王漢,龐士龍,趙曉宇

天津市寧河區(qū)醫(yī)院骨科(天津 301500)

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)作為一種常見、漸進(jìn)性的膝骨關(guān)節(jié)退行性慢性病，臨床表現(xiàn)主要為慢性疼痛和關(guān)節(jié)活動(dòng)障礙，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]。KOA在50歲以上人群發(fā)病率高，全世界范圍內(nèi)發(fā)病率高達(dá)3.8%[2]，且女性發(fā)病率偏高[3]。KOA發(fā)病機(jī)制尚不明確，環(huán)境、遺傳、機(jī)械等多種因素可共同參與膝蓋軟骨病變的生物過程。人體組織的代謝、功能與組織細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡等生物學(xué)行為均與miRNA有著密不可分的關(guān)系，在腫瘤、骨關(guān)節(jié)炎等多種疾病中起著重要作用，因此分析KOA 中miRNAs的表達(dá)情況，對(duì)闡述miRNA在KOA軟骨退變過程中作用、探索軟骨退變的發(fā)生、發(fā)展、調(diào)控機(jī)制具有重要意義。miRNA被報(bào)道作為一種調(diào)控基因，影響骨關(guān)節(jié)炎的病理發(fā)展過程[4]，在骨關(guān)節(jié)炎的早期診斷及治療上有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，miR-9-5p可以破壞骨細(xì)胞的增殖和分化，改變細(xì)胞黏附，與軟骨損傷有關(guān)[5]。Ge等[6]研究發(fā)現(xiàn)miR-125b-5p可以通過調(diào)控 SYVN1 誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞凋亡，然而miR-9-5p、miR-125b-5p是否與KOA發(fā)生、發(fā)展有關(guān)尚不清楚，因此本研究通過檢測miR-9-5p、miR-125b-5p在 KOA 患者軟骨和健康軟骨中的表達(dá)水平，探討其與KOA之間的關(guān)系及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年1月至2019年1月在本院骨科就診KOA患者124例為KOA組，其中男50例，女74例，年齡 57～78歲，平均(69.15±4.26)歲。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《骨關(guān)節(jié)炎診治指南(2007年版)》[7]；(2)疼痛VAS評(píng)分≥4分；(3)3個(gè)月內(nèi)未接受其他KOA相關(guān)治療。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)長期服用相關(guān)藥物者；(2)因其他疾病累及膝關(guān)節(jié)者；(3)合并有肝腎功能異常的嚴(yán)重感染性疾病者；(4)風(fēng)濕系列陽性以及妊娠和哺乳期婦女。

根據(jù)改良的ManKin[8]關(guān)節(jié)軟骨評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，將KOA組軟骨標(biāo)本(重度退變軟骨、中度退變軟骨、輕度退變軟骨)分為重度組(32例)、中度組(44例)和輕度組(48例)；選取同期因交叉韌帶斷裂、盤狀軟骨損傷等在本院建卡就診的膝關(guān)節(jié)軟骨無病變的患者124例為對(duì)照組(NC組)，其中男52例，女72例，年齡56～77歲，平均(67.95±4.79)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)病理學(xué)診斷膝關(guān)節(jié)無病變；排除標(biāo)準(zhǔn)同KOA組排除標(biāo)準(zhǔn)。兩組間性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

本研究經(jīng)本院道德倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，所有樣品采集均取得患者及家屬知情同意并簽字，符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》。

1.2 主要試劑與儀器 RNA提取試劑盒(貨號(hào)：DP443)，購自北京天根生化有限公司；AceQ qPCR SYBR?Green Mix(貨號(hào)：Q221-01)，購自南京vazyme生物公司；引物由上海生工生物公司設(shè)計(jì)合成；qRT-PCR儀(型號(hào)：CFX96)，購自美國Bio-Rad公司；白細(xì)胞介素-1(interleukin-1，IL-1) ELISA試劑盒(貨號(hào)：A099472-48T)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6) ELISA(貨號(hào)：K215741)、腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α，TNF-α) ELISA(貨號(hào)：K219238)、白細(xì)胞介素-8 (interleukin-8，IL-8)ELISA試劑盒(貨號(hào)：A100081-48T)、軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(cartilage oligom eric matrix protein，COMP) ELISA試劑盒(貨號(hào)：A097701-48T)購自上海扶生實(shí)業(yè)有限公司，基質(zhì)金屬蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-13，MMP-13) ELISA試劑盒購自美國Abcam公司，ELX800型全自動(dòng)酶標(biāo)儀購自美國Bio-Tek公司。

