何琪富，王宇飛，張 康，康 健，張 涌*，權(quán)富生*

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100； 2. 農(nóng)業(yè)部動物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，楊凌 712100；3. 陜西省動物胚胎工程技術(shù)研究中心，楊凌 712100)

性別控制對畜牧業(yè)生產(chǎn)有著重大意義，畜牧生產(chǎn)中很多重要的經(jīng)濟(jì)性狀都與性別有關(guān)，如肉、蛋、乳、毛、茸等都需要特定性別的動物進(jìn)行生產(chǎn)[1-2]。奶山羊以產(chǎn)奶為主，通過X、Y精子分離以后配種可提高母羊所占比例，加快母羊群體的擴(kuò)繁，提高奶山羊飼養(yǎng)經(jīng)濟(jì)效益，在生產(chǎn)中具有重要意義[2]。X、Y精子分離是性別控制技術(shù)最常用的手段，而對于精子分離，無論是新方法的建立，還是原有方法的優(yōu)化都離不開性控精液純度的評價[3-4]。

國內(nèi)外科研人員對 X、Y精子之間的差異進(jìn)行了研究，包括X、Y精子質(zhì)量大小不同、所帶電荷不同、所含DNA含量差異以及所包含受體種類不同，利用這些差異來分離不同染色體的精子[5-9]。目前，公開報道的精液分離方法有沉降法、密度梯度離心法、電泳法、流式細(xì)胞分離法、H-Y抗原抗體結(jié)合法等[3,10-11]，但是除了確認(rèn)X、Y精子的DNA含量具有差異之外，其他方面的差異尚難以進(jìn)行準(zhǔn)確的量化區(qū)分，導(dǎo)致對分離的精液純度存在爭議[12-13]。分析分離精液中X、Y精子純度的常用方法有實(shí)時熒光定量PCR法和分選型流式細(xì)胞儀重分析法[3, 14-17]。Parati等[14]以及侯勝奎等[15]以牛X和Y染色體特異基因PLP與SRY為靶基因，分別建立了可以計算精液中X和Y精子數(shù)量和純度的實(shí)時熒光定量PCR探針法，以及可以評估性控精液純度的實(shí)時熒光定量PCR染料法。流式細(xì)胞儀重分析法是當(dāng)前公認(rèn)的最佳評價精液分離純度的方法[16-17]，奶山羊X精子DNA含量比Y精子DNA含量多4.2%，理論上可以用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分選及純度分析[3]，但是目前關(guān)于奶山羊精液的X、Y精子分選體系還不完善，沒有一套成熟的分選參數(shù)系統(tǒng)可供參考，鑒于設(shè)備昂貴且需要專業(yè)人員操作，只有少數(shù)單位配置，無法滿足一般科研院所的試驗(yàn)需求[2]。因此迫切需要建立可以準(zhǔn)確、迅速、簡便地對分離的性控精液純度進(jìn)行檢測的技術(shù)方法，以滿足性控精液新方法的研究和技術(shù)創(chuàng)新。

本研究的目的是建立一種可以計算奶山羊性控精液X和Y精子數(shù)量和比例的real-time PCR定量方法，有助于評價不同X和Y精子分離方法的效果，開發(fā)簡化的、成本較低的、有利于生產(chǎn)應(yīng)用的技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑及儀器

奶山羊商品化性控精液購自內(nèi)蒙古賽科星生物技術(shù)有限公司，由本試驗(yàn)室保存；DNA Marker、DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒提取試劑盒、PMD19-T克隆載體等購自TaKaRa公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒購自Axygen公司。紫外分光光度計Cary50Probe (Vatian，美國)；凝膠成像系統(tǒng)Doc2000(Bio-Rad，美國)；高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf，德國)；實(shí)時熒光定量儀(Thermal Cycler CFX96 Real-Time System，美國)。

