王艷婕 曹 威 周彥生 楊 瑞 牛新清

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，新鄉(xiāng) 453003)

化療是治療白血病的有效方法，但仍有許多白血病患者不能完全緩解或緩解后復(fù)發(fā)。白血病患者復(fù)發(fā)的主要原因是抗癌藥物不能完全消除所有的白血病細(xì)胞。細(xì)胞在治療期間或治療后留在患者體內(nèi)的情況被稱為微小殘留病變(minimal residual disease,MRD)，這些細(xì)胞通常是白血病干細(xì)胞(leukemia stem cells,LSCs)。LSCs的細(xì)胞表面標(biāo)記表型為CD34+/CD38-，與造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells,HSCs)具有相同的特性，且難以消除。許多研究證明LSCs在化療誘導(dǎo)后對化療藥物的耐受性較正常的白血病細(xì)胞更強(qiáng)，因此更容易導(dǎo)致患者復(fù)發(fā)[1-2]。臨床上高劑量阿糖胞苷、米托蒽酮、氯丙嗪、氟達(dá)拉濱等藥物聯(lián)合使用用于單純復(fù)發(fā)治療，這種再誘導(dǎo)減少了腫瘤的爆發(fā)，但不能長期維持[3]?，F(xiàn)代細(xì)胞治療已廣泛應(yīng)用在許多血液病惡性腫瘤中，特別是復(fù)發(fā)或難治性的血液病。供體淋巴細(xì)胞輸注或二次造血干細(xì)胞移植是一種標(biāo)準(zhǔn)的再誘導(dǎo)后免疫治療，但一直沒有取得較好效果[4]。NK細(xì)胞是先天免疫應(yīng)答的重要組成部分，能夠殺傷腫瘤和病毒感染細(xì)胞，因此體外活化NK細(xì)胞輸注已經(jīng)成為一種有希望的骨髓治療方法。

ATO作為砷劑的主要成分，是治療急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)的有效藥物。大量文獻(xiàn)證明，ATO是一個(gè)多靶點(diǎn)、多通路的抗腫瘤藥物，其治療白血病的機(jī)制與誘導(dǎo)細(xì)胞分化、凋亡有關(guān)，具有有效的抗腫瘤作用[5]。故本研究探討聯(lián)合低濃度的三氧化二砷(arsenic trioxide,ATO)與NK細(xì)胞，對急性髓系白血病KG1a細(xì)胞株細(xì)胞增殖的影響及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 人類急性髓系白血病 KG1a 細(xì)胞株為本實(shí)驗(yàn)室留存細(xì)胞。ATO購自哈爾濱伊達(dá)藥業(yè)有限公司。LDH殺傷活性檢測試劑盒購自Promega公司。RPMI1640為Gibco公司產(chǎn)品。胎牛血清購自杭州四季青生物公司?？?MICA/B單抗、抗ULBP1單抗、抗ULBP2單抗、抗ULBP3單抗購自R&D公司。甲基纖維素、XTT、硫酸酚嗪甲脂(PMS)為Sigma公司產(chǎn)品。淋巴細(xì)胞分離液為上海試劑二廠產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) KG1a 細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、1%青鏈霉素)，37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h細(xì)胞定期換液，取生長狀態(tài)良好的生長對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2XTT檢測不同濃度ATO 對KG1a細(xì)胞24 h、48 h的細(xì)胞生長抑制作用 選取生長狀態(tài)良好的對數(shù)期KG1a細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度5.0×104個(gè)/ml，96孔板每孔接種80 μl，加入不同終濃度為0、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μmol/L的ATO，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24、48 h后，每孔加入XTT(終濃度0.2 mg/ml)及PMS(終濃度25 μmol/ml)混合液20 μl，避光孵育2 h后，酶標(biāo)儀雙波長450 nm、630 nm檢測OD值，每組吸光度取3孔均值,計(jì)算不同ATO濃度下的KG1a細(xì)胞生長抑制率。細(xì)胞生長抑制率=(OD對照組-OD加藥組)/OD對照組×100%。

