陳 剛 陳九霖 吳 俊

(黔西南州人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，興義 562400)

動(dòng)脈粥樣硬化是臨床常見(jiàn)的一種炎癥性疾病，其主要病理特征為脂質(zhì)沉積形成動(dòng)脈管壁脂肪條紋導(dǎo)致粥樣斑塊的形成，并可引發(fā)缺血性心臟病等心血管疾病，目前心血管疾病發(fā)病率與死亡率較高，發(fā)病率逐年上升[1-2]。研究表明動(dòng)脈粥樣硬化是增加心血管疾病發(fā)病率與死亡率的危險(xiǎn)因素[3]。因而尋找治療動(dòng)脈粥樣硬化的藥物對(duì)心血管疾病的預(yù)防及治療均具有重要意義。安石榴苷(punicalagin，PUN)是石榴皮多酚的主要活性成分，研究表明PUN具有抗炎、抗氧化等多種生理活性，還可通過(guò)抗氧化作用而減輕慢性支氣管炎大鼠的炎癥反應(yīng)[4-5]。但PUN對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的治療效果及其可能作用機(jī)制尚未可知。微小RNA-132-5p(microRNA-132-5p，miR-132-5p)在急性心肌梗死患者中呈低表達(dá)，藥物處理后可能通過(guò)提高miR-132-5p的表達(dá)達(dá)到治療效果[6]。StarBase預(yù)測(cè)顯示腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)可能是miR-132-5p的靶基因，研究表明沉默TRAF6表達(dá)可抑制炎癥相關(guān)細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)表達(dá)水平從而減輕內(nèi)毒素/半乳糖誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷[7]。但PUN是否通過(guò)miR-132-5p/TRAF6途徑調(diào)控氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，oxLDL)誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞損傷尚未可知。本研究主要探討PUN對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)的影響及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 PUN購(gòu)自濟(jì)寧天之藍(lán)生物科技有限公司；人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞HA-VSMC購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)；oxLDL購(gòu)自上海魯汶生物科技有限公司；杜氏改良培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清均購(gòu)自賽默飛世爾科技公司；miR-132-5p模擬物(mimics)及陰性對(duì)照(miR-NC)、miR-132-5p特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-132-5p)及其陰性對(duì)照(anti-miR-NC)均購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司；Lipofectamine2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄與熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自大連TaKaRa公司；膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；IL-1β、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；兔抗人TRAF6抗體購(gòu)自武漢艾美捷科技有限公司；兔抗人B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)抗體購(gòu)自上海玉博生物科技有限公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2方法

1.2.1藥物處理及實(shí)驗(yàn)分組 人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用50 mg/ml的oxLDL處理血管平滑肌細(xì)胞24 h構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化模型[8]。Con組采用等量生理鹽水處理細(xì)胞。收集造模后的血管平滑肌細(xì)胞，用不同濃度的PUN處理 24 h，分別記作oxLDL+PUN-L組(5 μg/ml PUN)、oxLDL+PUN-M組(10 μg/ml PUN)、oxLDL+PUN-H組(20 μg/ml PUN)[9]。后續(xù)實(shí)驗(yàn)觀察miR-132-5p過(guò)表達(dá)及抑制miR-132-5p表達(dá)對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞損傷的影響，實(shí)驗(yàn)分組：oxLDL+miR-NC組(miR-NC轉(zhuǎn)染至血管平滑肌細(xì)胞48 h，隨后使用oxLDL處理24 h)、oxLDL+miR-132-5p組(miR-132-5p mimics轉(zhuǎn)染至血管平滑肌細(xì)胞48 h，隨后使用oxLDL處理24 h)、oxLDL+PUN+anti-miR-NC組(anti-miR-NC轉(zhuǎn)染至血管平滑肌細(xì)胞48 h，隨后用50 mg/ml oxLDL與20 μg/ml PUN共同處理24 h)、oxLDL+PUN+anti-miR-132-5p組(anti-miR-132-5p轉(zhuǎn)染至血管平滑肌細(xì)胞48 h，隨后用50 mg/ml oxLDL與20 μg/ml PUN共同處理 24 h)。

