李澤洋,伍時華,龍秀鋒*,吳軍,易弋

1(廣西科技大學 生物與化學工程學院，廣西 柳州，545006)2(廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西 柳州，545006)3(廣西科技大學教學質量監(jiān)控與評估中心，廣西 柳州，545006)

“曲為酒之骨”，酒曲在釀酒過程中發(fā)揮著重要作用，酒曲中具有不同功能的多種微生物將原料發(fā)酵成酒并使其具有獨特風味[1-2]。微生物不能直接利用淀粉質原料進行發(fā)酵，酒曲中存在一類微生物，其產生的液化酶和糖化酶可將淀粉結構中的α-1,4糖苷鍵和α-1,6糖苷鍵切斷，將淀粉轉化為葡萄糖等可發(fā)酵糖，從而提高淀粉利用率[3-5]，此過程稱為糖化；這類微生物稱之為糖化菌。酒曲中糖化菌種類眾多，如霉菌、細菌和一些酵母等，多數以霉菌為主[6-10]。酒曲中常見的霉菌包括曲霉屬(Aspergillus)[11]、根霉屬(Rhizopus)[12-13]、毛霉屬(Mucor)、犁頭霉屬(Absidia)[14]、青霉屬(Penicillium)[15-16]等，其中曲霉屬和根霉屬菌種與其他菌種相比糖化能力尤為突出[17]，在糧醅糖化過程中的作用十分顯著，廣泛應用于大多數酒曲中[18-19]。部分糖化菌對釀酒起糖化作用的同時也兼具其他作用，如改善酒的口感，增加香氣物質等，對釀造酒的風味及風格的形成都具有積極作用[20-21]。

為獲得在米酒釀造中淀粉糖化能力強的菌株，本研究采用孢子純化法從9種不同來源的酒曲中初篩得到純菌株，通過比較純菌株所制酒曲的液化力和糖化力復篩得到糖化能力突出的菌株，并對其進行形態(tài)學和分子生物學鑒定，同時對菌株進行試飯試驗、蛋白酶活力測定及發(fā)酵風味物質分析。

1 材料與方法

1.1 原料

酒曲：通過多種途徑收集得到9種不同酒曲，詳細信息見表1;秈米(市售)、麩皮(網購)，無霉、無蛀保存完好。

表1 酒曲樣品信息Table 1 Information of the samples of Jiuqu

1.2 試劑

二氯甲烷、NaOH、CuSO4·5H2O、酒石酸鉀鈉、乳酸、乙酸、乙酸鈉、葡萄糖、三氯乙酸、Na2CO3、KI，西隴科學股份有限公司；可溶性淀粉(酶制劑行業(yè)檢測專用)，湖州展望藥業(yè)有限公司；福林酚試劑，福州文萊生物科技有限公司；L-酪氨酸、酪蛋白，合肥博美生物科技有限責任公司；碘，天津市科密歐化學試劑有限公司；乳酸鈉，天津市光復精細化工研究所。

1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，切塊沸水加熱20 min，8層紗布過濾取濾液，20 g葡萄糖，15 g瓊脂加熱溶解，加水補足至1 000 mL，自然pH，高壓蒸汽115 ℃滅菌20 min。

麩皮培養(yǎng)基：m(麩皮)∶m(水)=1∶0.8，每20 g麩皮分裝至500 mL三角瓶，高壓蒸汽121 ℃滅菌20 min，滅菌完畢振蕩三角瓶，確保麩皮培養(yǎng)基疏松不結塊。

米飯培養(yǎng)基：m(大米)∶m(水)=1∶3，每50 g米分裝至500 mL三角瓶，高壓蒸汽115 ℃滅菌20 min。

1.4 儀器與設備

UV-8000S紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；BX43生物顯微鏡，日本奧林巴斯有限公司；pHS-25CW臺式酸度計，上海般特儀器制造有限公司；Tpersonal聚合鏈式反應儀，德國Biometra公司；DYY-6D電泳儀，濟南東儀實驗室設備有限公司；ZXSD-R1430生化培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器制造有限公司；SW-CJ-TB標準凈化工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；LS-B35L-I立式壓力蒸汽滅菌器，江陰濱江醫(yī)療設備有限公司；SBA生物傳感分析儀，濟南延和生物科技有限公司；TRACE 1300 ISQ QD 氣相色譜質譜聯(lián)用儀、HP5-MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，賽默飛世爾科技有限公司。

