宋興超，劉琳玲，潘虹軍，趙家平，賈 赟，楊福合*，徐 超*

(1.銅仁學(xué)院，銅仁 554300； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春 130112； 3.大連海關(guān)技術(shù)中心，大連 116001)

水貂(Neovisonvison)屬于鼬科鼬屬，肉食性珍貴毛皮動(dòng)物，貂皮為其主要產(chǎn)品，被稱作“軟黃金”，是水貂經(jīng)濟(jì)價(jià)值的重要體現(xiàn)，用作貂皮服裝及服飾制品的主要原料[1]。隨著人們生活水平和消費(fèi)質(zhì)量的不斷提高與改善，越來越多的消費(fèi)者轉(zhuǎn)向需求優(yōu)質(zhì)、綠色和環(huán)保的毛皮產(chǎn)品，不經(jīng)過化學(xué)染色的純天然彩色毛皮產(chǎn)品逐漸受到更多消費(fèi)者的關(guān)注[2-3]。因此，生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、綠色和環(huán)保的毛皮產(chǎn)品已成為水貂新品種培育的前提，更是產(chǎn)業(yè)需要緊迫解決的核心問題[4]。毛色是關(guān)聯(lián)水貂毛皮品質(zhì)及價(jià)值的重要質(zhì)量性狀，也是其優(yōu)良品種培育過程中需要制定的一項(xiàng)關(guān)鍵育種目標(biāo)，要求具有本品種的毛色特征，全身一致，無雜色毛，頜下或腹部白斑不超過1.0 cm2或無白斑，并且個(gè)體間色調(diào)均勻[5]。因此，探明水貂毛色性狀分子遺傳機(jī)理，進(jìn)而培育具有天然色彩的優(yōu)異個(gè)體對其品種推廣利用工作尤為重要，具有較大的科研與經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

已有研究表明，脊椎動(dòng)物膚色、毛色及羽色主要取決于皮膚、毛發(fā)及羽毛中黑色素種類、數(shù)量及比例，目前，研究相對清楚的有真黑色素(黑與褐)和褐黑色素(紅與黃)[6]。在黑色素形成過程中，酪氨酸酶的活性決定了黑色素合成量的多少，因此，編碼該酶的酪氨酸酶(tyrosinase，TYR)基因已成為解析色素沉積性狀分子機(jī)理的關(guān)鍵突破口。在TYR基因SNPs篩查方面，Anistoroaei等[7]研究發(fā)現(xiàn)，TYR基因編碼區(qū)變異(138.TGT→TGA)可能導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)功能域縮短，與丹麥水貂白化被毛性狀相關(guān)。Blaszczyk等[8]利用Southern雜交表明，TYR基因外顯子4缺失與雪貂白化相關(guān)。Damé等[9]研究表明，白化水牛TYR基因位點(diǎn)g.1403G>A引起終止密碼子形成，導(dǎo)致無活性蛋白合成，與水牛被毛白化性狀關(guān)聯(lián)較大。在TYR基因mRNA與蛋白表達(dá)方面，Anello等[10]通過qPCR研究表明，白色被毛羊駝皮膚組織TYR基因mRNA表達(dá)量顯著低于稀釋和非稀釋被毛個(gè)體(P<0.05)，分析揭示，TYR基因表達(dá)水平在羊駝被毛色素沉積中具有重要調(diào)控功能。趙若陽等[11]利用qPCR和Western blot研究均表明，越背花毛蒙古馬黑色被毛對應(yīng)皮膚中TYR基因mRNA與蛋白表達(dá)量極顯著高于白色毛對應(yīng)皮膚(P<0.001或P<0.01)，綜合推測，過量且具有活性的TYR是促進(jìn)越背花毛蒙古馬黑色被毛部位皮膚合成較多真黑色素的主要因素。目前，僅見水貂TYR基因部分cDNA序列報(bào)道[12]，而該基因完整編碼區(qū)序列(coding sequence，CDS)的結(jié)構(gòu)特性、SNPs及其皮膚組織mRNA表達(dá)規(guī)律與水貂毛色性狀的關(guān)系尚不明晰。