1.2.3LDH檢測試劑盒檢測定NK細(xì)胞對ATO作用前后KG1a細(xì)胞的殺傷作用 3組實(shí)驗(yàn)組分別檢測NK細(xì)胞對ATO處理前、后KG1a細(xì)胞的殺傷作用以及NKG2D單克隆抗體預(yù)處理后的NK細(xì)胞對ATO處理后KG1a細(xì)胞的殺傷作用。實(shí)驗(yàn)前抽取健康志愿者外周血，在無菌條件下淋巴細(xì)胞分離液梯度密度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，PBS洗滌后用免疫磁珠分選NK細(xì)胞[6]。NKG2D阻滯實(shí)驗(yàn)中將免疫磁珠分選出的NK細(xì)胞與抗NKG2D 抗體(10 μg/ml)37℃共孵育30 min，然后加入到靶細(xì)胞中。細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)按照LDH檢測試劑盒操作說明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，靶細(xì)胞分別是工作濃度為IC30的ATO 作用前后的KG1a細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞分別為NKG2D單克隆抗體預(yù)處理前后的NK細(xì)胞，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組依次按照效靶比5∶1、10∶1、20∶1 加入 96 孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37℃、5%CO2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，容積糾正組及靶細(xì)胞最大裂解釋放組均加入10 μl裂解液繼續(xù)孵育，1 h后吸取上清轉(zhuǎn)到另外一個(gè)96孔板，加顯色混合液常溫避光反應(yīng)30 min，酶標(biāo)儀檢測波長490 nm的吸光度值。計(jì)算NK細(xì)胞殺傷率：NK細(xì)胞殺傷率(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD平均值-靶細(xì)胞自然裂解釋放組OD 平均值-效應(yīng)細(xì)胞自然裂解釋放組OD平均值)/(靶細(xì)胞最大裂解釋放組OD平均值-靶細(xì)胞自然裂解釋放組OD平均值)×100%。

1.2.4甲基纖維素集落形成實(shí)驗(yàn)檢測不同實(shí)驗(yàn)組集落數(shù)量 實(shí)驗(yàn)設(shè)置單純對照組和3組實(shí)驗(yàn)組。對照組為生長狀態(tài)良好的KG1a細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組分別是：ATO作用24 h后的KG1a細(xì)胞組、NK細(xì)胞與ATO作用24 h后的KG1a細(xì)胞組、NKG2D單克隆抗體預(yù)處理后的NK細(xì)胞與ATO作用24 h后的KG1a細(xì)胞組。ATO作用KG1a細(xì)胞24 h后用PBS清洗細(xì)胞3次，按照效靶比20∶1于含有20%的胎牛血清、0.9 %的甲基纖維素的克隆體系中培養(yǎng)14 d，觀察集落形成，計(jì)數(shù)集落數(shù)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測ATO作用前后KG1a細(xì)胞表面NKG2D 配體表達(dá) 該實(shí)驗(yàn)分兩組，實(shí)驗(yàn)組為生長狀態(tài)良好的KG1a細(xì)胞，對照組為2.0 mol/L的ATO處理24 h后的KG1a細(xì)胞。收集細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml，100 μl待標(biāo)記細(xì)胞與ABMO-1、M295、M310 和M551 一抗4 ℃避光孵育30 min，PBS洗滌2遍后細(xì)胞重懸，加熒光素標(biāo)記的山羊抗鼠IgG1二抗，4℃條件下孵育30 min，陰性對照為同型IgG1 抗體。流式細(xì)胞儀分析1×104個(gè)細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)量并計(jì)算其百分率。為減少誤差，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1ATO對KG1a細(xì)胞生長抑制作用 分別用0、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μmol/L濃度的ATO處理KG1a細(xì)胞24 h、48 h，結(jié)果顯示ATO對KG1a 細(xì)胞具有明顯的殺傷作用，其細(xì)胞生長抑制率在一定濃度范圍內(nèi)呈明顯的時(shí)間濃度依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。根據(jù)SPSS23.0軟件計(jì)算ATO抑制30%KG1a細(xì)胞24 h的濃度,即IC30值為2.0 μmol/L。選取該濃度作為與 NK細(xì)胞聯(lián)合殺傷KG1a細(xì)胞的后續(xù)工作濃度。見圖1。

圖1 ATO對KG1a 細(xì)胞增殖抑制作用

2.2NK細(xì)胞對ATO 作用前后KG1a細(xì)胞的殺傷率 效靶比分別為5∶1、10∶1、20∶1 時(shí)，單純對照組，NK細(xì)胞對ATO 作用前的KG1a細(xì)胞的殺傷率分別為(1.74±0.91)%、(2.49±0.87)%、(7.05±2.41)%；實(shí)驗(yàn)組1，NKG2D單克隆抗體預(yù)處理后的NK細(xì)胞對工作濃度為2.0 μmol/L的ATO作用后的KG1a細(xì)胞的殺傷率分別為(1.86±0.94)%、(2.56±0.88)%、(7.19±2.54)%；實(shí)驗(yàn)組2，NK 細(xì)胞對2.0 μmol/L的ATO作用后的KG1a細(xì)胞的殺傷率分別為(4.95±0.65)%、(7.32±1.12)%、(19.87±1.87)%。結(jié)果顯示，NK 細(xì)胞對 ATO 作用前后的KG1a 細(xì)胞殺傷率之間的差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),NKG2D單克隆抗體預(yù)處理前后的NK 細(xì)胞對ATO作用后的KG1a 細(xì)胞殺傷率之間的差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這提示NK細(xì)胞對ATO作用后的KG1a 細(xì)胞殺傷作用明顯，且與NKG2D配體表達(dá)密切相關(guān)。見圖2。