1.5 試驗方法

1.5.1 糖化菌的初篩

1.5.1.1 菌株的分離

稱取5.0 g曲粉(塊狀需研磨)溶于45 mL無菌水中，振蕩混勻2 min，靜置取上層菌(孢子)懸液，以10倍系列稀釋制備菌(孢子)懸液，分別取10-3、10-4、10-5、10-6、10-7菌(孢子)懸液100 μL，涂布于PDA平板培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)2～4 d，以點植法取具有典型糖化菌菌落特征的菌落孢子(曲霉、根霉)，接種到新的PDA平板中培養(yǎng)，30 ℃培養(yǎng)2～4 d。

1.5.1.2 菌株的純化

將1.5.1.1中分離的菌株，以點植法接種培養(yǎng)多代，直至肉眼觀察所培養(yǎng)菌落無其他外觀雜菌干擾，做到初步純化。

使用解剖刀將菌落切割并移至50 mL無菌水中振蕩，紗布過濾除菌絲取孢子懸液，以10倍系列稀釋制備10-7、10-8、10-9孢子懸液，取100 μL孢子懸液涂布于PDA平板培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)，以一點為中心生長且不與其他菌落生長相連的單菌落視為純菌落(即此菌落為1個孢子生長繁殖而成)，每個平板生長的菌落控制在1～3個為宜，過多則菌落生長易相連難以純化，此時需繼續(xù)稀釋孢子懸液，防止孢子飛散繁殖，在整個平板所有菌落產孢子前，以接種針挑取菌絲于PDA斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)至產孢子后4 ℃保存。

1.5.2 糖化菌的復篩

將已純化的菌株制備孢子懸液，調整其濃度為1×107個/mL，按照1×107個/20g麩皮接種于麩皮培養(yǎng)基，均勻攪拌， 30 ℃培養(yǎng)3 d(每日扣瓶3次)，40 ℃烘干10 h，制成糖化曲，4 ℃密封保存。

參考QB/T 4257—2011中方法測定麩曲的液化力、糖化力[22]，進行3次平行測定。

1.5.3 形態(tài)學鑒定

將復篩得到的菌株以點植法接種于PDA平板中，30 ℃培養(yǎng)3 d，觀察菌落形態(tài)特征，并通過顯微鏡觀察其微觀形態(tài)，參考《真菌鑒定手冊》對其進行判斷[23]。

1.5.4 分子生物學鑒定

1.5.4.1 DNA體外擴增

引物：ITS1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)、ITS4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)。

PCR反應體系：預混酶：25 μL；引物ITS1：2 μL；引物ITS4：2 μL；菌液：2 μL；ddH2O：19 μL。

擴增條件：預變性：94 ℃、5 min；變性：94 ℃、1 min；退火：55 ℃、1 min；延伸：72 ℃、1 min；30個循環(huán)；延伸：72 ℃、10 min；4 ℃保存。

1.5.4.2 測序及鑒定

取50 μL PCR擴增產物，通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。選取電泳條帶大小在600 bp左右的樣品切膠回收，產物送至廣州賽默飛世爾科技公司進行測序。將測序結果提交于美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的GenBank數據庫進行BLAST序列比對，使用Mega 5.0軟件中鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，并采用Bootstraping法評估其準確度。

1.5.5 糖化試飯試驗

1.5.5.1 試飯

稱取大米40 g，浸泡8 h，蒸米至熟而不爛，超凈臺內放涼，稱重使米水質量比達到1∶1.5，若質量不足，均勻噴無菌水至米飯。以大米質量的0.3%拌曲，移至500 mL無菌三角瓶培養(yǎng)，透氣膜包扎，30 ℃培養(yǎng)72 h，每隔12 h取糖化飯10 g，加水50 mL，高壓蒸汽100 ℃滅菌10 min，迅速冷卻，測定葡萄糖含量，進行3次平行測定。

1.5.5.2 米飯總糖測定

取米水質量比達到1∶1.5的米飯100 g打漿，添加0.1 mL液化酶，95 ℃液化2 h，降溫至65 ℃，添加0.5 mL糖化酶糖化2 h，液化、糖化過程中加水，防止水分蒸干，糖化完畢充分過濾定容至1 000 mL，測定葡萄糖含量，進行3次平行測定。

