方 艷，周俊文，關偉軍，蔣 琳，浦亞斌，趙倩君，何曉紅* 馬月輝*

(1.中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193； 2.內蒙古阿拉善盟畜牧研究所，巴彥浩特 750306)

駱駝科動物包含3個屬6種動物，分別為單峰駝、雙峰駝、美洲駝、羊駝、原駝和駱馬，其中，單峰駝和雙峰駝屬于駱駝屬[1]。雙峰駝是我國固有的畜種，主要分布在內蒙古、新疆、青海、甘肅、寧夏等地區(qū)，研究雙峰駝抗逆性的分子機制對探究人類及其他動物的的抗逆性具有重要作用。惡劣的生存環(huán)境使得駱駝在長期的進化過程中形成了耐高溫、耐干旱、耐鹽、耐高血糖的獨特的適應荒漠草原的生物學特征[2-3]。沙漠地區(qū)的水源和植被含鹽量較高，雙峰駝可以利用這些水源和植物，維持正常的生理活動[4]。駱駝為適應沙漠環(huán)境而進化出特殊的生理結構，包括進化出駝峰，儲存大量脂肪，可以調節(jié)體溫，并在缺少食物時提供能量；形成只有瘤胃、網胃和皺胃而沒有瓣胃的獨特的消化系統(tǒng)，以適應沙漠環(huán)境。研究者基于全基因組、轉錄組和宏基因組對雙峰駝沙漠環(huán)境適應性開展了相關研究?；谌蚪M數據的種間分析發(fā)現，雙峰駝在長期進化的過程中形成了獨特的免疫系統(tǒng)，并且具有胰島素抵抗的作用[5]。對駝峰脂肪與皮下脂肪和內臟脂肪進行轉錄組分析，結果顯示，駝峰除了有滲透調節(jié)的作用外，還具有內分泌以及免疫的功能[6]。消化系統(tǒng)對動物能量代謝和水分的吸收以及新陳代謝具有至關重要的作用，前人對雙峰駝結腸組織的轉錄組研究結果顯示，雙峰駝通過減少RNA合成，降低新陳代謝和增強免疫能力以適應缺水和高鹽的環(huán)境[7-8]。對雙峰駝瘤胃微生物的宏基因組學研究顯示，雙峰駝瘤胃微生物種類豐富，且受季節(jié)變化的影響[9]。對羊瘤胃組織的研究表明，反芻動物體內與脂質代謝相關基因表達模式的改變可能與瘤胃合成揮發(fā)性脂肪酸有關[10]。目前，對駱駝適應性研究多針對成年期開展，較少開展胚胎期組織發(fā)育和分化研究，基于瘤胃的轉錄組研究尚未見相關報道。

本試驗選取成年期和胚胎期各3峰阿拉善雙峰駝，對其瘤胃進行組織學以及轉錄組學分析，篩選雙峰駝瘤胃發(fā)育相關的候選基因，從消化的角度探究雙峰駝沙漠適應性的分子機制。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與樣品采集

屠宰3峰10～12歲的健康成年期阿拉善雙峰駝(M1、M2、M3)以及3峰9～10月齡的健康胚胎期阿拉善雙峰駝(T1、T2、T3)，采集此6峰雙峰駝的瘤胃組織樣品各兩份，分別存于RNA-latter和4%多聚甲醛中，用于提取RNA和固定組織以制備石蠟組織切片。

1.2 雙峰駝瘤胃組織石蠟組織切片的制備

快速取瘤胃組織約1 cm3，生理鹽水清洗后放到4%多聚甲醛溶液中固定24 h，然后進行脫水、透明、浸蠟、包埋，修整蠟塊后對蠟塊進行片厚為4 μm的切片后，進行烤片、脫蠟、復水和蘇木素伊紅(hematoxylin eosin，H.E)染色4 min，中性樹脂膠封固，切片鏡檢拍照觀察[11]。