1.3 方法

1.3.1 組織來源及樣品制備 (1)組織來源：分別收集在本院因KOA行關(guān)節(jié)置換術(shù)或關(guān)節(jié)鏡清理手術(shù)患者的軟骨組織和因交叉韌帶斷裂、盤狀軟骨損傷等行手術(shù)治療患者自愿捐贈(zèng)的健康軟骨標(biāo)本。(2)軟骨組織RNA樣品制備：在凍存軟骨組織中加入Trizol 液勻漿，PBS 緩沖液洗滌；加入1 mL Trizol 裂解液，離心后取上層水相，加入等體積異丙醇，離心，棄上清，沉淀干燥后用 DEPC 水溶解得到RNA原液。Nano-Drop 2000測量記錄RNA濃度。其余樣品-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 熒光定量PCR檢測miR-9-5p、miR-125b-5p表達(dá)水平 采用RNA提取試劑盒提取血清總RNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA。采用定量PCR儀對(duì)miR-9-5p、miR-125b-5p進(jìn)行擴(kuò)增。qRT-PCR反應(yīng)體系共10 μL：miScript SYBR?Green Mix 5 μL，cDNA(50 ng/μL)1 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，ddH2O 3.0 μL。反應(yīng)條件：95℃，90 s；95℃，30 s；63℃，30 s；72℃，15 s；40個(gè)循環(huán)。miR-9-5p、miR-125b-5p及內(nèi)參U6的引物序列見表1。采用2-ΔΔCT法對(duì)血清miR-9-5p、miR-125b-5p表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 酶聯(lián)免疫法測定軟骨組織中IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、MMP-13、COMP水平 采用酶聯(lián)免疫法測定軟骨中各炎癥因子的的表達(dá)水平，檢測操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。為控制檢測質(zhì)量，本次研究所有樣品的檢測均由檢驗(yàn)科同一批人員在同臺(tái)儀器上操作，每個(gè)樣本均設(shè)3次重復(fù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用例(%)表示，行2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，行t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。各組數(shù)據(jù)均以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KOA組、NC組軟骨中miR-9-5p、miR-125b-5p表達(dá)水平比較 相對(duì)于NC組，KOA組患者軟骨中miR-9-5p表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)，miR-125b-5p表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)，見表2。

表2 KOA組、NC組軟骨中miR-9-5p、miR-125b-5p表達(dá)水平比較

2.2 KOA患者重度、中度、輕度組軟骨中miR-9-5p、miR-125b-5p表達(dá)水平比較 相對(duì)于輕度組，重度組、中度組miR-9-5p表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);相對(duì)于中度組，重度組miR-9-5p表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。相對(duì)于輕度組，重度組、中度組miR-125b-5p表達(dá)水平顯著上升(P<0.05)；相對(duì)于中度組，重度組miR-125b-5p表達(dá)水平顯著上升(P<0.05)，見表3。

表3 KOA患者重度、中度、輕度組軟骨中miR-9-5p、miR-125b-5p表達(dá)水平比較

2.3 KOA組、NC組各炎癥因子表達(dá)水平比較 輕度組、中度組、重度組KOA患者軟骨中IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、MMP-13、COMP含量依次升高(P<0.05)，見表4。

表4 KOA組、NC組各炎癥因子表達(dá)水平比較

2.4 KOA患者軟骨組織miR-9-5p、miR-125b-5p表達(dá)水平與各炎癥因子表達(dá)水平相關(guān)性分析 KOA患者軟骨組織miR-9-5p水平與IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、MMP-13、COMP、miR-125b-5p水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)；miR-125b-5p水平與IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、MMP-13、COMP水平呈正相關(guān)(P<0.05)，見表5。

表5 KOA患者軟骨組織miR-9-5p、miR-125b-5p表達(dá)與各炎癥因子表達(dá)水平相關(guān)性

3 討論

關(guān)節(jié)軟骨由軟骨基質(zhì)和軟骨細(xì)胞構(gòu)成，在KOA病程中最早出現(xiàn)病理變化。軟骨細(xì)胞是成熟軟骨中與修復(fù)破壞軟骨有關(guān)的細(xì)胞類型。有研究發(fā)現(xiàn)KOA患者膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞明顯減少[9]，可能與膝關(guān)節(jié)中發(fā)生的炎癥反應(yīng)有關(guān)。針對(duì)其發(fā)病機(jī)制對(duì)KOA進(jìn)行預(yù)防及早期診斷、治療非常重要。全身軟骨代謝異常、年齡、體重、遺傳、創(chuàng)傷、局部炎癥反應(yīng)以及自身免疫和局部應(yīng)力等都是 KOA 發(fā)生的相關(guān)因素。研究表明[10]，miRNA在KOA發(fā)生、發(fā)展中有重要作用，miRNA的表達(dá)可調(diào)控軟骨細(xì)胞的反應(yīng)活性和修飾代謝過程，與KOA發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。