1.2.2ELISA檢測(cè)IL-1β、TNF-α濃度 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清，采用IL-1β、TNF-α ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)IL-1β、TNF-α濃度，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取各組血管平滑肌細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌，加入1×Binding buffer制備細(xì)胞懸液(1×106個(gè)/ml)，加入5 μl Annexin V-FITC與5 μl PI，室溫避光孵育15 min，加入400 μl結(jié)合緩沖液置于流式細(xì)胞儀檢測(cè)并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.4實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative real-time reverse transcription PCR，qRT-PCR)檢測(cè)細(xì)胞中miR-132-5p、TRAF6 mRNA表達(dá)水平 取oxLDL+miR-NC組、oxLDL+miR-132-5p組、oxLDL+PUN+anti-miR-NC組、oxLDL+PUN+anti-miR-132-5p組血管平滑肌細(xì)胞，采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)配置反應(yīng)體系得到cDNA。miR-132-5p正向引物：5′-TGGATCCCCCCCAGTCCCCGTCCCTCAG-3′，反向引物：5′-TGAATTCGGATACCTTGGCCGGGA-GGAC-3′；U6正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGC-ACA-3′，反向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；TRAF6正向引物：5′-AGTTGTGTGCGTGTGACA-GT-3′，反向引物：5′-ATGTAGCTGCGTCGCTTGTA-3′；GAPDH正向引物：5′-AACGGATTTGGTCGTAT-TG-3′，反向引物：5′-GGAAGATGGTGATGGGATT-3′，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)配置qRT-PCR反應(yīng)體系，置于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)各基因Ct值，反應(yīng)條件：95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共循環(huán)40次。miR-132-5p以U6為內(nèi)參基因，TRAF6以GAPDH為內(nèi)參基因，反應(yīng)結(jié)束后，采用 2-ΔΔCt法計(jì)算miR-132-5p、TRAF6 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站StarBase預(yù)測(cè)顯示TRAF6的3′UTR中含有與miR-132-5p互補(bǔ)的核苷酸序列，將含有結(jié)合位點(diǎn)的TRAF6-3′UTR插入構(gòu)建野生型載體WT-TRAF6，利用基因突變技術(shù)將結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，將含有突變位點(diǎn)的TRAF6-3′UTR插入構(gòu)建突變型載體MUT-TRAF6，取對(duì)數(shù)期血管平滑肌細(xì)胞，將WT-TRAF6、MUT-TRAF6分別與miR-NC、miR-132-5p mimics共轉(zhuǎn)染至血管平滑肌細(xì)胞，檢測(cè)各組熒光素酶活性。為驗(yàn)證miR-132-5p對(duì)TRAF6表達(dá)的調(diào)控作用，通過(guò)Western blot檢測(cè)miR-132-5p過(guò)表達(dá)或抑制miR-132-5p的表達(dá)后細(xì)胞中TRAF6蛋白表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)分組：miR-NC組、miR-132-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-132-5p組，轉(zhuǎn)染時(shí)嚴(yán)格按照Lipofectamine2000試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.6Western blot檢測(cè)TRAF6、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá) 收集各組對(duì)數(shù)期血管平滑肌細(xì)胞，加入蛋白裂解液提取蛋白，采用BCA法定量蛋白，加入5×上樣緩沖液，沸水中煮10 min，蛋白變性，采用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜、封閉，加入TRAF6(1∶1 000)、Bax(1∶800)、Bcl-2(1∶800)一抗，TBST洗膜，加入二抗(1∶5 000)，TBST洗膜，滴加ECL反應(yīng)，暗室內(nèi)曝光顯影，應(yīng)用Quantity One軟件檢測(cè)條帶灰度值，蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參照條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1PUN對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Con組相比，oxLDL組血管平滑肌細(xì)胞中促炎因子IL-1β、TNF-α水平均顯著升高(P<0.05)；與oxLDL組相比，oxLDL+PUN-L組、oxLDL+PUN-M組、oxLDL+PUN-H組血管平滑肌細(xì)胞中促炎因子IL-1β、TNF-α水平均顯著降低(P<0.05)；oxLDL+PUN-H組血管平滑肌細(xì)胞中促炎因子IL-1β、TNF-α水平均顯著低于oxLDL+PUN-L組、oxLDL+PUN-M組(P<0.05)，PUN不同劑量組間IL-1β、TNF-α水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 PUN對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響

