秦玉萍 高迎新 馬熙萌 杜 瑤 王 新 禹 莉

(蚌埠醫(yī)學(xué)院腫瘤基礎(chǔ)研究與臨床檢驗診斷重點實驗室，蚌埠 233030)

流行病學(xué)資料顯示，胃癌是危害人類健康最常見的惡性腫瘤之一[1-2]。我國胃癌發(fā)病率一直呈上升和年輕化趨勢，死亡率高，預(yù)后差，確診后5年生存率僅為20%～30%[3]。胃癌惡性侵襲和轉(zhuǎn)移是造成其預(yù)后不良的主要原因。在以手術(shù)為主，以放化療為輔的傳統(tǒng)方式治療胃癌預(yù)后效果不佳的情況下，明確胃癌發(fā)病機(jī)制，控制胃癌的侵襲及轉(zhuǎn)移十分重要。

失巢凋亡能使正常細(xì)胞在增殖、分化和凋亡過程中保持動態(tài)平衡，而失巢凋亡抵抗是惡性細(xì)胞的一個特征，在腫瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用[4]。研究表明，在腫瘤細(xì)胞對凋亡抵抗的過程中，涉及多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。如磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路不僅調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖與活化，還影響腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移、細(xì)胞外基質(zhì)的降解以及腫瘤血管生成等[5-6]。最近研究表明PI3K/Akt信號通路與胃癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[7]。這一信號通路的激活可能是腫瘤細(xì)胞抵抗失巢凋亡的主要機(jī)制之一[6]。哌立福新是一種合成的烷基磷脂化合物，是Akt的特異性抑制劑[8-9]。在復(fù)發(fā)或者難治性多發(fā)性骨髓瘤中已行Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗，并取得較好效果，準(zhǔn)備進(jìn)入第Ⅲ期臨床試驗，哌立福新治療侵襲性結(jié)直腸癌、復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤也已進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗階段[10-13]。因此哌立福新在研究PI3K/Akt信號通路在腫瘤中的作用有重要意義。

特異AT序列結(jié)合蛋白1(special AT-rich sequence-binding protein 1，SATB1)通過影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)組織，與多種轉(zhuǎn)錄共激活子和共同抑制因子的相互作用，影響腫瘤生物學(xué)行為。并且與腫瘤生長、轉(zhuǎn)移以及臨床病理特征如TNM分期增加、腫瘤分化減少和總生存期縮短相關(guān)，因此SATB1的表達(dá)被確定為各種癌癥的獨立預(yù)后標(biāo)志物[14]。此外，基因敲除或異位過度表達(dá)策略已證實SATB1可影響細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡、細(xì)胞形態(tài)/細(xì)胞極性、EMT、多藥耐藥性以及腫瘤的形成、生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[15]。

既然PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化及SATB1基因表達(dá)的上調(diào)在腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中扮演著重要的角色，而失巢凋亡抵抗又與腫瘤細(xì)胞的存活和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。那么，胃癌細(xì)胞的存活和轉(zhuǎn)移是否也與上述分子事件有關(guān)聯(lián)？發(fā)生了失巢凋亡抵抗的胃癌細(xì)胞，其生物學(xué)行為特性是否隨之發(fā)生改變？抑制PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路及干擾SATB1基因的表達(dá)對胃癌細(xì)胞抗失巢凋亡能力又有什么影響？本研究建立了胃癌AGS失巢凋亡抵抗細(xì)胞模型，檢測哌立福新對其PI3K/Akt信號通路活性及細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，從分子生物學(xué)水平檢測靶向抑制劑對胃癌失巢凋亡抵抗細(xì)胞關(guān)鍵信號分子的作用，從而為抗腫瘤靶向藥物的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 人胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS購自上海細(xì)胞庫；RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自上海貝博生物科技公司；胰酶細(xì)胞消化液、二喹啉甲酸BCA蛋白濃度測定試劑盒、結(jié)晶紫染色液、RIPA裂解液購自碧云天生物技術(shù)公司；基質(zhì)膠(Matrigel)、Transwell小室購自美國Corning公司；Poly-HEMA購自美國Sigma公司；哌立福新購自上海一基實業(yè)有限公司；Akt、p-Akt、PTEN、MMP-2、SATB1、Vimentin、Slug、E-cadherin、β-actin購自美國CST公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔 IgG購自美國Abclonal公司；PVDF膜、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Millipore公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS培養(yǎng)于含10%FBS和1%青霉素/鏈霉素新鮮的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基中，在37℃和5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)期。取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.2.2超低黏附培養(yǎng)板制備 將1.2 g poly-HEMA溶解于無水乙醇中，60℃加熱振蕩過夜，制備成120 mg/ml Poly-HEMA貯存溶液，臨用前，用無水乙醇按1∶9 稀釋成12 mg/ml的工作液。6孔板每孔加入1 ml工作液鋪板，待其干燥充分凝固后，追加0.5 ml溶液重新包被，制備成超低黏附培養(yǎng)板。用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，紫外線消毒，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用前紫外線再次照射1 h。