為進(jìn)一步解析水貂被毛色素沉積分子調(diào)控機(jī)制，本研究通過克隆水貂TYR基因完整編碼區(qū)序列，分析CDS分子結(jié)構(gòu)特性，篩查部分外顯子SNPs及明確該基因在不同毛色水貂皮膚組織mRNA差異表達(dá)規(guī)律，探究變異位點(diǎn)和mRNA差異表達(dá)與毛色性狀的關(guān)系，旨在深入解析TYR基因調(diào)控水貂毛色表型的功能，為加快分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)應(yīng)用于優(yōu)質(zhì)毛色水貂品種的選育與改良提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

金州黑水貂(黑色，JZH，120只)、名威銀藍(lán)水貂(灰色，MWYL，95只)和紅眼白水貂(白色，HYB，86只)共計(jì)301只7月齡雄性個(gè)體的血液取自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所特種畜禽實(shí)驗(yàn)基地(吉林，左家)和大連名威貂業(yè)有限公司(遼寧，金州)。于毛皮成熟期(12月初)，選擇黑、灰與白色被毛水貂各3只， 采集背中部皮膚1 cm2左右，液氮保存。

1.2 主要試劑

全血DNA提取試劑盒、ExTaqDNA聚合酶、Trizol Reagent和反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；SYBR?Select Master Mix購自Thermo Fisher公司。

1.3 水貂血液基因組DNA與皮膚RNA的提取

利用全血DNA提取試劑盒獲得水貂基因組DNA，采用Trizol法提取皮膚RNA，參考反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，保存于-20 ℃冰箱。

1.4 引物設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增與克隆測序

參考GenBank數(shù)據(jù)庫中雪貂(EF405957)、海豹(XM_004412938)、綿羊(HQ875337)和家兔(NM_001082077)等哺乳動(dòng)物的TYR基因編碼區(qū)全序列，經(jīng)過BioEdit 7.2軟件進(jìn)行比對后，利用Primer Primier 5.0軟件在5個(gè)外顯子兩端的保守區(qū)域分別設(shè)計(jì)5對擴(kuò)增完整外顯子的引物，以TYR-1、TYR-4和TYR-5作為檢測SNPs的引物，根據(jù)前期獲得的水貂皮膚轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中TYR基因mRNA序列[13]設(shè)計(jì)qRT-PCR引物T-1，選取β-actin作為qRT-PCR內(nèi)參基因。引物由上海生工生物工程有限公司合成，相關(guān)信息見表1。

PCR體系為25 μL：模板DNA 1.0 μL，ExTaqDNA 聚合酶(5 U·μL-1)0.25 μL，dNTPs 2.0 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，上、下游引物(10 pmol·μL-1) 各1.0 μL，滅菌超純水17.25 μL。PCR程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火(溫度見表1)30 s，72 ℃延伸(時(shí)間見表1)，共38個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min；4 ℃保存。利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行克隆、測序。

1.5 水貂TYR基因編碼區(qū)序列生物信息學(xué)分析

測序數(shù)據(jù)經(jīng)NCBI在線BLAST比對，以確定是否為目標(biāo)序列；參照GenBank數(shù)據(jù)庫中雪貂TYR基因信息確定水貂該基因序列結(jié)構(gòu)；參考莫家遠(yuǎn)等[14]、杜鵬飛等[15]、周志楠等[16]和王斌等[17]的方法，通過BioEdit 7.2軟件統(tǒng)計(jì)TYR基因編碼序列核苷酸含量；利用SignalP-5.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和TMHMM Server 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測水貂TYR蛋白信號肽與跨膜區(qū)，采用SMART(http://smart.embl.de/)和Motif Scan(http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)在線軟件分別分析TYR蛋白結(jié)構(gòu)功能域和潛在功能基序。

