王茂彩,李驍,陳姍,陳勍

1中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院婦科(廣東廣州 510065)；2中山大學(xué)孫逸仙紀念醫(yī)院婦產(chǎn)科(廣東廣州 510042)

子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma,EMC)是一種最常見的女性生殖道惡性腫瘤。研究表明，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展與癌基因的激活和抑癌基因的失活有著一定的關(guān)系[1]。粒細胞嗜酸性白血病整合位點1(myeloid ecotropic leukemia integration site-1，Meis1)屬于同源盒(homeodomain box，HOX)基因的三氨基酸環(huán)延伸家族(three amino acid length)，通過與HOX蛋白以及其他轉(zhuǎn)錄因子的相互作用而發(fā)揮其調(diào)節(jié)細胞活性的作用[2]。細胞周期蛋白D3(Cyclin D3)是細胞G1/S期的正性調(diào)控因子，有誘導(dǎo)細胞自主分裂，誘發(fā)癌變的作用，在子宮內(nèi)膜癌、食管鱗癌、卵巢癌等多種癌中過表達[3-4]。既往在白血病相關(guān)研究中表明抑制meis1基因的轉(zhuǎn)錄，降低了Cyclin D3水平，阻止了細胞從G1期到S期的進程，說明Meis1的生長促進活性可能與細胞周期蛋白D-pRb細胞周期控制途徑有關(guān)[5]。本研究擬聯(lián)合檢測Meis1與Cyclin D3在子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中的蛋白表達情況，初步探討在子宮內(nèi)膜癌中的Meis1的表達是否異常，并與Cyclin D3的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2003年1月至2010年12月在中山大學(xué)孫逸仙紀念醫(yī)院婦科住院治療的45例子宮內(nèi)膜癌患者的相關(guān)臨床資料，均因“子宮內(nèi)膜樣腺癌”行根治性或姑息手術(shù)切除子宮。所有患者術(shù)前均未接受化療、放療及任何激素等治療?；颊吣挲g21～74歲，平均(54.0±9.4)歲。其中高分化腺癌19例，中分化腺癌14例，低分化癌12例，病理標本均經(jīng)病理科醫(yī)師復(fù)核確診。并收集12例因其他良性病變切除子宮的患者的正常子宮內(nèi)膜作為對照組。年齡30～49歲，平均(40.8±7.3)歲，無其他系統(tǒng)性疾病，近期未服用任何激素類藥物。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會批準，所有入組患者或其家屬均已簽署書面知情同意書。整理和收集患者的相關(guān)臨床資料信息，如患者年齡、孕產(chǎn)次、放化療史、病理分型等。

1.2 方法

1.2.1 取材的方法 12例正常子宮內(nèi)膜及45例子宮內(nèi)膜癌患者的子宮內(nèi)膜標本均來源于切除的子宮，子宮切除后，將子宮標本進行固定，并送石蠟病理。在病理結(jié)果證實子宮內(nèi)膜腺癌的標本中，進行免疫組化檢查。

1.2.2 免疫組化 采用非生物素二步法免疫組化染色。先用10%甲醛固定的子宮內(nèi)膜標本，石蠟包埋后切片(4 μm)，繼而脫蠟、酒精水化、修復(fù)抗原等；滴加Meis1多克隆抗體(1∶25,ABCAM company)或Cylin D3多克隆抗體(1∶50,奧博森)，予PV-6001(兔IgG抗體-HRP多聚體、中杉金橋)處理，沖洗，脫水、封片。取Cyclin D3及Meis1蛋白表達陽性的子宮內(nèi)膜切片作為陽性對照，采用PBS(中杉金橋)代替一抗作為陰性對照。以腺上皮細胞中出現(xiàn)黃色至棕黃色顆粒為陽性。在光鏡下計數(shù)400個細胞，采用雙評分半定量法進行評價。陽性細胞數(shù)<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分；顯色度評分：細胞核無顯色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。兩項評分相加：0分為陰性(-)，1～2分為低表達(+)，3～4分為中表達(++)，5～6分為高表達(+++)。陽性表達率計算公式為：(中表達例數(shù)+高表達例數(shù))/組例數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件，對于率的比較采用2檢驗，如不符合四格表2檢驗的條件(T>5，且n>40)，應(yīng)用Fihsher確切概率法。采用spearman相關(guān)分析Meis1、Cyclin D3在子宮內(nèi)膜樣腺癌中的陽性表達率之間的關(guān)系。采用Log-rank (Mantel-Cox) 分析Meis1和Cyclin D3表達與子宮內(nèi)膜癌患者生存時間關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 Meis1在不同子宮內(nèi)膜組織中的表達情況 Meis1在正常子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中均可呈現(xiàn)陽性表達，而且主要表達于細胞胞漿中，細胞排列紊亂，細胞核大，細胞核中未見明顯表達，見圖1。