1.2.3胃癌細(xì)胞失巢凋亡培養(yǎng) 用0.25%胰蛋白酶消化收集對數(shù)生長期AGS細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，平分到Poly-HEMA包被處理的6孔培養(yǎng)板中。將6孔板置于搖床上，37℃，5% CO2環(huán)境中孵育。隔日換液，換液方法：將細(xì)胞用吸管移入離心管中，500 r/min，離心5 min，棄上清，加新鮮RPMI1640培養(yǎng)基重懸，將細(xì)胞懸液加入6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。以上方法懸浮培養(yǎng)AGS細(xì)胞10 d，模擬胃癌細(xì)胞脫離周圍細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)的狀態(tài)。收集到15 ml 的離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入新鮮培養(yǎng)基重懸，將細(xì)胞懸液置于普通培養(yǎng)瓶中重貼壁培養(yǎng)3 d，待長成單層，即可誘導(dǎo)獲得胃癌失巢凋亡抵抗AGS細(xì)胞，而用于誘導(dǎo)的細(xì)胞稱為胃癌親本細(xì)胞。胃癌失巢凋亡抵抗細(xì)胞重貼壁培養(yǎng)后換液、傳代方法與親本AGS細(xì)胞相同。為保證誘導(dǎo)獲得的胃癌失巢凋亡抵抗細(xì)胞在生物學(xué)特性方面的穩(wěn)定性，每項實驗開始前2周就開始誘導(dǎo)，獲得胃癌失巢凋亡抵抗細(xì)胞后就進(jìn)行相關(guān)實驗，避免胃癌失巢凋亡抵抗細(xì)胞多次傳代。

1.2.4MTT法檢測細(xì)胞增殖能力 在96孔板中以4×103個/孔接種200 μl胃癌失巢凋亡抵抗AGS細(xì)胞懸液。37℃，5%CO2濃度培養(yǎng)24 h，分別加入0、1、2、3、4、5 μmol/L哌立福新作用24 h，空白對照組(只添加培養(yǎng)基)。用20 μl MTT(5 mg/ml)孵育 4 h，丟棄培養(yǎng)基，每孔加入200 μl二甲基亞砜，避光振蕩10 min，待藍(lán)紫色結(jié)晶充分溶解后，酶標(biāo)儀讀取吸光度值。每組實驗重復(fù)3次，每次設(shè)5個平行孔。

1.2.5細(xì)胞克隆形成實驗 將胃癌親本AGS細(xì)胞和失巢凋亡抵抗AGS 細(xì)胞以1 000個/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，隔日觀察細(xì)胞生長情況，定時換液。出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)胞時，棄去培養(yǎng)液，PBS洗3遍，4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞30 min。結(jié)晶紫染20 min。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞集落，計克隆形成數(shù)目。

1.2.6Annexin-V/PI染色法檢測細(xì)胞凋亡 收集細(xì)胞，用冷PBS洗滌2次，用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒中的結(jié)合緩沖液300 μl重新懸浮細(xì)胞，靜置5～10 min。然后與Annexin V-FITC室溫下避光孵育15 min，與PI在4℃避光靜置 10 min，流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率。每組樣本各設(shè) 3 個復(fù)孔。