1.6 水貂TYR基因SNPs篩查

SNPs篩查選用的PCR體系及程序同1.4。采用BioEdit 7.2軟件ClustalW Multiple alignment程序分析水貂TYR基因外顯子1、4和5的序列，篩查SNPs；通過測序峰圖軟件Chromas 5.0定義SNPs位點(diǎn)的基因型：單峰表示純合基因型，套峰表示雜合基因型。

1.7 皮膚組織TYR基因mRNA差異表達(dá)分析

以不同毛色水貂皮膚組織cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR，根據(jù)SYBR?Select Master Mix說明書優(yōu)化qRT-PCR體系，利用Step One PlusTM系統(tǒng)設(shè)置反應(yīng)程序。反應(yīng)體系20.0 μL：cDNA 2.0 μL，上、下游引物各1.5 μL，SYBR?Select Master Mix 10.0 μL，滅菌超純水5.0 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性20 s，退火(溫度見表1)30 s，72 ℃ 延伸1 min，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 1 min；退火(溫度見表1)30 s；95 ℃ 30 s。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，白色被毛個(gè)體表達(dá)水平標(biāo)定為1，作為對照組，參考2-ΔΔCt分析方法[18]進(jìn)行TYR基因相對表達(dá)量計(jì)算，以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SAS 9.0進(jìn)行單因素方差(One-way ANOVA)分析和多重比較(LSD)。

表1 水貂TYR基因克隆、SNPs篩查及qRT-PCR引物Table 1 Primers for CDS clone, SNPs detection and qRT-PCR of mink TYR gene

2 結(jié) 果

2.1 水貂TYR基因克隆及序列分析

2.1.1TYR基因鑒定及分析 由圖1可知，擴(kuò)增產(chǎn)物大小與設(shè)計(jì)長度一致，可進(jìn)行后續(xù)克隆。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化、克隆及酶切鑒定、測序并拼接后獲得的序列長度為2 391 bp，以雪貂及其他物種TYR基因結(jié)構(gòu)為參照，水貂TYR基因(登錄號：KJ716783)外顯子1、2、3、4和5大小分別為：819、217、148、182和230 bp， 編碼區(qū)序列長1 596 bp，編碼531個(gè)氨基酸。利用BLAST軟件進(jìn)行同源性檢索表明，克隆序列與雪貂、海豹、犬及貓同源性分別為98%、94%、93%和92%，說明獲得序列為水貂TYR基因序列。堿基序列組成顯示，A=24.87%，C=25.75%，G=23.43%，T=25.94%，A+T含量與G+C基本一致，表明水貂TYR基因CDS區(qū)DNA雙鏈較穩(wěn)定。

M1、M2. DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1～2、3～5、6～7、8～9和10～12分別為引物TYR-1、TYR-2、TYR-3、TYR-4和TYR-5擴(kuò)增產(chǎn)物M1 and M2. DL 2000 and 1000 DNA marker; 1-2, 3-5, 6-7, 8-9 and 10-12 are the amplified products by primer TYR-1, TYR-2, TYR-3, TYR-4 and TYR-5圖1 水貂TYR基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification result of TYR gene in mink

2.1.2 TYR蛋白信號肽與跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用在線軟件SignalP-5.0 Server基于深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(deep neural network)預(yù)測分析水貂TYR蛋白信號肽(圖2)表明，該蛋白的氨基末端至第18個(gè)氨基酸之間存在一段信號肽，屬于一種分泌型蛋白，剪切位點(diǎn)(cleavage site：CS)為18G-19H。采用TMHMM Server 2.0對TYR蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(圖3)顯示，水貂TYR蛋白第1～473位氨基酸位于膜外(outside)，497～531位氨基酸位于膜內(nèi)(inside)，474～496位氨基酸為跨膜蛋白(TMhelix)。

圖2 水貂TYR蛋白信號肽預(yù)測分析Fig.2 Prediction analysis of the signal peptide of mink TYR protein