2.2PUN對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞凋亡的影響 與Con組相比，oxLDL組血管平滑肌細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；與oxLDL組相比，oxLDL+PUN-L組、oxLDL+PUN-M組、oxLDL+PUN-H組血管平滑肌細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，PUN不同劑量組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中oxLDL+PUN-H組作用效果最為顯著(P<0.05)，見(jiàn)圖1、表2。

圖1 PUN對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞凋亡的影響

表2 PUN對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞凋亡的影響

2.3PUN對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞中miR-132-5p和TRAF6表達(dá)的影響 與Con組相比，oxLDL組血管平滑肌細(xì)胞中miR-132-5p的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，TRAF6 mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)；與oxLDL組相比，oxLDL+PUN-L組、oxLDL+PUN-M組、oxLDL+PUN-H組血管平滑肌細(xì)胞中miR-132-5p的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，TRAF6 mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)，PUN不同劑量組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中oxLDL+PUN-H組作用效果最為顯著(P<0.05)，見(jiàn)圖2、表3。

表3 PUN對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞中miR-132-5p和TRAF6表達(dá)的影響

圖2 TRAF6蛋白表達(dá)

2.4miR-132-5p靶向調(diào)控TRAF6的表達(dá) StarBase預(yù)測(cè)顯示TRAF6的3′UTR中含有與miR-132-5p互補(bǔ)的核苷酸序列，見(jiàn)圖3A。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染野生型載體WT-TRAF6的細(xì)胞中，與miR-NC組相比，miR-132-5p組熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；轉(zhuǎn)染突變型載體MUT-TRAF6的細(xì)胞中，miR-132-5p組與miR-NC組熒光素酶活性相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表4。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與miR-NC組比較，miR-132-5p組TRAF6蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；與anti-miR-NC組比較，anti-miR-132-5p組TRAF6蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖3B、表5。

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

表5 miR-132-5p調(diào)控TRAF6蛋白表達(dá)

圖3 miR-132-5p靶向調(diào)控TRAF6的表達(dá)

2.5miR-132-5p過(guò)表達(dá)對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞損傷的影響 與oxLDL+miR-NC組比較，oxLDL+miR-132-5p組血管平滑肌細(xì)胞中miR-132-5p的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，TRAF6蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，促炎因子IL-1β、TNF-α水平均顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖4、表6。

表6 miR-132-5p過(guò)表達(dá)對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞損傷的影響

圖4 miR-132-5p過(guò)表達(dá)對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞凋亡的影響

2.6抑制miR-132-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)PUN(20 μg/ml)對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞損傷的作用 與oxLDL+PUN+anti-miR-NC組相比，oxLDL+PUN+anti-miR-132-5p組血管平滑肌細(xì)胞中miR-132-5p的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，TRAF6蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，促炎因子IL-1β、TNF-α水平顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖5、表7。

表7 抑制miR-132-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了PUN對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞損傷的作用

圖5 抑制miR-132-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)PUN對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞凋亡的作用

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，研究表明血管平滑肌細(xì)胞過(guò)度凋亡、炎癥反應(yīng)可能是引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的重要原因[10]。目前臨床主要采用降膽固醇或降血壓、抗炎等藥物治療動(dòng)脈粥樣硬化，既往研究顯示部分藥物可通過(guò)抑制血管炎癥及血管平滑肌細(xì)胞凋亡從而抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生及發(fā)展，但副作用較大[11]。因而尋找安全且副作用較小的中草藥提取物具有重要意義。