1.5.6 蛋白酶活力測定

參考GB/T 23527—2009，測定復篩得到的菌株的酸性和中性蛋白酶活力[24]，進行3次平行測定。

1.5.7 發(fā)酵風味物質分析

將篩選出的菌株制備孢子懸液，調整孢子懸液濃度為1×107個/mL，按照1×106個/g米接種到米飯培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)5 d，每日無菌條件下攪拌3次，11 000 r/min，4 ℃離心15 min，取30 mL上清液，分別加入30、20、10 mL二氯甲烷在搖床中(100 r/min)萃取1 h、30 min、10 min，分液漏斗取有機相，減壓濃縮至5 mL，使用GC-MS測定風味物質。

氣相色譜條件：40 ℃保持5 min，以5 ℃/min升至180 ℃保持5 min，再以5 ℃/min升至260 ℃保持2 min；進樣口溫度280 ℃；氦氣流速1 mL/min；進樣量1 μL；不分流進樣。

質譜條件：離子源溫度300 ℃；傳輸通道溫度280 ℃；電離方式EI電離源；電子能量70 eV；質譜掃描范圍40～600 amu。

1.5.8 數據統(tǒng)計分析

利用Origin、Excel對實驗數據進行統(tǒng)計分析，分析結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 糖化菌初篩

目前普遍采用點植法純化霉菌，但此方法存在不足之處，霉菌具有蔓延生長和孢子易飛散的特點，點植時蘸取的孢子難以確定是由同一株菌繁殖產生，菌落相似的菌株更加難以分辨，不能達到純化的目的。本研究首先采用點植法多代培養(yǎng)，排除與所需分離菌株外觀不同的雜菌干擾，之后制取其孢子懸液涂布于培養(yǎng)基，以一點為中心生長且不與其他菌落生長相連的單菌落視為純菌落，即由單孢子繁殖而來，在整個平板所有菌落產孢子前盡快以接種針挑取保藏，此方法雖較繁瑣，但更加嚴謹。本研究以此方法從9種酒曲中初篩得到13株具有糖化菌特征的霉菌，初篩結果見表2。

表2 酒曲中菌株分離純化結果Table 2 Results of isolation and purification of strains from Jiuqu

2.2 糖化菌復篩

2.2.1 液化力的測定

在釀酒過程中，液化酶可將淀粉質原料水解為糊精、麥芽三糖、直鏈麥芽低聚糖及葡萄糖等微生物所需營養(yǎng)物質，有利于發(fā)酵的進行，對酒風味的形成也起到一定的促進作用，因此液化力是衡量菌株糖化能力的指標之一。在35 ℃，pH 4.6的條件下，記錄麩曲浸出液將淀粉完全液化的時間(以碘液檢驗)，以1 g 絕干曲1 h能液化的淀粉毫克數表示液化力，結果如圖1所示。菌株7M1、5M2、1M5、9M1、1M4、5M3均具有良好的液化力，液化力依次為(1 929±94.55)、(1 868±92.74)、(1 315±46.54)、(1 125±73.84)、(1 130±66.95)、(1 034±65.16) mg/(g·h)，其他菌株液化力均小于1 000 mg/(g·h)。

圖1 13株霉菌所制麩曲液化力Fig.1 Liquefying power of Fuqu made by 13 molds

2.2.2 糖化力的測定

糖化酶能將淀粉全部轉化為葡萄糖，也可以將淀粉液化產物轉化為葡萄糖，解決了部分微生物對非葡萄糖碳源利用率低或不能利用的問題，提高了淀粉利用率，因此糖化力能直接反映菌株糖化能力。在35 ℃，pH 4.6的條件下，用菲林法測定麩曲浸出液將淀粉轉化為葡萄糖的量，以1 g絕干曲1 h轉化可溶性淀粉生成葡萄糖的毫克數表示糖化力，結果如圖2所示。菌株5M2、1M5和7M1均具有較好的糖化力，糖化力依次為(1 556±15.56)、(1 252 ±63.78)、(1 054±21.11) mg/(g·h)，其他菌株糖化力均小于1 000 mg/(g·h)。

圖2 13株霉菌所制麩曲糖化力Fig.2 Saccharifying power of Fuqu made by 13 molds

在釀酒中，糖化酶水解液化產物為葡萄糖相比于直接水解淀粉更容易且迅速，因此在生產中，液化力和糖化力突出的菌株常搭配使用，達到最終糖化的目的。綜合分析，菌株1M5、5M2和7M1的液化力及糖化力均突出，具有單獨使用的潛力。

2.3 糖化菌形態(tài)學鑒定

將菌株1M5、5M2和7M1接種在PDA培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)3 d，觀察菌落形態(tài)及顯微形態(tài)，如圖3所示。

a-菌株1M5菌落正面、背面和顯微形態(tài)；b-菌株5M2菌落正面、背面和顯微形態(tài)；c-菌株7M1菌落正面、背面和顯微形態(tài)圖3 菌株1M5、5M2和7M1菌落及顯微形態(tài)Fig.3 Morphological characteristics of strains 1M5, 5M2 and 7M1