1.2.7Wright-Giemsa染色 失巢凋亡抵抗AGS細(xì)胞接種于6孔板中孵育 24 h，然后用哌立福新處理24 h，取出蓋玻片晾干。Wright-Giemsa染色法對細(xì)胞進(jìn)行染色，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.2.8細(xì)胞劃痕實驗 將失巢凋亡抵抗AGS細(xì)胞鋪于6孔板中培養(yǎng) 24 h 后，用移液槍10 μl槍頭在培養(yǎng)板中劃直線，PBS洗滌3遍，將滑落的細(xì)胞洗掉，處理細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)20 h，PBS洗滌去除懸浮細(xì)胞，分別于0 h和20 h在10倍倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.9Transwell小室法檢測細(xì)胞遷移和侵襲 侵襲實驗與遷移實驗方法類似，區(qū)別僅是侵襲實驗前用Matrigel基質(zhì)膠包被Transwell小室上層。用無血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為3×105個/ml，取100 μl接種于上室，下室加入含10% FBS的完全培養(yǎng)基600 μl，然后將Transwell小室放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出小室，棉簽擦去上層未穿過小室膜的細(xì)胞，4%多聚甲醛溶液固定，結(jié)晶紫染色，PBS清洗2～3次，風(fēng)干后置于倒置顯微鏡下拍照采圖，隨機(jī)選取5個視野，計數(shù)穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)量，反映細(xì)胞遷移和侵襲能力。

1.2.10qRT-PCR檢測 按說明書用TRIzol試劑從細(xì)胞中提取總RNA，用PrimeScript RT試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。qRT-PCR采用SYBR Primix EX TaqTMⅡ試劑盒檢測，反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件參考說明書進(jìn)行操作。靶基因和β-actin的引物序列見表1。用2-ΔΔCt計算相對表達(dá)量。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

1.2.11Western blot檢測蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，用含1%蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，提取總蛋白，使用BCA 法進(jìn)行蛋白定量，10% SDS-PAGE 凝膠電泳使蛋白分離，將蛋白轉(zhuǎn)至 PVDF膜上，5% 脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗4℃孵育過夜，TBST 洗膜 3遍，每次洗滌10 min，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，TBST 洗膜 3遍，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、Bio-Rad公司凝膠成像儀顯影，Imagelab圖像分析軟件測定條帶灰度值，β-actin為內(nèi)參，分析蛋白質(zhì)的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1胃癌失巢凋亡抵抗細(xì)胞模型的建立 在倒置相差顯微鏡下觀察到，貼壁培養(yǎng)的人胃癌AGS細(xì)胞接種入培養(yǎng)板時，最初為單個分散細(xì)胞，呈小圓形。培養(yǎng)48 h～72 h后，細(xì)胞單層生長，排列整齊，胞體飽滿呈多邊形，大小均一(圖1A)；當(dāng)AGS細(xì)胞接種超低黏附培養(yǎng)板進(jìn)行懸浮培養(yǎng)時，最初亦為呈小圓形的單個分散細(xì)胞(圖1B)，其貼壁狀態(tài)明顯變差，生長緩慢，細(xì)胞邊緣不整，隨著時間推移，細(xì)胞逐漸聚集成簇，細(xì)胞簇在一段時間內(nèi)不斷增大，48 h 后可見細(xì)胞逐漸成團(tuán)(圖1C)，隨后形成大而松散的珊瑚狀細(xì)胞團(tuán)(圖1D)。懸浮培養(yǎng)10 d后，收集細(xì)胞接種于普通培養(yǎng)板中重貼壁培養(yǎng)，細(xì)胞形態(tài)，由原來親本細(xì)胞貼壁生長時排列整齊、形狀規(guī)則的多邊形變成有較多突起、排列紊亂的不規(guī)則多角形(圖1E)，但多次傳代后，細(xì)胞形態(tài)逐漸恢復(fù)正常(圖1F)。重貼壁細(xì)胞即為胃癌失巢凋亡抵抗AGS細(xì)胞。

