夏儒銳 梁培育 王聲興 歐善際 彭曉暉

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，?？?570102)

膀胱癌是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的癌癥之一，近年來(lái)其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。膀胱癌分為兩大類(lèi)，非肌肉浸潤(rùn)性和肌肉浸潤(rùn)性[1]。大多數(shù)情況下的膀胱癌(75%～80%)是非肌肉侵襲性腫瘤，其復(fù)發(fā)率高達(dá)50%～70%[2]。盡管已有多種治療方法，如根治性膀胱切除術(shù)、保留膀胱的經(jīng)尿道切除術(shù)、化學(xué)療法和放射療法，但轉(zhuǎn)移性膀胱癌的總生存期僅為13個(gè)月[3]。因此，迫切需要進(jìn)一步探索膀胱癌腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移分子機(jī)制，并找到新的治療策略來(lái)改善膀胱癌患者的預(yù)后。非編碼RNA是一種不編碼蛋白質(zhì)，沒(méi)有完整開(kāi)放閱讀框的轉(zhuǎn)錄副產(chǎn)物RNA，起初被認(rèn)為是基因轉(zhuǎn)錄的“噪音”，現(xiàn)代研究證明，其在人類(lèi)的多種癌癥中均具有調(diào)控作用[4]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA是長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，微小RNA是長(zhǎng)度介于18～24個(gè)核苷酸之間的短鏈內(nèi)源性非編碼RNA，二者在人類(lèi)癌癥的進(jìn)展中均具有調(diào)控作用[5]。lnc RNA 小核仁RNA宿主基因8(small nucleolus RNA host gene 8，SNHG8)在人類(lèi)的很多癌癥中均出現(xiàn)表達(dá)異常[6]，但是其在膀胱癌中是否會(huì)出現(xiàn)異常尚且未知。已知miR-335-5p在膀胱癌中作為抑癌基因發(fā)揮作用[7]，但是其與SNHG8之間的關(guān)系尚未完全清楚。本研究旨在探索lnc RNA SNHG8在膀胱癌細(xì)胞中增殖、遷移、侵襲和凋亡的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 膀胱移行上皮細(xì)胞SV-HUC-1、膀胱癌細(xì)胞SW780、5637、T24、HT-1197均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)試劑購(gòu)自碧云天；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙錠(PI)試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物公司；BD Transwell小室購(gòu)自北京明陽(yáng)科華生物公司；RNA抽提試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒均購(gòu)自日本TaKaRa。實(shí)驗(yàn)中所涉及的引物和質(zhì)粒(si-con、si-SNHG8、miR-con、miR-335-5p mimics、SNHG8)由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)并合成。pCDNA3.1(+)載體質(zhì)粒購(gòu)自上海酶研生物公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞的培養(yǎng) 將膀胱移行上皮細(xì)胞SV-HUC-1、膀胱癌細(xì)胞SW780、5637、T24、HT-1197用含有10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染與分組 把正常培養(yǎng)的SV-HUC-1、SW780、5637、T24、HT-1197細(xì)胞分別標(biāo)記為SV-HUC-1組、SW780組、5637組、T24組、HT-1197組。將SW780細(xì)胞隨機(jī)分為NC組(不做任何處理)、si-con組(轉(zhuǎn)染si-con)、si-SNHG8組(轉(zhuǎn)染si-SNHG8)、pcDNA組(轉(zhuǎn)染pcDNA)、pcDNA-SNHG8組(轉(zhuǎn)染pcDNA-SNHG8)、miR-con組(轉(zhuǎn)染miR-con)、miR-335-5p組(轉(zhuǎn)染miR-335-5p mimics)、si-SNHG8+anti-miR-con組(共轉(zhuǎn)染si-SNHG8和anti-miR-con)、si-SNHG8+anti-miR-335-5p組(共轉(zhuǎn)染si-SNHG8和anti-miR-335-5p)，各組細(xì)胞均用5倍量的脂質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6 h后，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。用qRT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染成功后用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.3qRT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中SNHG8、miR-335-5p的表達(dá) 收集細(xì)胞，將其用RNA抽提試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒提取RNA并合成cDNA。再用qRT-PCR試劑盒檢測(cè)其中SNHG8、miR-335-5p的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果以GAPDH、U6為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算SNHG8、miR-335-5p的表達(dá)。引物信息(5′-3′)：SNHG8上游引物AAGTTTACAAGCATGCGCGG，下游引物TCAAACTGACGGTTCTCGGG；GAPDH 上游引物CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC，下游引物ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC；miR-335-5p上游引物UGUUUUGAGCGGGGGUCAAGAGC，下游引物CUCUCAUUUGCUAUAUUCA；U6上游引物CTCGCTTCGGCAGCACA，下游引物AACGCTTCACGAATTT-GCGT；反應(yīng)條件為：95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)，最后延伸至72℃ 5 min。