圖2 NK細(xì)胞對ATO作用前后KG1a細(xì)胞的殺傷敏感性

2.3ATO單用及聯(lián)合NKG2D單克隆抗體預(yù)處理前后NK細(xì)胞對KG1a細(xì)胞集落形成的影響 不同處理組于甲基纖維素集落系中培養(yǎng)KG1a細(xì)胞14 d后用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞集落形成。結(jié)果顯示，組1：對照組KG1a集落數(shù)174.3±8.6，組2：ATO 處理組集落數(shù)為112.5±5.1，組3：ATO處理24 h后與NK細(xì)胞聯(lián)用組集落數(shù)48.6±7.2，組4：ATO處理24 h后與NKG2D單克隆抗體預(yù)處理后NK細(xì)胞聯(lián)用組集落數(shù)為108.5±4.9。組間兩兩比較，組1與組2、組2與組3、組3與組4組間集落數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 組間集落數(shù)比較

2.4ATO作用前后對KG1a細(xì)胞 NKG2D 配體表達(dá)的作用 單純對照組與實(shí)驗(yàn)組(2.0 μmol/L的LATO處理KG1a細(xì)胞24 h后)KG1a細(xì)胞表面NKG2D 配體MICA/B、ULBP2、ULBP的表達(dá)未見明顯改變;而實(shí)驗(yàn)組ATO處理KG1a細(xì)胞24 h后KG1a細(xì)胞表面NKG2D 配體ULBP1 表達(dá)增高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1，圖4、5。

表1 ATO作用KG1a細(xì)胞24 h前后KG1a細(xì)胞NKG2D配體表達(dá)率

圖4 ATO作用前KG1a細(xì)胞的MICA/B、ULBPI-3表達(dá)

圖5 ATO作用24 h后KG1a細(xì)胞的MICA/B、ULBPI-3表達(dá)

3 討論

目前，白血病主要的治療方法包括化療、放療、細(xì)胞免疫治療以及這些方法的結(jié)合。傳統(tǒng)中藥及其成分也顯示出較強(qiáng)的抗腫瘤作用。如果能更廣泛地探索這些藥物在癌癥治療中的作用機(jī)制，其將有可能用于臨床靶向治療。因此，探索其分子機(jī)制對化療治療具有極其重要的意義。

NK細(xì)胞作為先天免疫應(yīng)答的一部分，可以通過一系列受體來識別和殺傷病理細(xì)胞。這些受體可分為活化受體和抑制受體兩大類。其中活化受體主要包括C型凝集素受體(NKG2D/E/F)、天然細(xì)胞毒性受體(NKp46、NKp30和NKp44)和活化殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(KIRs-aKIRs)；抑制受體主要包括抑制殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(KIRS-ikKIRs)和C型凝集素受體(如NKG2A/B)[7-9]。這些受體之間的良好平衡對調(diào)節(jié)NK細(xì)胞功能至關(guān)重要，抑制受體通過SHP-1和SHP-2磷酸酶使得激活性受體(DAP10、DAP12)去磷酸化，進(jìn)而直接抑制受體的激活[10-11]。報(bào)道顯示KG1a細(xì)胞主要為具有LSCs特性的CD34+/CD38-細(xì)胞，LSC的數(shù)量超過50%，本課題組先前的研究也表明KG1a細(xì)胞具有LSCs的特征，包括分化、增殖和自我更新[12]。NKG2DLs(MICA/B、ULBP2、ULBP3)的表達(dá)缺失可能是一種普遍的LSC標(biāo)志物，利用這種功能特性逃避NK細(xì)胞免疫監(jiān)視的能力[13-15]。

本研究結(jié)果表明ATO對 KG1a 細(xì)胞的增殖抑制作用與時(shí)間濃度呈正相關(guān)，考慮到臨床用藥的可能性，選擇ATO作用濃度IC30用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合低濃度的ATO 與NK細(xì)胞能有效抑制 KG1a 細(xì)胞的增殖，降低KG1a 細(xì)胞的集落形成能力，且效果好于單用ATO組和ATO聯(lián)合NKG2D單克隆抗體預(yù)處理NK細(xì)胞組。這證明ATO可提高NK細(xì)胞殺傷KG1a細(xì)胞的能力，且與KG1a細(xì)胞表面NKG2D配體表達(dá)密切相關(guān)。我們接下來檢測ATO對 KG1a 細(xì)胞作用前后細(xì)胞表面NKG2D配體表達(dá)的變化，流式細(xì)胞檢測發(fā)現(xiàn)KG1a細(xì)胞表面NKG2D 配體MICA/B、ULBP2、ULBP3的平均熒光強(qiáng)度(MFI)在ATO作用前后未見明顯改變，而ULBP1 表達(dá)在ATO處理后明顯增高(P<0.05)。綜上所述，NK細(xì)胞對ATO處理后的KG1a細(xì)胞具有明顯殺傷作用，聯(lián)合ATO降低了 KG1a 細(xì)胞集落形成能力。這與低濃度的ATO誘導(dǎo)KG1a細(xì)胞表面NKG2D配體ULBP1的表達(dá)密切相關(guān)，深層次的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究探討。