圖1 倒置相差顯微鏡下觀察人胃癌AGS細(xì)胞在不同培養(yǎng)方式下的形態(tài)學(xué)變化

2.2失巢凋亡抵抗抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移，上調(diào)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因 克隆形成實驗結(jié)果顯示，失巢凋亡抵抗AGS細(xì)胞較親本細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)(圖2A)。Annexin V/PI染色顯示細(xì)胞凋亡減少(圖2B)。Transwell和細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果顯示，與親代細(xì)胞相比，失巢凋亡抵抗AGS細(xì)胞侵襲和遷移能力增強(qiáng)(圖2C～D)。Western blot結(jié)果顯示，失巢凋亡抵抗AGS細(xì)胞中p-Akt、MMP-2和SATB1的表達(dá)上調(diào)，PTEN的表達(dá)較親代細(xì)胞下調(diào)，而兩者的Akt無顯著差異(圖2E)。

圖2 失巢凋亡抵抗抑制胃癌AGS細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移

2.3哌立福新抑制凋亡抵抗AGS細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡 MTT法檢測細(xì)胞活力，結(jié)果顯示，當(dāng)?shù)蛲龅挚笰GS細(xì)胞暴露于不同濃度的哌立福新時，細(xì)胞生長呈濃度依賴性抑制作用，細(xì)胞活力呈逐漸下降趨勢(圖3A)。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組的凋亡率隨著濃度的增加而顯著升高(P<0.05，圖3B)。Wright-Giemsa染色結(jié)果顯示：對照組AGS細(xì)胞胞漿清晰，顆粒少，細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密，排列規(guī)則，懸浮細(xì)胞稀少，細(xì)胞增殖能力強(qiáng)。哌立福新組隨著濃度的增加，細(xì)胞增殖減慢，培養(yǎng)基中漂浮細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，黏附能力減弱。并且細(xì)胞逐漸變圓，碎片逐漸增多，細(xì)胞中的顆粒越來越多(圖3C)。

圖3 哌立福新抑制凋亡抵抗AGS細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡

2.4哌立福新抑制凋亡抵抗AGS細(xì)胞侵襲、遷移能力 Transwell和細(xì)胞劃痕實驗表明：與0 μmol/L組相比，哌立福新組穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)量減少(圖4A)，劃痕閉合率明顯降低(圖4B)(P<0.05或P<0.01)。哌立福新能明顯抑制凋亡抵抗AGS細(xì)胞的侵襲和遷移能力。

圖4 哌立福新抑制凋亡抵抗AGS細(xì)胞侵襲、遷移能力

2.5哌立福新對凋亡抵抗AGS細(xì)胞PIK3CA、AKT和PTEN基因表達(dá)的影響 qRT-PCR檢測結(jié)果顯示：與0 μmol/L組相比，凋亡抵抗 AGS細(xì)胞中PIK3CA mRNA、Akt mRNA的表達(dá)隨著哌立福新濃度的增加而降低，PTEN mRNA表達(dá)在3 μmol/L哌立福新時顯著增加(圖5)。

圖5 qRT-PCR基因表達(dá)的相對定量分析

2.6哌立福新對凋亡抵抗AGS細(xì)胞Akt、p-Akt、PTEN、MMP-2和STAB1蛋白表達(dá)的影響 Western blot檢測凋亡抵抗AGS細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與對照組相比，p-Akt、MMP-2、STAB1蛋白表達(dá)顯著降低，PTEN表達(dá)顯著增加，Akt表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)意義(圖6)。

圖6 哌立福新對失巢凋亡抵抗AGS細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

2.7下調(diào)SATB1增強(qiáng)哌立福新介導(dǎo)的腫瘤抑制效應(yīng) 為進(jìn)一步研究SATB1在哌立福新介導(dǎo)的抗腫瘤效應(yīng)中的作用，通過SATB1 siRNA轉(zhuǎn)染凋亡抵抗AGS細(xì)胞，Western blot檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后SATB1表達(dá)明顯下調(diào)(圖7A)，MTT數(shù)據(jù)分析表明，siRNA干擾SATB1表達(dá)能抑制凋亡抵抗AGS細(xì)胞的增殖，而且下調(diào)SATB1能增強(qiáng)哌立福新介導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制(圖7B)。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，下調(diào)SATB1能誘導(dǎo)凋亡抵抗AGS細(xì)胞的凋亡，而且能增強(qiáng)哌立福新誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(圖7C)。Transwell結(jié)果表明，下調(diào)SATB1能抑制凋亡抵抗AGS細(xì)胞的侵襲及遷移，而且能使哌立福新抑制細(xì)胞侵襲及遷移的作用增強(qiáng)(圖8)。表明SATB1在哌立福新對凋亡抵抗AGS細(xì)胞的抗腫瘤活性中起著關(guān)鍵作用。