1.3 雙峰駝瘤胃組織RNA-Seq檢測

1.3.1 雙峰駝瘤胃組織總RNA的提取和質量檢測 使用Qiagen公司的組織總RNA提取試劑盒，采集6峰阿拉善雙峰的瘤胃組織于液氮中充分研磨，按照試劑盒說明書提取組織總RNA。使用Agilent 2100 bioanalyzer檢測RNA總量、濃度、完整度(RIN值)及OD值，并控制RNA總量>2 μg，RNA濃度>100 ng·μL-1，RIN值≥7，且28S/18S≥0.7，以用于后續(xù)的測序分析。

1.3.2 雙峰駝瘤胃組織cDNA文庫構建與RNA測序 取1 μg RNA樣品，嚴格按照Illumina?Tru SeqTMRNA樣品制備操作試劑盒說明書進行cDNA文庫的構建。主要過程包括：用oligo dT將mRNA從總RNA中分離富集，使用帶有二價陽離子的片段緩沖液在高溫下使mRNA片段化，cDNA 的合成，銜接測序接頭，片段的純化分離，PCR擴增等[12]。使用Agilent 2100 bioanalyzer檢測cDNA文庫大小和濃度及質量，最終得到cDNA文庫。

嚴格按照TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS試劑盒說明，使用cBot Cluster Generation 系統(tǒng)對含有索引接頭(index-coded)的樣品進行聚類。形成聚類后，在Illumina Hiseq 2000測序平臺上分別對3峰成年期雙峰駝試驗樣品和3峰胚胎期雙峰駝試驗樣品進行讀長為125 bp的雙末端測序，獲得原始測序數據raw reads。

1.3.3 雙峰駝瘤胃組織轉錄組測序原始數據的質控 用NGSQC Toolkit v2.3.3軟件[13]對raw reads進行過濾,去除接頭序列，切割3′末端低質量以及N堿基的序列，以及去除過濾后長度小于25 bp 的reads，質控后最終得到clean reads。

1.3.4 測序數據的比對和轉錄本的組裝 從NCBI網站下載雙峰駝的基因組，版本號為Ca_bactrianus_MBC_1.0，以及基因組注釋文件。使用TopHat v2.0.11軟件[14]將質控后的clean data比對到參考基因組上。用Cufflink軟件[15]進行轉錄本的組裝。使用cuffmerge將組裝后的轉錄本以及參考基因組組成新的注釋文件，使用FPKM(fragments per kilobase of exon model per million mapped reads)值評估轉錄本的表達量。

1.3.5 差異基因的鑒定 用Cufflink軟件的Cuffdiff包對成年期和胚胎期雙峰駝瘤胃組織的差異基因進行鑒定和分析。以胚胎期為對照組，成年期為試驗組，用FDR法進行多重校正，選取同時滿足FPKM值>1，FDR<0.05以及Fold change>2的基因作為顯著差異表達基因。

1.3.6 差異表達基因層次聚類分析 用R軟件中的聚類分析包對上述篩選的成年期和胚胎期雙峰駝瘤胃組織的顯著差異表達基因進行層次聚類，并使用R軟件中的pheatmap包進行熱圖的繪制。

1.3.7 差異表達基因的GO和KEGG富集分析 基因本體論(gene ontology，GO)[16]是基因功能國際分類標準，在生物信息領域廣泛使用，包含細胞成分(cellular component)、分子功能(molecular function)和生物過程(biological process)3個方面。京都基因和基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes)數據庫[17]主要用于富集基因的生物通路分析。使用g：profiler[18]在線網站對差異表達基因進行GO和KEGG富集分析。使用超幾何檢驗方法計算差異表達基因顯著富集的GO條目和KEGG信號通路。校正P-value<0.05時，認為該GO條目或KEGG信號通路為顯著富集。

1.4 差異表達基因實時熒光定量PCR驗證

隨機選取6個差異表達基因，采用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)驗證基因的表達水平。

1.4.1 瘤胃組織RNA的提取與反轉錄 RNA提取方法步驟同“1.3.1”。每個RNA樣品取1 μL使用RT-PCR Kit試劑盒(TaKaRa，大連，中國)反轉錄后得到cDNA。