1.2 引物設(shè)計

對GenBank中奶山羊X、Y染色體序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，利用DNAMAN引物設(shè)計軟件設(shè)計引物，針對X染色體選擇特異基因F9設(shè)計檢測引物，探針5′端用HEX發(fā)光基團(tuán)，3′端用TAMRA淬滅基團(tuán)；針對 Y染色體選擇特異基因ZFY設(shè)計檢測引物，探針5′端用FAM發(fā)光基團(tuán)，3′端用BHQ淬滅基團(tuán)，引物序列見表1，由生工生物工程有限公司合成。

表1 real-time PCR檢測方法的引物信息Table 1 Primers information for real-time PCR assay

1.3 商品化性控精液核酸提取

將購買的商品化性控精液從凍存管中取出，加入10倍體積的生理鹽水進(jìn)行稀釋混勻，4 000×g離心10 min棄上清，利用TIANGEN有限公司的快速DNA提取檢測試劑盒(KG203)提取精液DNA，保存于-20 ℃。

1.4 F9、ZFY基因陽性標(biāo)準(zhǔn)品制備

以X、Y精子基因組DNA為模板，分別用設(shè)計的檢測引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，將與目的片段大小相近的條帶進(jìn)行膠回收，克隆轉(zhuǎn)化并送生工生物工程有限公司測序。測序正確的陽性質(zhì)粒分別作為F9、ZFY基因的陽性標(biāo)準(zhǔn)品，利用核酸蛋白檢測儀測定其濃度，利用公式：(6.02 × 1023copies·mol-1) × (陽性標(biāo)準(zhǔn)品核酸濃度，g·mL-1) / (陽性標(biāo)準(zhǔn)品平均分子量MW，g·mol-1) = copies·mL-1，換算成拷貝數(shù)。

1.5 熒光定量PCR反應(yīng)體系及條件的優(yōu)化

qPCR反應(yīng)體系為20 μL：F9、ZFY基因的陽性標(biāo)準(zhǔn)品各1 μL，對應(yīng)的上、下游引物各0.5 μL，探針各0.5 μL，預(yù)混酶10 μL，ddH2O 5 μL。qPCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)置：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)擴(kuò)增。用方陣法對引物、探針濃度、退火溫度(58～62 ℃)及循環(huán)次數(shù)等反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.6 熒光定量PCR方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將已知拷貝數(shù)的F9、ZFY基因的陽性標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行10倍連續(xù)梯度稀釋，進(jìn)行熒光定量 PCR，同時設(shè)置陰性對照，以起始模板濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以循環(huán)中的Ct值為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 熒光定量PCR方法特異性評價

對已知純度的商品化X、Y性控精液進(jìn)行雙重TaqMan熒光定量 PCR檢測，同時設(shè)置陰性對照，驗(yàn)證該方法的特異性。

1.8 熒光定量PCR方法敏感性評價

以10倍連續(xù)梯度稀釋的F9、ZFY基因的陽性標(biāo)準(zhǔn)品(1×101～1×1010)作為模板，同時設(shè)置陰性對照，進(jìn)行雙重 TaqMan 熒光定量 PCR擴(kuò)增，每個濃度做3個重復(fù)，確定檢測方法的敏感性。

1.9 熒光定量PCR方法穩(wěn)定性評價

對不同稀釋度(1×102、1×104、1×106)的F9、ZFY基因的陽性標(biāo)準(zhǔn)品混合物(相同稀釋度混合)進(jìn)行雙重TaqMan熒光定量 PCR檢測，3次重復(fù)，用以評價方法的組內(nèi)重復(fù)性；將上述不同稀釋度的陽性標(biāo)準(zhǔn)品混合物在3 d 后進(jìn)行雙重TaqMan熒光定量 PCR檢測， 3次重復(fù)，用以評價方法的組間重復(fù)性。

1.10 熒光定量PCR方法準(zhǔn)確性評價

利用本試驗(yàn)建立的雙重TaqMan熒光定量 PCR方法對60支已知純度的商品化性控精液進(jìn)行分析(X、Y精液各30管)，3次重復(fù)試驗(yàn)，計算X、Y精子數(shù)量以及比例，與所注明純度進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)(利用SPSS統(tǒng)計分析軟件)，評估方法的準(zhǔn)確性。