12例正常子宮內(nèi)膜組織中，1例Meis1為中表達，11例為陰性或低表達，陽性表達率為8.3%(1/12)。45例子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中，18例Meis1為陽性表達(13例中表達、5例高表達)，陽性表達率為40%(18/45)，其中，高分化組、中分化組和低分化組中分別有52.6%(10/19)、42.9%(6/14)和16.7%(2/12)呈陽性表達。見圖1，表1。

表1 Meis1在正常子宮內(nèi)膜及子宮內(nèi)膜樣腺癌亞組之間的表達情況 例(%)

2.2 Cyclin D3在正常子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜癌中的陽性表達情況 Cyclin D3子宮內(nèi)膜癌組織中主要在腺癌細胞中呈現(xiàn)陽性表達，位于胞漿中，呈淡黃或棕黃色，細胞排列不整齊，細胞漿腫脹，細胞核大，細胞核中呈陰性表達。見圖2，表2～3。

12例正常子宮內(nèi)膜組織中，4例Cyclin D3為陽性表達(2例為中表達，2例高表達)，陽性表達率為33.3%(4/12)。45例子宮內(nèi)膜樣腺癌患者的組織中，35例呈Cyclin D3陽性表達(24例為中表達，11例高表達)，陽性表達率為77.8%(35/45)。正常子宮內(nèi)膜與子宮內(nèi)膜樣腺癌患者之間的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 Cyclin D3在正常子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜樣腺癌亞組中的表達 例(%)

2.3 Meis1與Cyclin D3在子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中表達的相互關(guān)系 45例子宮內(nèi)膜癌組織中，37.78%(17/45)Cyclin D3與Meis1均同時為陽性表達，Cyclin D3與Meis1均同時為陰性表達的20.00%(9/45)。在子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中，Cyclin D3與Meis1的蛋白表達之間呈正相關(guān)(r=0.327,P<0.05)。見表3。

表3 Meis1與Cyclin D3在子宮內(nèi)膜癌組織中表達的相互關(guān)系 例

2.4 Meis1與Cyclin D3表達與子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后關(guān)系 45例內(nèi)膜組織中，Meis1陽性表達患者(n=18)的平均生存時間為35.33個月，陰性表達患者(n=27)的平均生存時間為50.93個月，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(2=11.22，P=0.000 8) 。Meis1陽性表達和陰性表達患者生存曲線見圖3。45例內(nèi)膜組織中，Cyclin D3陽性表達患者(n=35)的平均生存時間為43.89個月，陰性表達患者(n=27)的平均生存時間為47.5個月，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(2=5.331，P=0.021 0) 。Cyclin D3陽性表達和陰性表達患者生存曲線見圖4。

注：A:Meis1正常子宮內(nèi)膜組織;B:子宮內(nèi)膜腺癌組織(高分化組);C:子宮內(nèi)膜腺癌組織(中分化組);D:子宮內(nèi)膜腺癌組織(低分化組) (免疫組化，×200)

注：A:正常子宮內(nèi)膜組織；B:子宮內(nèi)膜腺癌組織(高分化組) ；C:子宮內(nèi)膜腺癌組織(中分化組)；D:子宮內(nèi)膜腺癌組織(低分化組)