1.4.2 引物的設計與合成 下載NCBI網站上的基因mRNA序列，選用β-actin作為內參基因，利用NCBI網站中的primer-BLAST在線工具設計引物(表1)。引物由北京天一輝遠生物科技有限公司合成。

表1 本試驗采用的qRT-PCR鑒定引物Table 1 qRT-PCR primers used in this study

1.4.3 RT-qPCR檢測 使用ABI Q7實時熒光定量儀(applied Biosystems，Forest City, CA, SA)進行熒光定量試驗，每個樣品設置3個技術性重復。使用2-△△Ct方法計算基因的相對表達量，使用t檢驗對相對表達量進行分析，若P-value<0.05，則為差異顯著。

2 結 果

2.1 雙峰駝瘤胃組織切片分析

瘤胃組織切片H.E染色結果(圖1)顯示，胚胎期的瘤胃中上皮細胞和肌纖維清晰可見，分布密集，在成年期的瘤胃組織中，可見明顯的肌纖維，肌纖維直徑較寬，肌纖維間的空隙較大。說明與胚胎期相比，瘤胃在成年期有了極大程度的發(fā)育和分化，為適應沙漠的極端環(huán)境提供條件。

A.上皮細胞;B.肌纖維A. Epithelial cells; B. Muscle fiber圖1 瘤胃組織切片(H.E染色 10×)Fig.1 Rumen tissue section(H.E staining 10×)

2.2 雙峰駝瘤胃組織RNA測序原始數據質量檢測分析

通過Illumina Hiseq 2000測序平臺得到各樣品的測序原始數據，如表2所示，每個樣品產生不低于10G的數據量，各樣本的質控率都在90%以上，Q30數據都在88%以上，測得數據的總量和質量都滿足后續(xù)分析的條件。

表2 轉錄組測序數據質量檢測分析Table 2 Transcriptome sequencing data quality inspection and analysis

2.3 參考基因組比對

使用TopHat將質控后的clean data比對到參考基因組，結果如表3所示，在6個雙峰駝瘤胃組織樣品中，有78.90%～86.60%的Reads可以比對到雙峰駝的參考基因組上，滿足后續(xù)分析的質量要求。

表3 轉錄組測序結果比對參考基因組Table 3 Transcriptome sequencing results alignment to reference genome

2.4 差異表達基因篩選及聚類分析

研究共鑒定到24 198個基因，以胚胎期為對照組，以FDR<0.05，Fold Change>2為條件篩選差異表達基因，共篩選到1 207個差異表達基因，其中，注釋的基因1 195個，未知的基因12個，上調基因456個，下調基因751個(圖2)。對篩選出來的成年期雙峰駝瘤胃組織與胚胎期雙峰駝瘤胃組織差異表達基因進行聚類分析，結果表明，M1和M3首先聚到一起，再和M2聚為一類；T2和T3首先聚到一起，再和T1聚為一類(圖3)。說明成年期3個個體(M1、M2、M3)的瘤胃組織差異基因表達模式更接近，胚胎期3個個體(T1、T1、T3)的瘤胃組織差異基因表達模式更接近，進一步證明了轉錄組測序數據的可靠性。

圖2 差異表達基因統(tǒng)計Fig.2 Statistics of differentially expressed genes

圖3 1 207個差異表達基因的聚類結果Fig.3 The clustering results of 1 207 differentially expressed genes

2.5 差異表達基因的GO和KEGG富集分析

使用g:profiler在線軟件對雙峰駝成年期瘤胃組織和胚胎期瘤胃組織上調差異表達基因和下調差異表達基因分別進行GO富集分析以注釋基因功能，以P-value<0.05為篩選顯著富集的條件，上調差異表達基因顯著富集到了62個GO條目，其中包括3個分子功能條目，17個細胞成分條目和42個生物過程條目；下調差異表達基因顯著富集于366個GO條目中，其中包括29個分子功能條目，52個細胞成分條目和285個生物過程條目,上調差異表達基因主要富集在蛋白質結合、生物代謝過程的負調控、細胞多糖代謝過程、葡聚糖生物合成過程等GO條目中(圖4a)，下調差異表達基因主要富集在代謝進程、生物過程的正向調控、生物條件多細胞生物發(fā)展等GO條目中(圖4b)。通過篩選到的這些顯著富集的GO條目可以發(fā)現，雙峰駝成年期和胚胎期瘤胃組織差異表達基因在生物代謝、蛋白質合成以及糖代謝方面發(fā)揮了重要的作用。