菌株1M5菌落的正面及背面初為白色，后中心變?yōu)楹谏⑾蜻吘墧U散，直徑達6 cm，邊緣不整齊，菌落疏松呈絮狀，菌絲發(fā)達。顯微觀察，孢囊梗直立叢生，不分支與假根對生，直徑達8～10 μm。孢子囊呈球形，直徑35～50 μm，孢子近似球形，直徑2.5～4 μm，符合根霉特征。

菌株5M2菌落正面初為白色，后中心變?yōu)槟G色并向邊緣擴散，背面呈淡黃色，有以接種點為中心放射狀溝紋，直徑達2.5 cm，邊緣整齊，顯微觀察，孢囊梗直徑達13～18 μm。孢子囊呈棒狀，長直徑達40～50 μm，孢子近似球形，直徑3～4.5 μm，符合棒曲霉特征。

菌株7M1菌落正面初為白色，后中心變?yōu)楹谏⑾蜻吘墧U散，背面呈淡黃色，直徑達3 cm。顯微觀察，孢囊梗與基地部位可見足細胞，孢囊梗直徑達13～18 μm。孢子囊呈球形，直徑35～45 μm，雙層小梗呈放射狀排列，孢子近似球形，直徑3～5 μm，符合黑曲霉特征。

2.4 糖化菌分子生物學鑒定

將菌株1M5，5M2和7M1的測序結果在NCBI進行BLAST比對，結合鄰接法構建進化樹，結果如圖4和圖5所示。

圖4 采用鄰接法構建菌株1M5與相關分類群的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Neighbor-joining phylogenetic tree of strain 1M5 and related taxa constructed

圖5 采用鄰接法構建菌株5M2、7M1與相關分類群的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Neighbor-joining phylogenetic tree of strains 5M2,7M1 and related taxa constructed

經BLAST比對，菌株1M5與RhizopusmicrosporusCNM-CM—5165 (JX120681.1)、菌株5M2與AspergillusclavatusHAk 2-M26 (KU052566.1)及菌株7M1與AspergillusnigerCMXY 25845 (MG991652.1)相似性均達到100%，在系統(tǒng)發(fā)育樹中也分別聚于同一分支，自展值均達到100%。結合形態(tài)學鑒定結果，可以確定菌株1M5為根霉屬的小孢根霉，菌株5M2為曲霉屬的棒曲霉，菌株7M1為曲霉屬的黑曲霉。

2.5 糖化菌糖化試飯效果

將小孢根霉1M5、棒曲霉5M2和黑曲霉7M1制成的麩曲，與實驗室保存的重陽酒曲做對比，接種到米飯中，使用SBA生物傳感分析儀測定米飯中葡萄糖含量，結果如圖6所示。

圖6 小孢根霉1M5、棒曲霉5M2、黑曲霉7M1所制麩曲和重陽酒曲糖化米飯生成的葡萄糖含量Fig.6 Glucose contents of rice saccharified by Chongyang Jiuqu and Fuqu made by strains Rhizopus microsporus 1M5, Aspergillus clavatus 5M2, Aspergillus niger 7M1

發(fā)酵0～24 h，自制酒曲中葡萄糖積累量增加緩慢，24～48 h，葡萄糖積累量快速增加；重陽酒曲中，12 h后葡萄糖開始大量積累，比自制酒曲更早進入葡萄糖積累快速增加階段；自制酒曲48～72 h葡萄糖積累緩慢增加，重陽酒曲48～60 h，葡萄糖積累緩慢增加，60～72 h出現(xiàn)葡萄糖積累量下降的情況，自制酒曲60～72 h積累量仍在上升。可知若4種酒曲應用到釀酒中，使用重陽酒曲所需糖化培菌時間更短，但自制酒曲可通過加大酒曲用量提前進入葡萄糖大量積累階段，并且縮短糖化時間。4種酒曲試飯葡萄糖積累量存在差異，小孢根霉7M1酒曲72 h試飯葡萄糖積累量最高、其次為重陽酒曲、棒曲霉1M5酒曲和黑曲霉5M2酒曲，每100 g米飯分別含(21.9±0.66)、(21.43±1.45)、(20.43±1.22)和(18.17±0.93) g葡萄糖。將未加入酒曲的米飯中添加液化酶、糖化酶使米飯全部糖化，測得100 g米飯含(32.67±1.01) g葡萄糖，通過計算，酒曲7M1、1M5和5M2的72 h試飯?zhí)腔史謩e為67.04%、62.55%和55.61%，重陽酒曲為65.51%。重陽酒曲60 h葡萄糖積累量達到最大，最大糖化率為69.79%，之后積累量下降，但自制酒曲60 h后葡萄糖仍在積累，具有超越重陽酒曲最大糖化率的潛力。綜上所述，篩選得到的小孢根霉1M5、棒曲霉5M2和黑曲霉7M1糖化能力良好，具有釀造米酒的潛力。