1.2.4Western blot檢測(cè)細(xì)胞中Ki-67、Cleaved caspase-3、MMP-2、MMP-9的蛋白表達(dá) 收集培養(yǎng)48 h的待檢測(cè)細(xì)胞，充分裂解后，提取總蛋白，用BCA法定量。加入5倍體積的上樣緩沖液對(duì)蛋白進(jìn)行沸水浴變性，用上清進(jìn)行上樣。將蛋白小心加入梳子孔中，注意不要溢出孔外。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，整個(gè)轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)需要在4℃低溫條件下進(jìn)行。然后5%脫脂奶粉封閉處理，一抗稀釋液4℃孵育過(guò)夜處理。第2天，將膜轉(zhuǎn)移至二抗稀釋液中室溫下孵育2 h。最后在暗室中進(jìn)行顯影、定影和曝光。用Image J分析條帶的灰度值。

1.2.5MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率 收集培養(yǎng)48 h的待檢測(cè)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞至5×105個(gè)/ml，取100 μl加入96孔板，依次加入20 μl的MTT液和150 μl的DMSO混勻溶解后，在490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)細(xì)胞的吸光度。細(xì)胞存活率=A490樣品/A490對(duì)照×100%。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集培養(yǎng)48 h的待檢測(cè)細(xì)胞，按照Annexin V-FITC/PI試劑盒要求操作，依次加入Annexin V-FITC、PI，避光反應(yīng)結(jié)束后，上流式細(xì)胞儀，檢測(cè)分析結(jié)果。

1.2.7Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 采用帶基質(zhì)膠的小室檢測(cè)細(xì)胞的侵襲數(shù)量，不含基質(zhì)膠的小室檢測(cè)細(xì)胞的遷移數(shù)量。將培養(yǎng)48 h的待檢測(cè)細(xì)胞調(diào)整至5×105個(gè)/ml，用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，從中吸取200 μl平鋪在上室聚碳酸酯膜表面，以浸濕膜為準(zhǔn)。取600 μl含血清的培養(yǎng)基加入下室內(nèi)。將小室置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)24 h后取出小室。配置甲醇固定液和1 g/L的結(jié)晶紫染色液。先擦去上室膜的上表面殘余細(xì)胞，再將膜侵入甲醇中固定30 min，然后轉(zhuǎn)移至染液中染色15 min，結(jié)束后將膜進(jìn)行封片，鏡檢。選取5個(gè)視野進(jìn)行拍照計(jì)數(shù)，取平均值。每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8生物信息學(xué)分析 通過(guò)在線(xiàn)預(yù)測(cè)網(wǎng)站mircode(http://mircode.org/)預(yù)測(cè)SNHG8的靶點(diǎn)。

1.2.9雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞熒光活性 通過(guò)熒光素酶與底物結(jié)合發(fā)生化學(xué)發(fā)光的特性，將化學(xué)合成的目的基因序列(SNHG8-WT)和突變序列(SNHG8-MUT)克隆在螢火蟲(chóng)熒光素酶基因上游，構(gòu)建熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。再將其與miR-335-5p mimics、miR-NC共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞。用裂解液充分裂解細(xì)胞，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)要求操作，加入底物、終止液。結(jié)束后，檢測(cè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，以海參熒光素酶的發(fā)光強(qiáng)度與螢火蟲(chóng)熒光素酶發(fā)光強(qiáng)度的比值反映細(xì)胞的熒光活性。