使用g:profiler在線軟件對雙峰駝成年期和胚胎期瘤胃組織差異表達基因進行KEGG富集分析，以篩選基因所在的信號通路，以P-value<0.05為篩選顯著富集的條件，共篩選到73條顯著的KEGG信號通路，主要富集在MAPK信號通路、癌癥中的蛋白聚糖信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、胰島素抵抗等通路中(圖4c)，其中，被富集到的主要基因有絲裂原活化蛋白激酶12(mitogen-activated protein kinase 12，MAPK12)、絲裂原活化蛋白激酶12(mitogen-activated protein kinase 13，MAPK13)、轉化生長因子-β3(transforming growth factor beta3，TGF-β3)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP2)、脂肪酸結合蛋白5(fatty acid binding protein 5，FABP5)、過氧化物酶體增殖劑激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor gamma，PPARγ)、鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶1(calcium/calmodulin dependent protein kinase I，CaMK1)等。

a.上調表達基因顯著富集的前20個GO條目；b. 下調表達基因顯著富集的前20個GO條目；c. 差異基因顯著富集的前20個KEGG信號通路a.The top 20 GO terms enriched by upregulated differentially expressed genes; b. The top 20 GO terms enriched by downregulated differentially expressed genes;c. The top 20 KEGG pathways enriched by differentially expressed genes圖4 差異表達基因GO與KEGG富集分析結果Fig.4 Results of GO and KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes

2.6 RT-qPCR驗證

隨機選取6個差異表達基因進行RT-qPCR驗證，結果如圖5所示，6個差異表達基因的RT-qPCR表達模式與RNA測序結果一致，進一步證明了轉錄組測序數據的可靠性。

*.P<0.05；***. P<0.001圖5 6個差異表達基因的RT-qPCR驗證Fig.5 RT-qPCR verification of 6 differentially expressed genes

3 討 論

從組織切片的結果來看，成年期雙峰駝瘤胃組織與胚胎期瘤胃組織差異明顯，與胚胎期相比，瘤胃在成年期有了極大程度的發(fā)育和分化，以往的研究中還尚未見對雙峰駝瘤胃組織的研究，基于此，本研究分別對成年期和胚胎期的瘤胃組織進行了進一步的轉錄組學研究。

本研究以胚胎期為對照組，分別對雙峰駝成年期和胚胎期瘤胃組織上調和下調差異表達基因進行GO富集分析，以識別差異表達基因所在細胞成分、分子功能、生物過程分類。結果顯示，上調差異表達基因顯著富集于代謝過程的負調控、RNA生物合成過程的負調控、核酸模板轉錄的負調控、基因表達的負調控、細胞多糖代謝、葡聚糖生物合成等生物過程中。說明為了適應沙漠極端環(huán)境，雙峰駝瘤胃組織的基因表達、RNA合成等活動減少。之前也有研究表明[6]，在禁水條件下，雙峰駝會通過降低結腸組織的RNA合成來降低新陳代謝，以適應缺水環(huán)境，與本研究結果相似。雙峰駝具有異于其他哺乳動物的血糖耐受能力[19-20]，瘤胃作為消化系統(tǒng)的重要組成部分，對糖的吸收和代謝起到了不可忽視的作用。本研究中，上調差異表達基因顯著富集到細胞多糖代謝過程和葡聚糖生物合成過程，說明成年期的雙峰駝瘤胃組織中糖代謝活動更加豐富，有利于雙峰駝高血糖的耐受。下調差異表達基因顯著富集到多細胞生物發(fā)育、細胞分化、生物過程的積極調控等生物過程，說明在沙漠環(huán)境中，雙峰駝瘤胃組織的生物發(fā)育和細胞分化等活動處于下調趨勢，有助于降低組織的代謝，以適應干燥、缺水的惡劣環(huán)境。