圖7 下調(diào)SATB1增強(qiáng)哌立福新介導(dǎo)的腫瘤抑制效應(yīng)

圖8 下調(diào)SATB1使哌立福新抑制細(xì)胞侵襲及遷移的作用增強(qiáng)

3 討論

細(xì)胞外基質(zhì)是細(xì)胞生長和分化的基膜，當(dāng)正常細(xì)胞脫離細(xì)胞粘附的細(xì)胞外基質(zhì)，便失去與其他細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)之間的聯(lián)結(jié)，通常會引發(fā)細(xì)胞凋亡，又稱為失巢凋亡，這是一種程序化細(xì)胞死亡形式，使調(diào)節(jié)細(xì)胞與基質(zhì)之間正常細(xì)胞存活的信號被中斷，失巢凋亡能使正常細(xì)胞在增殖、分化與凋亡中保持動態(tài)平衡，從而能確保細(xì)胞和組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，其在機(jī)體正常發(fā)育、保持組織自身平衡、疾病的發(fā)病機(jī)制和腫瘤的轉(zhuǎn)移中起著重要作用[16-17]。然而，許多腫瘤細(xì)胞由于獲得失巢凋亡抵抗能力，可以在非錨定依賴條件下生存和生長，也就是說這些細(xì)胞在脫離原發(fā)腫瘤灶并通過血管或淋巴管侵入或遷移到遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位時，可以在缺乏黏附的情況下存活[18-20]。腫瘤細(xì)胞具有抵抗失巢凋亡、侵襲和遷移能力強(qiáng)的特點，也是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要原因之一[21]。研究表明，胃癌的發(fā)生發(fā)展與失巢凋亡抵抗密切相關(guān)[22-25]。然而，確切的發(fā)病機(jī)制仍不清楚。

在以往的研究中，懸浮培養(yǎng)貼壁細(xì)胞通常用于建立失巢凋亡抵抗細(xì)胞模型[19-20]。課題組超低黏附培養(yǎng)板上懸浮培養(yǎng)胃癌AGS細(xì)胞一段時間后，再貼壁培養(yǎng)，存活下來的細(xì)胞被認(rèn)為是凋亡抵抗細(xì)胞。結(jié)果顯示，失巢凋亡抵抗AGS細(xì)胞比親代細(xì)胞生長更快，凋亡率更低。Transwell實驗和劃痕實驗均表明凋亡抵抗AGS細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲和遷移能力。

近年來針對癌轉(zhuǎn)移治療的主要方法是分子靶向治療。因此，識別新的靶分子對于提高胃癌治療的臨床療效具有重要意義。許多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及相關(guān)基因與腫瘤的抗失巢凋亡和轉(zhuǎn)移過程有關(guān)。研究表明PI3K-Akt信號通路在上皮性卵巢癌、胃腸道癌、非小細(xì)胞肺癌、肝細(xì)胞癌等多種腫瘤中都有明顯的激活作用[26-29]。PI3K-Akt信號通路的激活可影響多種與腫瘤細(xì)胞生存和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)，抑制多種刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞生存和增殖，參與腫瘤血管生成、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[30-31]。與以上報道一致，本次研究表明凋亡抵抗AGS細(xì)胞中PIK3CA、p-Akt、SATB1和MMP-2的表達(dá)增加。證實了PI3K/Akt通路的激活或過度表達(dá)可能促進(jìn)胃癌細(xì)胞對失巢凋亡的抵抗?；罨腁kt與AGS細(xì)胞對失巢凋亡的抵抗有關(guān)，并影響SATB1和MMP-2基因的表達(dá)，促進(jìn)了AGS細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能。從而獲得對失巢凋亡的抵抗會導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的重塑和PI3K/Akt通路成分的過度表達(dá)。因此，PI3K/Akt通路與AGS細(xì)胞的抗凋亡能力和胃癌的轉(zhuǎn)移潛能有關(guān)。