研究[5]認(rèn)為，miR-9-5p可通過上調(diào)nemo樣激酶誘導(dǎo)骨骼細(xì)胞凋亡，具有損害骨細(xì)胞增殖分化、改變細(xì)胞黏附和凋亡的作用。Sun等[11]在研究中得出類似結(jié)論，miR-9-5p抑制骨細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化和細(xì)胞黏附。Chen等[12]發(fā)現(xiàn)miR-9-5p在骨關(guān)節(jié)炎小鼠模型中表達(dá)下調(diào)，可通過調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎小鼠的固生蛋白C，促進(jìn)軟骨重塑，抑制軟骨細(xì)胞凋亡，過表達(dá)miR-9-5p可改善小鼠的軟骨重塑。Li等[13]研究證明，過表達(dá)miR-9-5p可促進(jìn)軟骨細(xì)胞中間充質(zhì)干細(xì)胞和高遷移能力的間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移能力。本研究發(fā)現(xiàn)KOA患者軟骨細(xì)胞中miR-9-5p相對(duì)于正常軟骨細(xì)胞，表達(dá)顯著下調(diào)，提示miR-9-5p可能與KOA的發(fā)生有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-9-5p的表達(dá)水平在輕度組、中度組、重度組KOA患者軟骨細(xì)胞中依次下降，說明miR-9-5p在KOA患者軟骨中的表達(dá)水平與患者病情有關(guān)，一定程度上可能反映患者病情嚴(yán)重程度。

徐永明等[14]研究發(fā)現(xiàn)miR-125a-5p與大鼠的終板軟骨退變有密切聯(lián)系。Ge等[6]研究發(fā)現(xiàn)miR-125b-5p在關(guān)節(jié)炎患者滑膜細(xì)胞中表達(dá)量顯著升高，提示miR-125b-5p的表達(dá)與關(guān)節(jié)炎的發(fā)生有關(guān)。與Ge等研究結(jié)果相似，本研究發(fā)現(xiàn)，miR-125b-5p在KOA患者軟骨細(xì)胞中高表達(dá)，說明miR-125b-5p可能與KOA的發(fā)生有關(guān)，并且miR-125b-5p在輕度組、中度組、重度組KOA患者軟骨細(xì)胞中表達(dá)水平依次升高，說明miR-125b-5p的表達(dá)水平與KOA患者的病情有關(guān)。

參與KOA病情發(fā)展的細(xì)胞因子有很多，Rasheed等[15]研究發(fā)現(xiàn)miRNA-125b-5p可通過調(diào)控MMP-13、IL-6等在內(nèi)的炎癥因子表達(dá)，參與KOA過程中炎癥反應(yīng)進(jìn)展。IL-1可通過刺激滑膜細(xì)胞產(chǎn)生膠原酶和酪蛋白酶[16]，刺激軟骨細(xì)胞產(chǎn)生MMP，起到快速促炎癥作用[17]。孫文才等[18]對(duì)KOA患者血清及關(guān)節(jié)液中細(xì)胞因子表達(dá)水平研究發(fā)現(xiàn)，KOA患者血清和關(guān)節(jié)液中細(xì)胞因子TNF-α、IL-1、IL-6水平異常增高。研究顯示[19]，IL-8可通過抑制軟骨基質(zhì)的多種功能活動(dòng)加速膝關(guān)節(jié)炎癥病變。鄧超等[20]研究發(fā)現(xiàn)，接受電針治療后患者疼痛評(píng)分、情緒評(píng)分顯著降低，血清中IL-8含量顯著降低，提示血清IL-8含量的降低可能與KOA病情減輕有關(guān)。TNF-α盡管在骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)組織中檢測水平很低，也是KOA中基質(zhì)退變的一個(gè)重要介質(zhì)，是滑膜炎癥的關(guān)鍵細(xì)胞因子。李洪濤等[21]用研究發(fā)現(xiàn)MMP-13表達(dá)下調(diào)可以抑制炎性因子的釋放、阻止軟骨基質(zhì)的降解，進(jìn)而保護(hù)受損的關(guān)節(jié)軟骨,促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨的結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)，說明MMP-13表達(dá)下調(diào)與KOA患者病情恢復(fù)有關(guān)。COMP是透明軟骨的重要組成成分，主要由軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞分泌，姚麗等[22]研究表明，大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎模型膝關(guān)節(jié)滑膜組織中COMP含量顯著高于對(duì)照組，提示COMP表達(dá)的升高參與誘導(dǎo)軟骨降解，該變化與骨關(guān)節(jié)滑膜組織炎癥有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、MMP-13、COMP在KOA患者軟骨組織中表達(dá)均顯著上升，且在輕度組、中度組、重度組中含量依次增加，提示KOA患者均存在一定程度炎癥反應(yīng)，且隨病情惡化，炎癥程度增加。Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)KOA患者軟骨組織中miR-9-5p水平與miR-125b-5p、IL-1等炎癥指標(biāo)水平呈負(fù)相關(guān)，miR-125b-5p與IL-1等炎癥指標(biāo)水平呈正相關(guān)，說明miR-9-5p、miR-125b-5p可能通過影響KOA患者炎癥反應(yīng)情況，影響KOA患者病情進(jìn)展。

綜上所述，miR-9-5p在KOA患者軟骨中低表達(dá)，miR-125b-5p在KOA患者軟骨中高表達(dá)，兩者可能與KOA疾病發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。本研究的不足之處在于樣本量少，研究范圍局限，因此miR-9-5p、miR-125b-5p在KOA患者軟骨中的表達(dá)和意義的相關(guān)研究還需加大樣本量擴(kuò)大規(guī)模進(jìn)一步深入研究。