橫坐標(biāo)表示氨基酸位點(diǎn)；縱坐標(biāo)表示跨膜區(qū)概率Abscissa coordinate represents the position of amino acids；Longitudinal coordinate represent the probability of transmembrane domain圖3 水貂TYR蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析Fig.3 Transmembrane domain analysis of mink TYR protein

2.1.3 TYR蛋白關(guān)鍵功能域及位點(diǎn) 通過Simple modular architecture research tool(SMART)預(yù)測蛋白關(guān)鍵功能域(圖4)表明，水貂TYR蛋白包含1個(gè)信號肽(signal peptide)，1個(gè)EGF結(jié)構(gòu)域(EGF domain)，1個(gè)酪氨酸酶家族共有核心結(jié)構(gòu)域(tyrosinase)，1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembrane region)和1個(gè)低復(fù)雜度結(jié)構(gòu)域(low complexity region)，分別位于1～18、84～113、171～403、474～496和497～506位氨基酸，其中，信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域與2.1.2預(yù)測結(jié)果相符。利用NCBI蛋白保守結(jié)構(gòu)域在線分析軟件發(fā)現(xiàn)，克隆的水貂TYR基因也具有酪氨酸酶超家族(tyrosinase superfamily)結(jié)構(gòu)域?；贛yHits在線軟件中Motif Scan程序預(yù)測關(guān)鍵功能位點(diǎn)表明，水貂TYR蛋白包括41個(gè)潛在的功能基序位點(diǎn)，6個(gè)N-糖基化位點(diǎn)：86～89(NRTC)、111～114(NCTE)、161～164(NGST)、230～233(NFTI)、337～340(NFSF)和371～374(NGTM)位氨基酸；13個(gè)II型酪蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)(casein kinase II phosphorylation site，CK2)：29～32(SLME)、72～75(TGVD)、127～130(SVPE)、145～148(TSPD)、226～229(TGDE)、277～280(TRLE)、314～317(SSAD)、325～328(TQYE)、380～383(SAND)、391～394(TFVD)、395～398(SIFE)、441～444(SSRD)和455～458(SERD)位氨基酸；7個(gè)豆蔻?；稽c(diǎn)(N-myristoylation site，MYRISTYL)：43～48(GSPCGQ)、53～58(GACQNI)、93～98(GNFMGF)、157～162(GQMNNG)、243～248(GCDICT)、353～358(GIADAS)和485～490(GSVLTL)位氨基酸；9個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)(protein kinase C phosphorylation site，PKC)：12～14(SFR)、26～ 28(SSK)、38～40(TWR)、50～52(SGR)、113～115(TEK)、309～311(TPR)、339～341(SFR)、441～443(SSR)和455～457(SER)位氨基酸；1個(gè)微體細(xì)胞C端靶向信號：529～531(THL)位氨基酸；1個(gè)細(xì)胞輔助序列位點(diǎn)：40～42(RGD)位氨基酸；1個(gè)表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域信號I(EGF-like domain signature I，EGF-I)：89～100位氨基酸(CHCFGNFMGFNC)；1個(gè)層粘連蛋白型表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域信號(laminin-type EGF-like domain signature，EGF_LAM_1)：89～112位氨基酸(CHCFGNFMGFNCGNCKFGFWGPNC)；1個(gè)酪氨酸酶銅-A結(jié)合位點(diǎn)信號因子(tyrosinase CuA-binding region signature，TYROSINASE 1)：202～219位氨基酸(HEAPGFLPWHRLFLLLWE)；1個(gè)酪氨酸酶銅-B結(jié)合位點(diǎn)信號因子(tyrosinase CuB-binding region signature，TYROSINASE 2)：383～394位氨基酸(DPIFLLHHTFVD)；170～403位氨基酸為1個(gè)酪氨酸酶家族共有核心結(jié)構(gòu)域(common central domain of tyrosinase)。

