鐘冬蓮，莫潤宏，王蕤，喻寧華，沈丹玉，湯富彬*

1(中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，國家林業(yè)和草原局經(jīng)濟林產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測中心(杭州)，浙江 杭州， 311400)2(湖南省林產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測中心，湖南 長沙，410004)

食用植物油是人體能量和脂肪酸攝入的重要來源，除此之外，植物油中還含有角鯊烯、植物甾醇、維生素E等多種微量成分，這些脂肪伴隨物也是人們?nèi)粘Ｉ攀持械闹匾M成部分[1-2]。早些年的油脂營養(yǎng)研究多著眼于油脂中脂肪酸組成，片面強調(diào)脂肪酸的作用，對油脂中微量脂肪伴隨物的重要性認識存在不足[3]。近年來隨著生活水平的提高，消費者逐漸開始關(guān)注植物油中這些有益微量成分的攝入，以達到健康飲食、膳食平衡的作用[4]。

角鯊烯是一種高不飽的天然萜類化合物，屬于脂質(zhì)不皂化物，具有提高體內(nèi)超氧化物歧化酶活性、增強機體免疫能力，抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤等多種生理機能[5]。植物甾醇是一類以環(huán)戊烷多氫菲為骨架的天然醇類化合物[6]，具有降低膽固醇、抗癌、防治心血管疾病等功能，被譽為“生命的鑰匙”[7]。植物油中最主要的植物甾醇主要是菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇等。

植物油中角鯊烯和植物甾醇均屬于脂質(zhì)不皂化成分，目前文獻報道植物油中角鯊烯或植物甾醇的測定方法主要有氣相色譜法[8-12]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[13]、高效液相色譜法[14-15]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[16-17]等，而且這些已報道的文獻中絕大部分還是采用經(jīng)典的皂化-液液萃取作為前處理方法。而傳統(tǒng)的液液萃取法存在操作步驟繁瑣，耗時長，易燃易爆有毒試劑消耗多，而且容易乳化導(dǎo)致方法的重現(xiàn)性差。固相萃取(solid phase extraction，SPE)具有操作簡便、快速、易于實現(xiàn)自動化、有機試劑用量少、綠色環(huán)保等優(yōu)點，已成為分析領(lǐng)域重要的分析方法。而SPE方法用于植物油中不皂化物凈化報道相對較少，本研究采用氫氧化鉀-甲醇皂化油脂，用一種反相聚合物為填料的固相萃取小柱同時凈化分離不皂化物中角鯊烯和植物甾醇組分，經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜法檢測，分別采用角鯊?fù)楹?α-膽甾烷-3β-醇作為內(nèi)標來定量分析，該方法操作簡便，檢測周期短，有機試劑用量少，方法重現(xiàn)性好，準確度高，適合于植物油中角鯊烯和4種植物甾醇含量測定方法推廣使用。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 7890A-7000B氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國Agilent公司；固相萃取裝置，美國Agilent公司；DC-12-DA氮吹儀，浙江省科學(xué)器材進出口有限責(zé)任公司;IKA MS3旋渦混合儀，德國IKA公司；Sartorius 萬分之一電子天平，北京賽多利斯公司；Milli-Q Gradient 超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司。

角鯊烯標準品(CAS號：111-02-4，純度≥99.0%)，美國Sigma-Aldrich公司；角鯊?fù)閮?nèi)標(CAS號：111-01-3，純度≥99.5%)，德國Dr.Ehrenstorfer公司；5α-膽甾烷-3β-醇標準品(CAS號：80-97-7，純度≥95.0%)，美國Sigma-Aldrich公司；菜籽甾醇(CAS號：474-67-9，純度≥98.0%)，美國Sigma-Aldrich公司；菜油甾醇(CAS號：474-62-4，純度≥98.0%)，美國Sigma-Aldrich公司；豆甾醇(CAS號：83-48-7，純度≥98.0%)，美國Sigma-Aldrich公司；β-谷甾醇(CAS號：83-46-5，純度≥98.0%)，美國Sigma-Aldrich公司。