2 結(jié) 果

2.1 熒光定量PCR引物的特異性

用設(shè)計的兩對引物分別以奶山羊精液DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖1)，凝膠電泳出現(xiàn)單一條帶且大小與預(yù)期結(jié)果相符，產(chǎn)物回收后連接轉(zhuǎn)化測序，證明擴(kuò)增的ZFY和F9基因片段長度分別為66 和100 bp，與GenBank中ZFY和F9基因片段的相似性為100%，為Y染色體ZFY基因和X染色體F9基因的特異序列。

M. DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～3. ZFY基因擴(kuò)增條帶66 bp；4～6. F9基因擴(kuò)增條帶100 bpM. DNA Marker 500; 1-3. ZFY gene amplified band 66 bp; 4-6. F9 gene amplified band 100 bp圖1 引物擴(kuò)增片段電泳鑒定Fig.1 Gel electrophoresis identification of amplified fragments by specific primers

2.2 熒光定量PCR反應(yīng)體系及條件的優(yōu)化

將表1中的上、下游引物和探針采用矩陣法優(yōu)化后，再優(yōu)化Tm值，篩選最佳的雙重TaqMan熒光定量 PCR反應(yīng)體系及條件。優(yōu)化的20 μL反應(yīng)體系：F9、ZFY基因的陽性標(biāo)準(zhǔn)品各1 μL，相應(yīng)的上下游引物各0.5 μL，探針各0.4 μL，預(yù)混酶10 μL，ddH2O 補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s， 58 ℃ 30 s，40個循環(huán)擴(kuò)增。

2.3 熒光定量PCR方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

紫外分光光度計測得F9、ZFY基因的陽性標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為140和150 ng·μL-1，換算成拷貝數(shù)分別為4.7×1010和5.1×1010copies·μL-1。參照上述優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，檢測F9基因陽性標(biāo)準(zhǔn)品濃度在4.7×101～4.7×109copies·μL-1之間，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(圖2A)，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-3.206 8x+39.843，決定系數(shù)R2值為0.993 2，擴(kuò)增效率為105%；檢測ZFY基因陽性標(biāo)準(zhǔn)品濃度在5.1×101～5.1×109copies·μL-1之間，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(圖2B)，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-3.124 5x+40.056，決定系數(shù)R2值為0.996 7，擴(kuò)增效率為108%。說明檢測X和Y精子的方法線性關(guān)系良好、擴(kuò)增效率高。

A. F9基因標(biāo)準(zhǔn)曲線；B.ZFY基因標(biāo)準(zhǔn)曲線A. The standard curve of F9 gene; B. The standard curve of ZFY gene圖2 real-time PCR方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of real-time PCR method

2.4 熒光定量PCR方法的特異性

用所建立的雙重TaqMan熒光定量 PCR方法對已知純度的商品化X(純度為95.0%)和Y精液(純度為92.0%)進(jìn)行DNA檢測。結(jié)果顯示，在X精液DNA檢測中出現(xiàn)兩條擴(kuò)增曲線，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算F9和ZFY基因的拷貝數(shù)，F(xiàn)9與ZFY基因所占比例分別為94.8%和5.2%(圖3A)，F(xiàn)9基因所占比例與X精子純度極接近；在Y精液DNA檢測中出現(xiàn)兩條擴(kuò)增曲線，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算F9和ZFY基因的拷貝數(shù)，F(xiàn)9與ZFY基因所占比例分別為5.1%和94.9%(圖3B)，ZFY基因所占比例與Y精子純度極接近，由此可以看出，兩對引物只特異性擴(kuò)增了F9和ZFY基因，證明該方法具有良好的特異性。

A.檢測X精子的特異性；B. 檢測Y精子的特異性A. The specificity of detection of X sperm; B. The specificity of detection of Y sperm圖3 real-time PCR方法的特異性Fig.3 The specificity of real-time PCR method

2.5 熒光定量PCR方法的敏感性

將F9、ZFY基因的陽性標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng) 10 倍梯度稀釋，每個稀釋度取 1 μL 混勻作為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。根據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算，F(xiàn)9和ZFY基因的最小檢出量分別為47和 51 copies·μL-1(圖4A、4B)，證明該方法敏感性高。