圖4 水貂TYR蛋白關(guān)鍵功能域分析Fig.4 Key functional domains analysis of mink TYR protein

2.2 水貂TYR基因SNPs篩查

利用BioEdit 7.2 軟件ClustalW multiple alignment程序?qū)⒉煌鮐YR基因外顯子1、4和5的PCR產(chǎn)物直接測序結(jié)果進(jìn)行比對，篩查SNPs。SNPs命名原則：每個(gè)外顯子的第1個(gè)起始堿基標(biāo)記為“1”。結(jié)果表明，301個(gè)樣本外顯子4和5序列不存在變異位點(diǎn)，外顯子1存在2個(gè)SNPs位點(diǎn)(圖5)，分別命名為：c.138T>A和c.441G>A，c.138T>A僅存在于名威銀藍(lán)水貂和紅眼白水貂群體中，形成3種基因型：TT、TA和AA，該位點(diǎn)為無義突變，由TGT編碼的半胱氨酸突變?yōu)榻K止密碼子TGA。c.441G>A位點(diǎn)僅存在于金州黑水貂群體中，為沉默突變，發(fā)生在密碼子第3位堿基，CCG和CCA均編碼脯氨酸(Pro)。

A. c.138T>A位點(diǎn)測序峰圖：a. 純合子TT基因型；b. 雜合子TA基因型；c. 純合子AA基因型。B. c.441G>A位點(diǎn)測序峰圖：d. 純合子GG基因型；e. 雜合子GA 基因型；f. 純合子AA基因型。突變位點(diǎn)用箭頭標(biāo)明A.DNA sequencing map of c.138T>A site：a. homozygote TT; b. heterozygote TA; c. homozygote AA. B. DNA sequencing map of c.441G>A site:d. homozygote GG; e. heterozygote GA; f. homozygote AA. Arrows indicate muataion sites圖5 水貂TYR基因外顯子1的2個(gè)突變位點(diǎn)Fig.5 Two mutation sites of the mink TYR gene exon 1

2.3 水貂皮膚組織TYR基因mRNA差異表達(dá)

由圖6可知，TYR基因mRNA在3種毛色水貂皮膚中均存在表達(dá)，其表達(dá)量趨勢為：金州黑水貂>名威銀藍(lán)水貂>紅眼白水貂，金州黑水貂、銀藍(lán)水貂皮膚TYR基因mRNA相對表達(dá)量分別是紅眼白水貂的3.25和1.89倍，在金州黑水貂皮膚中的表達(dá)量極顯著高于名威銀藍(lán)水貂和紅眼白水貂(P<0.01)，在銀藍(lán)水貂皮膚中的表達(dá)量顯著高于紅眼白水貂(P<0.05)。

不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)Different capital letters represent extremely significant difference (P<0.01)，and different lowercase letters represent significant difference (P<0.05)圖6 不同毛色水貂皮膚組織TYR基因mRNA相對表達(dá)量Fig.6 Relative expression of TYR gene mRNA in mink skin with different coat colors