KEGG富集主要是超幾何檢驗方法，計算差異表達基因所富集的信號通路和代謝通路。本研究中，差異表達基因主要顯著富集于糖尿病并發(fā)癥中的MAPK信號通路、AGE-RAGE信號通路、胰島素抵抗、胰島素信號通路、PI3K-Akt信號通路、鈣信號通路、蛋白質消化吸收、醛固酮的合成與分泌通路等。同時，在這些通路中篩選到了MAPK12、MAPK13、FABP5、PPARγ、CaMK1等可能與雙峰駝沙漠適應性相關的基因。

FABP5脂肪酸結合蛋白是一類小的、高度保守的細胞質蛋白，能結合長鏈脂肪酸和其他疏水配體。FABPs可能在脂肪酸攝取、運輸和代謝中發(fā)揮作用。該基因的多態(tài)性與2型糖尿病有關。過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)是被脂肪酸及其衍生物激活的核激素受體[21]。這些相關基因在本研究中顯著上調并被顯著富集到PPAR信號通路(PPAR signaling pathway)中，PPARγ可促進脂肪細胞分化[22]。也有研究表明，MAPKs的下調表達對于脂肪細胞分化起到了很重要的作用[23],本研究中，MAPK13顯著下調，可能也對促進脂肪細胞分化有重要作用，與2014年Jiang等[10]對綿羊瘤胃的研究結果相符。說明雙峰駝的瘤胃對脂肪分化可能也起到了重要作用。

胰島素抵抗是指胰島素靶組織不能對胰島素產生適當反應的情況[24]。胰島素與其受體結合會引起受體自身磷酸化并激活受體酪氨酸激酶，導致胰島素受體底物(insulin receptor substrates，IRSs)的酪氨酸磷酸化, IRS的磷酸化會導致磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)活化，進而導致絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threonine kinase，Akt)及其下游介體AS160活化，這些是胰島素誘導的葡萄糖轉運的重要步驟。如果依賴胰島素的PI3K激活受損，下游的信號轉導也無法進行，進而影響葡萄糖的轉運[25]。現有的研究也表明，雙峰駝能夠維持高于其他哺乳動物的血糖水平且能正常生活，與胰島素抵抗作用有很大關系[26]。同時，脂肪細分化也可以提高血糖攝取，從而達到對高血糖的耐受[10]。雙峰駝可能是以這種方式調節(jié)血糖含量，以達到對血糖的高耐受性。

晚期糖基化終產物(advanced glycation end products, AGEs)是由美拉德反應產生的，是蛋白質的氨基和糖的醛基之間非酶性糖基化反應最終的產物[27-28]。AGEs的主要受體為高級糖基化終產物受體(RAGE或AGER)，已被定義為模式識別受體[29]。AGE/RAGE信號傳導引起涉及NADPH氧化酶、蛋白激酶C和MAPKs的多個細胞內信號途徑的激活，然后導致NF-κB具有活性。NF-κB促進促炎性細胞因子(如IL-1、IL-6和TNF-α)以及多種與動脈粥樣硬化相關基因(包括VCAM-1、組織因子VEGF和RAGE)的表達[30]。另外，其經由RAGE誘導的JAK-STAT介導通路和PI3K-Akt依賴性途徑，參與細胞增殖和凋亡[31]。缺氧介導的Egr-1的誘導激活也需要AGE-RAGE相互作用，與糖代謝具有十分緊密的關系[32]。

研究表明，MAPK信號通路、PPAR信號通路、AGE-RAGE信號通路、PI3K-Akt信號通路均與糖尿病機制有關[31]。本研究中，MAPK信號通路、PPAR信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、PI3K-Akt信號通路都被顯著富集，說明它們可能共同調控了雙峰駝血糖的代謝，使得雙峰駝對血糖的耐受性提高，不易受到高血糖的危害，以適應沙漠惡劣的環(huán)境。