A. 檢測F9基因的敏感性：1～10. 4.7×109～4.7×100copies·μL-1；B. 檢測ZFY基因的敏感性：1～10. 5.1×109～5.1×100 copies·μL-1；N. 陰性對照A. The sensitivity of F9 gene: 1-10. 4.7×109-4.7×100copies·μL-1; B. The sensitivity of ZFY gene： 1-10. 5.1×109-5.1×100copies·μL-1; N. Negative control圖4 real-time PCR方法的敏感性Fig.4 The sensitivity of real-time PCR method

2.6 熒光定量PCR方法的穩(wěn)定性

所建立的雙重TaqMan熒光定量 PCR方法的批內(nèi)變異系數(shù)CV為0.48%～1.94%，批間變異系數(shù)為0.52%～2.34%(表2)，表明該方法具有良好的穩(wěn)定性。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)Table 2 Crossing test of the experimental results

2.7 熒光定量PCR方法的準(zhǔn)確性

利用本試驗(yàn)所建立的雙重TaqMan熒光定量 PCR方法對商品化的X和Y精液純度進(jìn)行分析，每個樣本重復(fù)3次，將試驗(yàn)測得精液純度與購買的商品化性控精液標(biāo)簽注明純度利用SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析，所得P值均大于0.05，表明無顯著差異(表3)，證明本試驗(yàn)建立的檢測方法結(jié)果可靠。

表3 準(zhǔn)確性試驗(yàn)Table 3 Significance test of the accuracy results

3 討 論

目前，在自然狀態(tài)下的奶山羊養(yǎng)殖中，雄性羔羊的價值遠(yuǎn)小于雌性羔羊[2, 18]。按照常規(guī)的生產(chǎn)方式，繁殖得到后代雌、雄比例各占50%，過多公羊的養(yǎng)殖會增加生產(chǎn)成本，降低飼養(yǎng)奶山羊的經(jīng)濟(jì)效益[19-20]。近年來，我國奶山羊養(yǎng)殖業(yè)得到快速發(fā)展，陜西省將奶山羊產(chǎn)業(yè)列為千億元農(nóng)業(yè)工程產(chǎn)業(yè)，繁殖母羊和產(chǎn)奶母羊的需求量大增，奶山羊數(shù)量不足，阻礙了該產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[7, 21-23]，快速增加奶山羊母羊的數(shù)量和比例，對于奶山羊產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展具有重要意義。

為達(dá)到人為控制繁殖母畜后代的性別比例的目的，研究者們開發(fā)了較多分離X、Y精子的技術(shù)方法，如沉降法、密度梯度離心法、電泳法、流式細(xì)胞分離法、H-Y抗原抗體結(jié)合法等[3,10-11]，但是在生產(chǎn)中除了流式細(xì)胞分離技術(shù)外均未被廣泛應(yīng)用。目前，除了確認(rèn)X、Y精子的DNA含量具有差異之外，其他方面的差異難以進(jìn)行準(zhǔn)確的量化區(qū)分，致使對分離的X、Y精子純度存在爭議[12-13]。目前，精子分離純度的鑒定方法主要有實(shí)時熒光定量PCR方法和分選型流式細(xì)胞儀重分析法[3, 14-17]。Parati等[14]利用牛X和Y染色體特異基因PLP與SRY，通過條件優(yōu)化成功建立了可以計算精液中X和Y精子數(shù)量和純度的實(shí)時熒光定量PCR探針法；侯勝奎等[15]選擇牛X、Y染色體特異基因PLP與SRY，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立以及不同質(zhì)粒濃度的樣本對方法進(jìn)行驗(yàn)證，成功建立了可用于評估性控精液純度的實(shí)時熒光定量PCR染料法。流式細(xì)胞儀通過對已經(jīng)分選完成的精子進(jìn)行第二次分選，用來計算其分離純度的方法稱為重分析法，是當(dāng)前公認(rèn)的最佳評價精液分離純度的方法[13]，動物X和Y精子DNA含量差異超過3%就可以進(jìn)行純度分析[3]，奶山羊X精子DNA含量比Y精子DNA含量多4.2%，理論上可以用流式細(xì)胞術(shù)分選，但是目前關(guān)于奶山羊精液的X、Y精子分選體系還不完善，沒有成熟的分選參數(shù)系統(tǒng)可供參考，僅有的研究報道，奶山羊精液分選速度為4 500個·s-1，無法滿足每次輸精劑量在千萬級的輸精要求，且精子活力經(jīng)過染色及分選后均有下降趨勢[2]，鑒于設(shè)備昂貴且需要專業(yè)人員操作，只有少數(shù)單位配置，無法滿足一般科研院所的試驗(yàn)需求。另外，當(dāng)精液量少的情況下，采用流式細(xì)胞技術(shù)方法分離X、Y精子很難實(shí)現(xiàn)，同時對精子的損傷較大。開發(fā)一種新的成本低、對精子損傷小、簡易的Y、Y精子分離方法具有重要的生產(chǎn)應(yīng)用價值。因此建立一種方便且準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室檢測X和Y精子分離純度的方法，為開發(fā)新的性控技術(shù)以及為生產(chǎn)應(yīng)用提供了技術(shù)支撐。