甲醇(色譜純)，德國Merck公司；KOH、丙酮、乙酸乙酯(分析純)，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；Oasis HLB固相萃取小柱(500 mg/6mL)，美國Waters公司。

1.2 樣品來源

花生油1、花生油2、大豆油1、菜籽油2、玉米油、芝麻油，均購自大型超市；花生油3、大豆油2、菜籽油1，均采用實驗室小型榨油機現(xiàn)榨獲得。

1.3 標準溶液配制

準確稱取10 mg角鯊烯、10 mg角鯊?fù)闃藴势酚?0 mL容量瓶中，分別用正己烷定容至刻度，即配成1 000 μ g/mL的角鯊烯標準儲備液和1 000 μg/mL的內(nèi)標角鯊?fù)闃藴嗜芤骸７謩e準確稱取10 mg菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、5α-膽甾烷-3β-醇標準品于10 mL容量瓶，用乙酸乙酯定容至刻度，即配成1 000 μg/mL的菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇標準儲備液及1 000 μg/mL的內(nèi)標5α-膽甾烷-3β-醇標準溶液。

1.4 樣品前處理

分別準確移取25 μL角鯊?fù)楹?0 μL 5α-膽甾烷-3β-醇內(nèi)標于10 mL比色管中，氮氣將溶劑吹干，稱取0.15 g(精確至0.000 1 g)油樣于此比色管，加入2.5 mL 2 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液，于70 ℃水浴皂化60 min。趁熱取出后，用80%甲醇稀釋至10 mL刻度。將HLB小柱(500 mg, 6 mL)裝于固相萃取裝置上，先加5 mL甲醇，再加5 mL 80%甲醇活化小柱，然后將皂化好的樣品溶液上柱，再用5 mL 80%甲醇淋洗小柱，淋洗2次，完全抽干后，底部用10 mL離心管接收洗脫液，加7 mL乙酸乙酯洗脫樣品，氮吹干，用1 mL乙酸乙酯復(fù)溶，過0.22 μm有機濾膜，用于GC-MS檢測，內(nèi)標法定量。

1.5 色譜及質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱：HP-5毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣：高純氦氣(純度99.999%)；柱流量：1.2 mL/min，不分流模式進樣；進樣口溫度：300 ℃；程序升溫：160 ℃保持1 min，以15 ℃/min升至280 ℃，保持5 min，然后以5 ℃/min升至300 ℃，最后保持7 min。進樣量：1 μL。

質(zhì)譜條件：電子轟擊(EI)離子源，電離能量 70 eV，離子源溫度 250 ℃，四級桿溫度150 ℃，傳輸線溫度 280 ℃，溶劑延遲 5 min，燈絲電流:100 μA。用全掃描模式對目標化合物進行定性分析，定量分析則采用選擇離子監(jiān)測模式，優(yōu)化的參數(shù)如表1所示，5種目標化物和2種內(nèi)標化合物的混合標準溶液總離子流圖見圖1。

表1 五種目標化合物和2種內(nèi)標化合物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS spectrometry parameters for five target compounds and two internal standard compounds

1-角鯊?fù)?內(nèi)標)；2-角鯊烯；3-5α-膽甾烷-3β-醇(內(nèi)標)；4-菜籽甾醇；5-菜油甾醇；6-豆甾醇；7-β-谷甾醇圖1 角鯊烯和4種植物甾醇的GC-MS色譜圖Fig.1 Gas chromatography-tandem mass spectrometric chromatograms of squalene and four phytosterols

2 結(jié)果與分析

2.1 皂化溶液的選擇

植物油由皂化物與不皂化物兩部分組成，由脂肪酸甘油三酯組成的皂化物部分通常占到整個油脂的98%以上。因此，當需測定植物油中角鯊烯、甾醇等不皂化成分時，通常會采用堿液使油脂中的脂肪酸甘油酯皂化為高級脂肪酸鈉和甘油，再通過液液萃取或固相萃取分離去除甘油三酯的干擾。目前國標GB/T 25233—2010動植物油脂 甾醇組成和甾醇總量的測定 氣相色譜法及絕大部分文獻的皂化液通常采用氫氧化鉀-乙醇溶液，而本實驗采用氫氧化鉀-甲醇溶液皂化，因為和乙醇相比，甲醇具有更強的極性，更低粘度，適合作為下一步反相固相萃取凈化步驟中的溶劑。