3 討 論

3.1 TYR基因關(guān)鍵結(jié)構(gòu)功能域及SNPs與色素沉積關(guān)系的探討

本研究通過比較基因組學(xué)方法，以雪貂和海豹等動(dòng)物同源基因序列為模板，設(shè)計(jì)了5對特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，成功克隆出水貂TYR基因。隨著基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究的逐漸深入，特別是當(dāng)今大數(shù)據(jù)組學(xué)的迅速發(fā)展，生物信息學(xué)理論及分析方法也得到了進(jìn)一步的更新[19-21]。通過系統(tǒng)生物信息學(xué)分析，本研究獲得的水貂TYR基因長2 391 bp， 包含5個(gè)完整外顯子，編碼區(qū)長1 596 bp，編碼531個(gè)氨基酸，由信號肽(18個(gè)氨基酸)和成熟肽(513個(gè)氨基酸)組成。信號肽預(yù)測表明，水貂TYR蛋白屬分泌型蛋白，可以在細(xì)胞外發(fā)揮作用。研究表明，人[22]、食蟹猴[23]、犬[24]、山羊[25]和豬[26]等哺乳動(dòng)物TYR蛋白編碼序列N端均含有信號肽，本研究結(jié)果與前人研究一致。研究發(fā)現(xiàn)，新合成蛋白在其N端信號肽的指引下到達(dá)細(xì)胞特定區(qū)域進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[27]，TYR蛋白形成后只有與細(xì)胞膜中特定受體結(jié)合才發(fā)揮其調(diào)控作用，水貂TYR蛋白信號肽的存在可保證其功能正常發(fā)揮。信號肽一般存在于氨基酸序列的N端，是引導(dǎo)新生蛋白向分泌通路轉(zhuǎn)移的短肽鏈，長度為5～30個(gè)氨基酸不等[28]。不同物種的TYR蛋白信號肽在進(jìn)化過程中剪切位點(diǎn)非常保守(18G…H19)，同時(shí)，拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)域在線預(yù)測軟件也預(yù)測到水貂TYR蛋白C端存在一段包括23個(gè)氨基酸(474～496位)的跨膜結(jié)構(gòu)域。研究表明，脊椎動(dòng)物山羊[25]、朱鹮[29]和蛙[30]等物種均包括一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)片段，暗示酪氨酸酶在色素合成過程中可能具有重要功能。除此之外，EGF結(jié)構(gòu)域、酪氨酸酶家族共有核心結(jié)構(gòu)域、酪氨酸酶銅-A和酪氨酸酶銅-B結(jié)合位點(diǎn)信號因子的關(guān)鍵功能結(jié)構(gòu)域的預(yù)測結(jié)果再次證明了水貂TYR蛋白在調(diào)控色素沉積方面的重要作用。對于SNPs篩查結(jié)果，本研究發(fā)現(xiàn)了1個(gè)關(guān)鍵突變位點(diǎn)c.138T>A，具有白色被毛的紅眼白水貂在該位點(diǎn)全部為AA型，該無義突變導(dǎo)致TYR基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)域缺少了EGF domain、酪氨酸酶銅-A和酪氨酸酶銅-B結(jié)合位點(diǎn)，最終導(dǎo)致酪氨酸酶家族共有核心結(jié)構(gòu)域缺失，黑色素合成生物學(xué)過程中斷，產(chǎn)生白色被毛。這一結(jié)果與Anistoroaei等[7]對美洲白化水貂和Blaszczyk等[8]對白化雪貂的研究結(jié)果一致。其中，丹麥白化水貂個(gè)體TYR基因外顯子1存在無義突變(138.TGT→TGA)位點(diǎn)，這與本研究中c.138T>A位點(diǎn)完全吻合，宋興超等[31]也發(fā)現(xiàn)，T138A位點(diǎn)的PCR-RFLP多態(tài)性與水貂毛色表型顯著關(guān)聯(lián)，表明紅眼白水貂與白化水貂毛色決定基因均為TYR基因。同時(shí)，Ito和Wakamatsu[32]研究也表明，若黑色素細(xì)胞中酪氨酸酶含量和活性降低，酪氨酸會(huì)經(jīng)多巴和多巴醌生成半胱酰多巴，褐黑色素濃度增高，動(dòng)物被毛表現(xiàn)為淺色或白色。上述研究結(jié)果提示，TYR基因c.138T>A位點(diǎn)是導(dǎo)致水貂白色被色表型形成的關(guān)聯(lián)SNPs。