2 結(jié)果

2.1SNHG8和miR-335-5p 在膀胱移行上皮細(xì)胞株和膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá) 結(jié)果如表1所示，與SV-HUC-1組相比，SW780、5637、T24、HT-1197細(xì)胞中SNHG8表達(dá)均顯著升高，miR-335-5p表達(dá)均顯著降低(P<0.05)。

表1 SNHG8和miR-335-5p 在膀胱移行上皮細(xì)胞株和膀胱癌細(xì)胞的表達(dá)

2.2沉默SNHG8抑制膀胱癌細(xì)胞 SW780增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 結(jié)果如表2和圖1所示，與si-con組相比，si-SNHG8組細(xì)胞中SNHG8的mRNA表達(dá)顯著降低，Ki-67蛋白表達(dá)顯著降低，Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)顯著升高，細(xì)胞存活率顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。

圖1 沉默SNHG8對(duì)膀胱癌細(xì)胞 SW780增殖和細(xì)胞凋亡的影響

表2 SNHG8抑制膀胱癌細(xì)胞 SW780增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

2.3沉默SNHG8抑制膀胱癌細(xì)胞 SW780遷移和侵襲 結(jié)果如圖2和表3所示，與si-con組相比，si-SNHG8組細(xì)胞中MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)均顯著降低，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著降低(P<0.05)。

表3 沉默SNHG8抑制膀胱癌細(xì)胞 SW780遷移和侵襲

圖2 沉默SNHG8抑制膀胱癌細(xì)胞MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)

2.4SNHG8靶向調(diào)控miR-335-5p 的表達(dá) 結(jié)果如圖3所示，SNHG8與miR-335-5p之間存在靶向結(jié)合位點(diǎn)。與miR-con組相比，miR-335-5p組WT-SNHG8細(xì)胞熒光活性顯著降低(表4)。與si-con組相比，si-SNHG8組細(xì)胞中SNHG8表達(dá)顯著升高，與pcDNA組相比，pcDNA-SNHG8組細(xì)胞中SNHG8表達(dá)顯著降低(表5)(P<0.05)。

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

表5 SNHG8靶向調(diào)控miR-335-5p 表達(dá)

圖3 SNHG8與miR-335-5p 存在互補(bǔ)序列

2.5轉(zhuǎn)染miR-335-5p 抑制膀胱癌細(xì)胞 SW780增殖、遷移和侵襲及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 結(jié)果如表6和圖4所示，與miR-con組相比，miR-335-5p組細(xì)胞中 miR-335-5p表達(dá)顯著升高，Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)均顯著降低，Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)顯著升高，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著降低，細(xì)胞存活率顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。

圖4 轉(zhuǎn)染miR-335-5p對(duì)膀胱癌細(xì)胞凋亡以及增殖、凋亡、遷移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表6 轉(zhuǎn)染miR-335-5p對(duì)膀胱癌細(xì)胞SW780增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響

2.6干擾miR-335-5p 部分逆轉(zhuǎn)沉默SNHG8對(duì)膀胱癌細(xì)胞 SW780的抑制作用 結(jié)果如表7和圖5所示，與si-SNHG8+anti-miR-con組相比，si-SNHG8+anti-miR-335-5p組細(xì)胞中miR-335-5p表達(dá)顯著降低，Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)均顯著升高，Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)顯著降低，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著升高，細(xì)胞存活率顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。

表7 轉(zhuǎn)染anti-miR-335-5p部分逆轉(zhuǎn)沉默SNHG8對(duì)膀胱癌細(xì)胞SW780增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響

圖5 轉(zhuǎn)染anti-miR-335-5p部分逆轉(zhuǎn)沉默SNHG8對(duì)膀胱癌細(xì)胞SW780凋亡以及增殖、遷移、侵襲和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