2.2 固相萃取小柱的選擇

角鯊烯和植物甾醇都屬于弱極性化合物，適合用反相萃取分離。在優(yōu)化固相萃取小柱種類時比較了普通C18和反相固相萃取小柱(HLB)2種小柱，實驗結(jié)果表明，使用普通C18柱凈化時，回收率明顯偏低，且洗脫溶液混濁，而HLB小柱凈化后，回收率為92%～102%且無混濁現(xiàn)象發(fā)生(圖2)。由于本實驗中，油脂皂化后存在大量的無機鹽和皂類物質(zhì)，且溶液堿性較強，具有較高的pH值，超出普通C18柱的pH 2.5～pH 8，導(dǎo)致回收率偏低，甚至填料塌陷而致溶液混濁，而聚合物為填料的反相固相萃取小柱(HLB)在pH 1～pH 14仍很穩(wěn)定，因此適合選擇HLB固相萃取小柱。樣品凈化前，首先將皂化物用10 mL 80%甲醇稀釋，以降低樣品的黏度，并將反相萃取柱的起始流動相中V(甲醇)∶V(水)調(diào)至最佳比例。樣品過柱后，仍用10 mL 80%甲醇淋洗柱中的無機鹽及皂類雜質(zhì)，如果采用更高濃度的甲醇淋洗，則會增加目標化合物洗脫的風(fēng)險。

圖2 兩種固相萃取小柱比較Fig.2 Effect of two SPE columns on purification efficiencies

2.3 柱容量的選擇

比較了HLB(60 mg，3 mL)和HLB(500 mg，6 mL)2種不同容量柱的吸附效果。將1 000 μg/mL的角鯊烯和甾醇混合標液50 μL添加到0.15 g油茶籽油樣品中，提取步驟同1.4，考察2種柱容量的加標回收率。結(jié)果顯示，2種柱容量下，目標化合物的回收率96%～114%，均滿足分析要求，但考慮到不同植物油中不皂化物成分及含量差異較大，為確保有足夠的柱容量，最終選擇500 mg柱容量的HLB小柱作為凈化柱。

2.4 洗脫溶劑的選擇

通過非極性作用力吸附在固相萃取小柱上的目標化合物，通常采用具有非極性作用的溶劑洗脫。比較了丙酮、乙酸乙酯及丙酮與乙酸乙酯混合液[V(丙酮)∶V(乙酸乙酯)=1∶1]3種洗脫劑的洗脫效果。將1 000 μg/mL的角鯊烯和甾醇混合標液50 μL添加到0.15 g油茶籽油樣品中，提取步驟同1.4節(jié)，洗脫時分別采用以上3種溶劑洗脫，洗脫體積均為7 mL。結(jié)果表明，3種洗脫溶劑均適合于洗脫4種甾醇類化合物，回收率結(jié)果為100%～116%，而純丙酮或添加丙酮的乙酸乙酯洗脫角鯊烯時，回收率明顯偏高，純乙酸乙酯洗脫角鯊烯回收率正常(圖3)，因此，最終選擇乙酸乙酯作為洗脫溶劑。為了將目標化合物充分洗脫下來，同時做了洗脫溶劑體積實驗，最終洗脫體積設(shè)定為7 mL。

圖3 不同洗脫洗溶液脫效果的比較Fig.3 Effect of different elution solutions on the elution efficiencies