有研究表明PTEN在多種腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲中起著重要的調(diào)節(jié)作用。PTEN的丟失在許多腫瘤中很常見。因此，PTEN被認(rèn)為是一種癌癥抑制因子[32]。PTEN是一種兼有脂質(zhì)磷酸酶活性和蛋白質(zhì)磷酸酶活性的雙特異性磷酸酶。通過將磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(PIP3)轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)，對PI3K/Akt信號傳導(dǎo)活性具有負(fù)調(diào)控作用，能拮抗PI3K活性[33]。研究表明PTEN在凋亡抵抗AGS細(xì)胞中的表達(dá)減少，而PIK3CA的表達(dá)增加，這可能與凋亡抵抗AGS細(xì)胞的增殖和侵襲有關(guān)。

哌立福新是一種新合成的烷基磷脂類化合物，它作為PI3K/Akt途徑的抑制劑，具有抗腫瘤作用，Akt是哌立福新作用的重要細(xì)胞靶點[34]。Akt是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和存活的胞質(zhì)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。在生理狀態(tài)下，Akt存在于低活性的細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)受到各種因素刺激時，Akt被磷酸化并被PI3K激活[35]?；罨疉kt可促進(jìn)細(xì)胞存活、增殖、轉(zhuǎn)移和血管生成。研究表明，Akt在許多人類腫瘤中被過度激活，如胃腸道腫瘤、胰腺癌和其他腫瘤組織。Akt在腫瘤細(xì)胞中的激活與腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡密切相關(guān)。Akt磷酸化可被特異性抑制劑哌立福新抑制[36-37]。因此，抑制信號通路已成為腫瘤治療的靶點之一。

哌立福新在研究PI3K/Akt信號通路在腫瘤中的作用，具有重要意義。在多種腫瘤中，哌立福新在體內(nèi)外實驗中均顯示出顯著的增殖抑制活性，并準(zhǔn)備進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗。研究表明，哌立福新和MEK/ERK抑制劑MEK-162或ABT-737 聯(lián)合治療能誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞生長抑制和凋亡增加，體內(nèi)實驗?zāi)苊黠@抑制肺癌的異種移植生長[38-39]。其在膀胱癌、肝癌、急性髓系白血病等腫瘤治療中也發(fā)揮著重要作用[40-42]。本課題組研究表明，在凋亡抵抗AGS細(xì)胞中，哌立福新可能有助于抑制生長和誘導(dǎo)較高的凋亡率。此外，Transwell和劃痕實驗一致顯示，哌立福新抑制了細(xì)胞的侵襲和遷移能力。凋亡抵抗細(xì)胞PIK3CA和Akt的mRNA表達(dá)降低，PTEN的表達(dá)增加。p-Akt、MMP-2和STAB1的蛋白表達(dá)隨哌立福新濃度的增加而減少，PTEN的表達(dá)增加。哌立福新通過PI3K/Akt途徑影響AGS細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，具有抗癌作用，是治療胃癌的一種潛在途徑。

基因敲除或異位過度表達(dá)策略已證實SATB1可影響細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡、細(xì)胞形態(tài)/細(xì)胞極性、EMT和多藥耐藥性，以及腫瘤的形成、生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，SATB1參與PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)，可以與PI3KC亞型基因的MARs序列結(jié)合，從而抑制PI3KC的轉(zhuǎn)錄[43]。Akt蛋白激酶使SATB1在絲氨酸47上磷酸化并保護(hù)SATB1防止其凋亡裂解[44]。本課題組研究表明，下調(diào)SATB1能增強(qiáng)哌立福新介導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制，促進(jìn)凋亡抵抗AGS細(xì)胞的凋亡，使哌立福新抑制細(xì)胞侵襲及遷移的作用增強(qiáng)，表明SATB1在哌立福新對凋亡抵抗AGS細(xì)胞的抗腫瘤活性中起著關(guān)鍵作用。

綜上所述，哌立福新能不同程度地作用于凋亡抵抗AGS細(xì)胞，調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路的關(guān)鍵信號分子，降低細(xì)胞增殖率，增加細(xì)胞凋亡率。哌立福新抑制細(xì)胞侵襲和遷移能力。然而，本研究的一個局限性是，僅使用AGS細(xì)胞株可能不能反映所有胃癌。使用其他細(xì)胞系的研究可能是必要的，以增加研究的概括性。