圖3 Meis1陽性表達和陰性表達患者生存曲線

圖4 Cyclin D3陽性表達和陰性表達患者生存曲線

3 討論

子宮內(nèi)膜樣腺癌是子宮內(nèi)膜癌最常見的病理類型，其發(fā)病率逐年升高并有年輕化的趨勢，對女性身體健康和生殖健康造成巨大威脅。子宮內(nèi)膜癌與其他惡性腫瘤一樣，本質(zhì)是細胞生長周期調(diào)節(jié)失控，細胞呈無限制、自主增生和分裂，已知的影響子宮內(nèi)膜癌細胞調(diào)控的相關(guān)基因主要包括PTEN、P27、P53、P16等，但具體機制尚不明確[1]。由于子宮內(nèi)膜癌的早期篩查尚不成熟，分離和鑒定癌基因與抑癌基因?qū)τ谧訉m內(nèi)膜癌的基因研究和早期篩查治療都具有重要的意義。

Meis1基因廣泛表達于多種正常造血組織中，如骨髓造血干細胞(HSCs)[6]，而同源框基因(HOX基因) 是一類控制胚胎發(fā)育和細胞分化的調(diào)節(jié)基因。在白血病中，HOXA9和MEIS1被認為是混合譜系白血病(MLL)融合的最關(guān)鍵目標，它們的共表達可快速誘導(dǎo)急性髓細胞白血病(AML)[7]。但是在前列腺癌研究中，MEIS1-HOXB13轉(zhuǎn)錄調(diào)控抑制前列腺癌增殖和轉(zhuǎn)移[8]。在正常子宮內(nèi)膜中meis1也有表達[9]。本研究觀察到正常子宮內(nèi)膜中meis1在基質(zhì)細胞胞核中的表達強于腺上皮細胞，在腺上皮細胞胞核meis1陽性表達率為8.3%，明顯低于子宮內(nèi)膜樣腺癌組(40%)(P<0.05)。初步說明meis的過表達可能是子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的一個因素。根據(jù)腺癌細胞分化級別進一步比較，雖然組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但是兩兩比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。不排除樣本量較少影響統(tǒng)計分析可能。

Cyclin D3是一種原癌基因，是細胞G1/S期的正調(diào)控因子，其參與并促進細胞自主分裂，誘發(fā)細胞癌變，與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系[10]。臨床研究表明，Cyclin D3在子宮內(nèi)膜癌組織中呈現(xiàn)過表達[11]。本研究中子宮內(nèi)膜腺癌中Cyclin D3的表達高于正常子宮內(nèi)膜(77.8%vs33.3%,P<0.05)。根據(jù)腺癌分化級別分組后兩兩比較，高分化組、中風(fēng)化組與正常子宮內(nèi)膜組、低分化組間陽性表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義。既往研究表明，不同亞型的細胞周期蛋白(cyclin D1[12]、cyclinA[13]、cyclin[14]等)均在子宮內(nèi)膜癌中過表達，我們認為子宮內(nèi)膜樣腺癌細胞的無限增殖不是一種細胞周期蛋白過度表達的結(jié)果，而可能是多種細胞周期蛋白過表達異常的共同結(jié)果。

本研究結(jié)果顯示，Meis1和CyclinD3在子宮內(nèi)膜癌組織中的陽性表達率分別為40%(18/45)和77.8%(35/45)，而且有37.78%(17/45)的患者Cyclin D3與Meis1均同時為陽性表達，20%(9/45)的患者均同時為陰性表達。兩者經(jīng)配對2檢驗提示存在正相關(guān)(2=16.564，P<0.05)。進一步分析顯示，Meis1和Cyclin D3陽性表達患者的平均生存時間明顯低于陰性表達組患者，提示Meis1和Cyclin D3陽性表達的子宮內(nèi)膜癌患者生存時間短，預(yù)后較差。既往白血病研究中，通過抑制meis1基因轉(zhuǎn)錄，可降低Cyclin D3水平，說明Meis1的生長促進活性可能通過調(diào)控與細胞周期蛋白D-pRb細胞周期有關(guān)[5]。Meis1可能通過促進cyclinD3的表達來共同參與子宮內(nèi)膜樣腺癌的增殖。