下生長，葉綠素的合成、運轉(zhuǎn)達動態(tài)平衡，超量的氮素、鉀素對其無意義[20]。該試驗中，煙苗的葉綠素含量在低氮水平下會隨著鉀濃度的提高而增加，說明K+對煙苗葉綠素的合成有一定的促進作用，高氮水平下，高濃度K+反而會抑制葉綠素的合成。

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