鹽是調控生物體內水分均衡的主要因素。沙漠地區(qū)多為高含鹽量的水源和植被，有研究表明，高鹽飲食會導致鈉鈣交換增加，從而引起血管平滑肌收縮，導致血壓升高[33-34]。雙峰駝由于生存于惡劣的環(huán)境，采食條件受到很大的限制，被迫食用大量含鹽分很高的植物和水源[35]，但是依然能夠維持正常的生理活動，這是區(qū)別于其他哺乳動物非常重要的特點，說明雙峰駝可能具有其獨特的血壓調節(jié)機制。醛固酮吸收鈉和水在調節(jié)全身血壓中起重要作用。血管緊張素(Ang)、鉀(K+)和促腎上腺皮質激素(ACTH)是促進醛固酮分泌的主要生因子[36]。本研究中，CaMK1顯著上調，CaMK1表達量的升高會誘導固醇激素合成急性調節(jié)蛋白(steroidogenic acute regulatory protein，STAR)和細胞色素P450家族11亞家族B成員2(cytochrome P450 family 11 subfamily B member 2，CYP11B2)基因的表達，以解除對醛固酮生物合成的限制。雙峰駝可能是以這種方式促進醛固酮的合成和分泌，以達到調節(jié)血壓的作用[37]。

蛋白質是生物體營養(yǎng)動態(tài)平衡必不可少的飲食成分。通常，攝入的蛋白質在胃、胰腺和小腸酶的作用下經歷一系列復雜的降解過程，得到氨基酸和小肽的混合物，再由特異的氨基酸轉運蛋白將對應的酸性氨基酸、中性氨基酸和堿性氨基酸轉運到小腸上皮細胞[38]。小肽被PEPT1轉運蛋白吸收進入小腸上皮細胞。小腸細胞內的肽段被水解，得到的氨基酸與氨基酸轉運蛋白一起通過多個基底外側氨基酸轉運蛋白釋放到血液中[39]，完成蛋白質的消化與吸收。瘤胃作為重要的消化器官，在蛋白質的吸收與消化上起到了非常重要的作用。有研究表明[40]，駱駝會利用激素調節(jié)不同飲水量時體內和駝乳中的水分含量，以確保在飲水量受到限制的情況下保證胎兒和幼駝的水分供應，使胚胎時期的雙峰駝胎兒在母體環(huán)境中水分和營養(yǎng)充足，受外界環(huán)境的影響較小。本研究中，成年期低表達基因顯著富集于蛋白質消化與吸收途徑，說明為了適應成年后食物匱乏、水分稀少的惡劣沙漠環(huán)境，雙峰駝瘤胃細胞內蛋白質消化吸收活動降低，意味著與胚胎期相比，成年期的雙峰駝瘤胃減少了蛋白質的消化吸收，這可能與RNA的合成減少有關。

4 結 論

從組織學水平看，在成年期的瘤胃組織中，可見明顯的肌纖維，肌纖維直徑較寬，肌纖維間的空隙較大，與胚胎期相比，瘤胃在成年期有了極大程度的發(fā)育和分化。RNA-seq結果顯示，成年期雙峰駝瘤胃組織與胚胎期雙峰駝瘤胃組織共篩選到1 207個差異表達基因，其中上調差異表達基因456個，下調差異表達基因751個。差異表達基因的GO和KEGG富集分析結果表明，差異表達基因多參與MAPK信號通路、胰島素抵抗、胰島素信號通路、AGE-RAGE信號通路、PI3K-Akt信號通路、蛋白質消化吸收、醛固酮的合成與分泌等過程。這些功能有利于雙峰駝在沙漠環(huán)境中促進脂肪細胞的分化，降低代謝效率、提高血糖耐受性以及調節(jié)血壓平衡，以更好的在沙漠干燥缺水的環(huán)境中生存。