本試驗(yàn)對奶山羊X和Y染色體上F9和ZFY基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，選擇X染色體上特異基因F9和Y染色體上特異基因ZFY的編碼區(qū)設(shè)計了兩對引物[24-25]，分別擴(kuò)增單一條帶，經(jīng)連接轉(zhuǎn)化后測序?yàn)閄染色體F9基因和Y染色體ZFY基因的特異序列，說明設(shè)計的引物特異性好；由于使用的是雙重?zé)晒舛縋CR方法，因此需要采用矩陣法對上、下游引物和探針進(jìn)行優(yōu)化，通過對Tm值和循環(huán)數(shù)的優(yōu)化；通過陽性標(biāo)準(zhǔn)品10倍稀釋建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，證明該方法線性關(guān)系良好、擴(kuò)增效率高[26-28]。因?yàn)槟壳吧唐坊男钥鼐杭兌炔荒苓_(dá)到100%，驗(yàn)證本試驗(yàn)所建立方法的特異性選擇了商品化的已知純度的性控X精子和Y精子進(jìn)行定量分析，測得X精子、Y精子純度與商品化性控精液注明純度極接近[14-15, 29-30]，表明本試驗(yàn)所建立的方法特異性良好；梯度稀釋陽性標(biāo)準(zhǔn)品后進(jìn)行擴(kuò)增，測得該方法對F9和ZFY基因的最小檢出量分別為47 和 51 copies·μL-1，平行試驗(yàn)測得批內(nèi)變異系數(shù)CV<2%，批間變異系數(shù)CV<3%，表明該方法靈敏度高且穩(wěn)定性好；對已知純度的性控精液進(jìn)行純度檢測，3次重復(fù)試驗(yàn)計算結(jié)果與已知純度無顯著性差異(P>0.05)，說明該方法準(zhǔn)確性高，結(jié)果可靠。由此可見，本試驗(yàn)成功建立了一種可以定量計算奶山羊精液中X、Y精子性別比的real-time PCR方法，有助于新的X、Y精子分離方法的開發(fā)，優(yōu)化精子分離技術(shù)，降低奶山羊性別控制的生產(chǎn)成本和準(zhǔn)確性，便于生產(chǎn)應(yīng)用和普及，提高奶山羊的飼養(yǎng)效益，促進(jìn)奶山羊產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展[31]。

4 結(jié) 論

本研究成功建立了基于TaqMan Probe的計算奶山羊精液中X、Y精子數(shù)量的real-time PCR方法，特異性和重復(fù)性好，靈敏度高，結(jié)果可靠，為檢測分離的奶山羊精液X和Y精子純度提供了可靠的方法，為新性控精液方法的開發(fā)提供了有力的技術(shù)支撐。