2.6 糖化菌蛋白酶活力測定

釀酒過程處于酸性和中性環(huán)境，原料中的蛋白質能夠被酒曲中微生物分泌的酸性和中性蛋白酶水解，能夠提供更多的碳源和氨基酸，促進微生物生長繁殖[25-27]，改善營養(yǎng)價值，并且對產品風味的形成起到重要作用[28-29]。因此制作了L-酪氨酸標準曲線，并使用Folin-酚法測定了小孢根霉1M5、棒曲霉5M2和黑曲霉7M1所制麩曲的酸性和中性蛋白酶活力。1 g絕干曲粉，在40 ℃和一定pH值(pH 3：酸性；pH 7.5：中性)條件下，以1 min水解酪蛋白產生酪氨酸的微克數，表示蛋白酶活力，結果如表3所示。

在L-酪氨酸標準液濃度范圍內(0～50 μg/mL)線性關系良好(R2=0.997 4，y=0.010 2x+0.003 3)，符合檢測要求。由表3可知，黑曲霉7M1酸性蛋白酶活力最大，其次為棒曲霉5M2和小孢根霉1M5。棒曲霉5M2中性蛋白酶活力最大，其次為小孢根霉1M5和黑曲霉7M1。綜合考慮，菌株5M2酸性和中性蛋白酶活力均較高，對整個發(fā)酵過程而言，更具有優(yōu)勢，因此篩選出菌株5M2并使用GC-MS分析其風味成分。

表3 小孢根霉1M5、棒曲霉5M2和黑曲霉7M1所制麩曲的酸性及中性蛋白酶活力Table 3 Acid and neutral protease activities of Fuqu made by strains Rhizopus microsporus 1M5, Aspergillus clavatus 5M2 and Aspergillus niger 7M1

2.7 棒曲霉5M2發(fā)酵風味物質測定

將棒曲霉5M2的孢子懸液接種到米飯培養(yǎng)基發(fā)酵，利用GC-MS對發(fā)酵代謝的風味物質進行測定。經過發(fā)酵后，培養(yǎng)基帶有淡淡的花香和果香。棒曲霉5M2發(fā)酵產生的主要特征風味物質共13種，如表4所示。分為4大類：酸類、烷烴類、酯類、醇類。3-甲基戊酸、苯甲醇、苯乙醇、苯乙酸、十五酸乙酯都有令人愉悅的香味，其中苯乙醇是米香型酒中主體香氣之一[30]，烷烴類、醇類和酸類化合物可以作為風味物質的前體物質，對產品的口感也起到一定的促進作用。

表4 棒曲霉5M2發(fā)酵主要風味物質Table 4 Main flavor compounds of Aspergillus clavatus 5M2

3 結論

(1)從酒曲中以孢子分離純化法初篩得到13株具有糖化菌特征的霉菌，經復篩并鑒定得到糖化能力突出的小孢根霉1M5、棒曲霉5M2和黑曲霉7M1，其液化力分別為(1 315±46.54)、(1 868±92.74)、(1 929±94.55) mg/(g·h)，糖化力分別為(1 252±63.78)、(1 556±15.56)、(1 054±21.11) mg/(g·h)。

(2)對小孢根霉1M5、棒曲霉5M2和黑曲霉7M1進行酸性及中性蛋白酶活力測定，結果表明菌株5M2分泌的蛋白酶更適用于發(fā)酵，其酸性及中性蛋白酶活力分別為(879±44.34)和(1 207±38.86) μg/(g·min)，對其進行發(fā)酵風味物質分析，發(fā)酵產生的3-甲基戊酸、苯甲醇、苯乙醇、苯乙酸和十五酸乙酯都有令人愉悅的香味。

(3)小孢根霉1M5、棒曲霉5M2和黑曲霉7M1在米酒釀造中具有應用潛力。