SNHG8在人類(lèi)的很多癌癥中均作為致癌基因發(fā)揮促進(jìn)癌癥發(fā)生發(fā)展的作用，但是其在膀胱癌中的研究甚少[8]。ZHEN等[9]在研究中發(fā)現(xiàn)，SNHG8在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中顯著上調(diào)，另外，敲低SNHG8能夠明顯抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并且miR-663可與SNHG8相互作用，通過(guò)雙重?zé)晒馑孛笀?bào)告基因分析證實(shí)了二者之間的靶向關(guān)系，此外，回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)表明SNHG8通過(guò)調(diào)節(jié)miR-663發(fā)揮了促進(jìn)腫瘤惡化的作用，揭示了SNHG8在結(jié)直腸癌中被上調(diào)，并通過(guò)靶向miR-663促進(jìn)結(jié)直腸癌的增殖、遷移和侵襲。DONG等[10]在研究中報(bào)道，在肝癌組織和細(xì)胞中，lncRNA SNHG8的表達(dá)水平明顯增加，并且是患者腫瘤復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)后因素，此外，SNHG8的敲低抑制細(xì)胞增殖、侵襲，而SNHG8的過(guò)表達(dá)則具有相反的作用，并且SNHG8可作為miR-149的靶標(biāo)，明顯削弱miR-149在肝癌細(xì)胞中的抑癌作用，揭示lncRNA SNHG8可通過(guò)靶向抑制miR-149促進(jìn)肝癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。我們?cè)诒狙芯恐袡z測(cè)了膀胱癌細(xì)胞中SNHG8的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其異常升高，且沉默SNHG8能夠抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲并促進(jìn)凋亡，這與SNHG8在結(jié)直腸癌、肝癌中的作用相一致，說(shuō)明了SNHG8也具有促進(jìn)膀胱癌惡化的功能，這是首次發(fā)現(xiàn)該基因在膀胱癌中的功能；進(jìn)一步通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SNHG8可靶向負(fù)調(diào)控miR-335-5p，這表明SNHG8在膀胱癌中的功能可能與調(diào)控miR-335-5p有關(guān)，也為膀胱癌的精準(zhǔn)治療提供了新的作用靶標(biāo)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果為SNHG8在其他癌癥中的功能開(kāi)發(fā)提供了新的理論參考。

miRNA在癌癥的進(jìn)展中具有重要的調(diào)控作用，其可作為上游的Lnc RNA、Circ RNA的靶標(biāo)，也可與下游的靶基因結(jié)合進(jìn)而干擾靶基因的表達(dá)，以發(fā)揮調(diào)控作用[11-12]。有研究報(bào)道，miR-335-5p能夠通過(guò)靶向絲裂原活化蛋白激酶1、Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶，抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[13-14]。LIU等[15]發(fā)現(xiàn)，miR-335表達(dá)明顯降低，而CT10激酶樣蛋白的調(diào)節(jié)因子(CRKL)表達(dá)則明顯升高，CRKL被證實(shí)是miR-335在膀胱癌細(xì)胞中的特異性靶標(biāo)，并且CRKL與miR-335表達(dá)之間的關(guān)系在膀胱癌組織中呈負(fù)相關(guān)，此外，膀胱癌細(xì)胞中的CRKL siRNA基團(tuán)或miR-335模擬物能夠明顯抑制細(xì)胞增殖和遷移，揭示了miR-335可通過(guò)上調(diào)CRKL抑制膀胱癌細(xì)胞增殖和遷移。YANG等[7]在研究中發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)鏈非編碼核糖核酸SLCO4A1-AS1(SLCO4A1-AS1)在膀胱癌中具有促進(jìn)癌癥進(jìn)一步惡化的作用，其機(jī)制之一為靶向miR-335-5p進(jìn)而抑制八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4(OCT4)，可見(jiàn)miR-335-5p在膀胱癌惡化中的重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-335-5p在膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)異常降低，并且過(guò)表達(dá)miR-335-5p可抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲并促進(jìn)凋亡，而抑制miR-335-5p可部分逆轉(zhuǎn)沉默SNHG8對(duì)膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前人的研究結(jié)果相一致，說(shuō)明miR-335-5p為SNHG8的下游靶標(biāo)之一，為癌癥的治療提供新方向。

綜上所述，長(zhǎng)鏈非編碼RNA SNHG8可調(diào)控膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲并促進(jìn)凋亡，其機(jī)制與靶向miR-335-5p有關(guān)，為膀胱癌的治療提供參考依據(jù)。