3.2 TYR基因皮膚組織mRNA表達(dá)量與水貂毛色性狀的關(guān)聯(lián)性

迄今為止，編碼酪氨酸酶蛋白的TYR基因已成為探究動(dòng)物色素沉積分子機(jī)制的核心基因。TYR基因表達(dá)量升高會(huì)促進(jìn)黑色素細(xì)胞生成并分泌更多的真黑色素，動(dòng)物的毛色、羽色和膚色也就相應(yīng)越深，若酪氨酸酶活性或表達(dá)量過低將阻斷黑色素合成，動(dòng)物毛色、羽色和膚色將會(huì)變淺甚至呈現(xiàn)白化表型[33]。Paterson等[34]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠黑色素細(xì)胞中TYR基因高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致酪氨酸酶活性增強(qiáng)。Zhang等[35]利用qRT-PCR技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，體色正常的黃顙魚皮膚組織TYR基因mRNA表達(dá)量顯著高于白化個(gè)體(P<0.05)，且該基因表達(dá)具有時(shí)空與組織特異性，表明TYR基因在色素沉積過程中具有重要功能，可在某種程度上決定體色的變異。高莉等[36]研究表明，棕色被毛羊駝皮膚TYR基因mRNA表達(dá)量極顯著高于白色個(gè)體，可進(jìn)一步導(dǎo)致不同程度的色素沉積及多樣化毛色表型的形成。姜俊兵等[37]研究也發(fā)現(xiàn)，有色被毛羊駝TYR基因mRNA表達(dá)量顯著高于白色個(gè)體。Xu等[38]利用轉(zhuǎn)錄組測序獲得了五指山豬黑色與白色皮膚組織比較表達(dá)譜，其中，TYR基因mRNA表達(dá)水平在兩種皮膚中存在顯著差異(P<0.01)。Yao等[39]研究也表明，不同毛色綿羊皮膚TYR基因的相對表達(dá)量具有顯著差異。本研究結(jié)果表明，TYR基因在黑色、灰色和白色被毛水貂皮膚中均存在一定的表達(dá)，但其mRNA表達(dá)量則呈現(xiàn)一定的差異，該基因在黑色、灰色被毛水貂皮膚中的表達(dá)量分別是白色個(gè)體的3.25(P<0.01)和1.89(P<0.05)倍，該結(jié)果與羊駝[10,36-37]、馬[11]、黃顙魚[35]等脊椎動(dòng)物獲得的相關(guān)結(jié)果一致，也與本研究篩查到的白色被毛水貂TYR基因外顯子1中c.138T>A突變相符合，推測該SNPs的存在導(dǎo)致終止密碼子的提前出現(xiàn)，形成一段截短蛋白，終止水貂TYR基因mRNA的合成，最終中斷真黑色素合成，從而形成白色被毛表型，有待于進(jìn)一步通過細(xì)胞或動(dòng)物水平RNA干擾或過表達(dá)試驗(yàn)開展具體的分子調(diào)控機(jī)理研究，或者通過檢測水貂不同胚胎時(shí)期該基因的表達(dá)水平以進(jìn)一步解析TYR基因的調(diào)控功能。前期研究發(fā)現(xiàn)，水貂作為一種典型季節(jié)性被毛脫換動(dòng)物，其毛囊在換毛期間會(huì)有生長期、退行期與休止期等過程[40]，本研究中，試驗(yàn)樣品采集時(shí)間在12月初，毛囊穩(wěn)定在退行期或即將進(jìn)入靜止期，毛色關(guān)聯(lián)基因也可能會(huì)存在表達(dá)量的差異，因此，有必要檢測換毛期TYR基因的差異表達(dá)量來進(jìn)一步完善水貂毛色性狀形成的分子調(diào)控機(jī)制。

4 結(jié) 論

本研究克隆獲得了水貂TYR基因完整編碼區(qū)，序列全長2 391 bp。生物信息學(xué)分析表明，水貂TYR蛋白共編碼531個(gè)氨基酸，關(guān)鍵功能結(jié)構(gòu)域(EGF結(jié)構(gòu)域、酪氨酸酶家族共有核心結(jié)構(gòu)域、酪氨酸酶銅-A和酪氨酸酶銅-B結(jié)合位點(diǎn)信號因子)及外顯子1中SNPs(c.138T>A)對水貂被毛色素沉積具有重要調(diào)控功能；TYR基因皮膚組織mRNA差異表達(dá)水平與水貂毛色顯著關(guān)聯(lián)。