2.5 線性范圍、檢出限及定量限

分別移取適量的角鯊烯、菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇及β-谷甾醇儲備液至10 mL容量瓶，同時添加角鯊?fù)榧?α-膽甾烷-3β-醇作為內(nèi)標，用乙酸乙酯定容至刻度，得到系列標準工作溶液，其中角鯊烯和菜籽甾醇的質(zhì)量濃度分別為5、10、20、40、80、100 μg/mL，菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的質(zhì)量濃度分別為10、20、40、80、160、200 μg/mL，內(nèi)標角鯊?fù)榈馁|(zhì)量濃度為25 μg/mL，5α-膽甾烷-3β-醇的質(zhì)量濃度為50 μg/mL，角鯊烯以角鯊?fù)闉閮?nèi)標，4種甾醇以5α-膽甾烷-3β-醇為內(nèi)標，分別以目標化合物與內(nèi)標物的峰面積之比對濃度作圖，得到各種目標化合物的內(nèi)標曲線。結(jié)果顯示，角鯊烯、菜籽甾醇在5～100 μg/mL，菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇在10～200 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)標曲線具有良好的線性，相關(guān)系數(shù)r均大于0.998。以信噪比S/N=3和信噪比S/N=10計算檢出限(LOD)和定量限(LOQ)，結(jié)果見表2，檢出限可達0.30 mg/kg，定量限可達1.13 mg/kg。

2.6 回收率與相對標準偏差

稱取油茶籽油樣品20份，其中2份做本底，其他18份分成3組(每組6份)，分別按低、中、高3個水平添加50、250、500 mg/kg，分別添加25 μL 1 000 μg/mL角鯊?fù)楹?0 μL 1 000 μg/mL 5α-膽甾烷-3β-醇作內(nèi)標，經(jīng)凈化后進行測定，計算方法的回收率和標對標準偏差(RSD)，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，在上述3個加標水平下該方法的回收率為91%～107%，RSD為1.2%～7.2%，均滿足GB/T 27404—2008附錄F[18]的要求。

表2 角鯊烯及4種甾醇的添加回收率、相對標準偏差(n=6)、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Recoveries, relative standard deviations, regression equations, correlation coefficients, limits of detection(LODs) and limits of quantification(LOQs) of squalene and four phytosterols

2.7 實際樣品的測定

應(yīng)用建立的方法對5種常見食用植物油中角鯊烯和4種植物甾醇進行了分析，結(jié)果見表3。

表3 五種植物油樣品中角鯊烯和4種植物甾醇的檢測結(jié)果 單位:mg/kgTable 3 Detection results of squalene and four phytosterols in five vegetable oils

由表3可知，5種常見食用植物油均含有角鯊烯成分，但原料種類不同，角鯊烯含量差異較大。而對于4種植物甾醇成分，5種油中均含菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇，且β-谷甾醇為主要成分，占甾醇總量的50%以上，玉米油中β-谷甾醇最高。此外，僅菜籽油和芝麻油中含有菜籽甾醇成分，測定結(jié)果與文獻報道一致[13, 19]。目前，5種常見食用植物油國家標準中，僅玉米油國家標準中把甾醇總量納入了食用油等級和真假的判定中，而其他4種油均未把角鯊烯和甾醇組分納入等級及真假評判中，故本文建議結(jié)合食用植物油國標中各項指標，把角鯊烯和甾醇組分一同納入食用油的整體質(zhì)量評估，這有利于鑒別食用油的優(yōu)劣與真假。

3 結(jié)論

基于SPE和GC-MS技術(shù)，建立了一種簡單、快速、靈敏的用于分析植物油中痕量角鯊烯和4種植物甾醇的方法。該方法前處理方法平均耗時8 min，平均消耗有機試劑30 mL，5種目標化合物在各自的線性范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)r>0.998，檢出限為0.30～5.87 mg/kg，定量限為1.13～19.7 mg/kg，在 50、250、500 mg/kg 3個添標水平下，方法的平均回收率為91%～107%，相對標準偏差小于7.2%。與傳統(tǒng)樣品前處理方法相比，所建立的新方法具有操作簡單、省時省力、靈敏度高，穩(wěn)定性好，有機溶劑消耗少等優(yōu)點，適用于植物油中角鯊烯和4種植物甾醇的同時測定。同時，角鯊烯和植物甾醇作為植物油中微量活性成分，在各類植物油中分布差異較大，可作為植物油摻偽鑒定的依據(jù)。