PUN具有抗氧化、抗癌、抗炎等功能，可有效緩解腫瘤、炎癥相關(guān)性疾病等多種疾病發(fā)生及發(fā)展[12]。研究表明PUN可通過(guò)抗氧化作用減輕腦缺血再灌注損傷[13]。相關(guān)報(bào)道指出PUN可通過(guò)降低心肌氧化應(yīng)激、減少心肌細(xì)胞凋亡從而減輕心肌缺血再灌注損傷[14]。但PUN對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞損傷的影響尚未可知。本研究結(jié)果顯示oxLDL處理后促炎因子IL-1β、TNF-α水平顯著升高，與相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)論相似[15]。提示成功建立oxLDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞動(dòng)脈粥樣硬化模型。不同濃度的PUN處理后細(xì)胞中促炎因子IL-1β、TNF-α水平顯著降低，且呈劑量依賴(lài)性。提示PUN可減輕oxLDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)。血管平滑肌細(xì)胞異常凋亡可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展，研究表明Bcl-2是抑制細(xì)胞凋亡基因，Bax是促凋亡基因，Bcl-2表達(dá)水平升高、Bax表達(dá)水平降低則細(xì)胞凋亡被抑制[16-17]。本研究結(jié)果顯示，oxLDL處理后細(xì)胞凋亡率顯著升高，而PUN處理后細(xì)胞凋亡率顯著降低，隨著PUN使用劑量的增加而顯著降低，進(jìn)一步研究顯示oxLDL可降低細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)Bax的表達(dá)，而PUN處理后細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)水平顯著升高，Bax的表達(dá)水平顯著降低，且隨著PUN使用劑量的增加而明顯變化，提示PUN可減弱動(dòng)脈粥樣硬化模型中人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞凋亡。

miR-132-5p在急性心肌梗死患者血漿中表達(dá)下調(diào)，并可作為急性心肌梗死早期診斷的生物標(biāo)志物[18]。研究表明TRAF6激活后可誘導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α等炎癥因子而引發(fā)動(dòng)脈壁炎癥反應(yīng)從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生及發(fā)展[19]。相關(guān)報(bào)道指出抑制TRAF6的表達(dá)可能通過(guò)抑制TLR4信號(hào)通路而抑制炎癥因子的釋放從而抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[20]。本研究通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)與Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-132-5p可靶向結(jié)合TRAF6，并可負(fù)向調(diào)控TRAF6的表達(dá)，進(jìn)一步研究顯示miR-132-5p過(guò)表達(dá)可通過(guò)下調(diào)TRAF6的表達(dá)，降低炎癥因子IL-1β、TNF-α水平，抑制oxLDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞凋亡，還可促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)，而抑制Bax的表達(dá)，提示miR-132-5p過(guò)表達(dá)可通過(guò)靶向TRAF6減弱oxLDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞凋亡，抑制炎癥反應(yīng)。同時(shí)本研究進(jìn)一步分析顯示抑制miR-132-5p的表達(dá)后可明顯逆轉(zhuǎn)PUN對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)的抑制作用。提示PUN可能通過(guò)上調(diào)miR-132-5p的表達(dá)及下調(diào)TRAF6的表達(dá)從而改善凋亡標(biāo)記蛋白表達(dá)的異常，抑制促炎因子水平的升高從而減緩動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展進(jìn)程。

綜上所述，PUN可通過(guò)調(diào)控miR-132-5p/TRAF6分子軸而發(fā)揮抗炎及抑制血管平滑肌細(xì)胞凋亡的作用，可為動(dòng)脈粥樣硬化新藥的研發(fā)提供理論依據(jù)。但仍需進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探索PUN對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的影響。