毛永強(qiáng)，李彥虎，贠建民，何奎，王睿，武淑娟

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州，730070)

隴西臘肉是一種甘肅傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品，已有300多年的歷史，是以漳縣、岷縣一帶蕨麻豬的五花肉為原料，添加食鹽、花椒、冰糖、小香、姜皮、桂皮、草果、豆蔻、桂籽、大香等十多種輔料，在冬臘月以傳統(tǒng)方式腌制而成[1]。隴西臘肉滋味純美，瘦肉紅燦，肥膘晶瑩，香味濃郁而不膩，深受西北民眾的喜愛[2]。但工藝落后、技術(shù)理論尚不完善已成為制約隴西臘肉發(fā)展的因素[3]。在工藝現(xiàn)代化改進(jìn)過程中，如何保持傳統(tǒng)產(chǎn)品的良好風(fēng)味至關(guān)重要。

發(fā)酵肉制品的風(fēng)味物質(zhì)主要包括揮發(fā)性和非揮發(fā)性兩大類，且揮發(fā)性化合物對制品整體風(fēng)味起關(guān)鍵性作用[4]。就目前研究進(jìn)展來看，揮發(fā)性風(fēng)味成分的形成途徑有3種，分別是Maillard 反應(yīng)[5]，營養(yǎng)物質(zhì)代謝[6-8]和微生物發(fā)酵作用[9-11]。對發(fā)酵肉制品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究已有不少報(bào)道，如郭昕等[12]檢測了3種不同類型臘肉的揮發(fā)性風(fēng)味成分時(shí)發(fā)現(xiàn)，各臘肉間既含共有香氣成分，又含特征香氣成分；宋永等[13]檢測哈爾濱風(fēng)干腸時(shí)發(fā)現(xiàn)，其關(guān)鍵風(fēng)味化合物是己酸乙酯、乙醇、己醛和丁酸乙酯；李鑫等[14]利用吹掃捕集/頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用分析金華火腿揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，共檢測出106種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)；趙改名等[15]研究發(fā)現(xiàn)金華火腿風(fēng)味物質(zhì)是在加工過程中逐步形成的，且不同階段風(fēng)味物質(zhì)的含量及其比例各具特征。

不同類型的發(fā)酵肉主體風(fēng)味成分不同，風(fēng)味物質(zhì)種類繁多，但并非所有的揮發(fā)性物質(zhì)都對產(chǎn)品的風(fēng)味有貢獻(xiàn)，氣味活性化合物的確定是食品風(fēng)味研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。目前，關(guān)于隴西臘肉風(fēng)味的研究已有報(bào)道，師希雄等[16]采用氣相-質(zhì)譜分析檢測了隴西臘肉中的風(fēng)味，共檢測出42種揮發(fā)性物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)萜烯類、醛類、含硫含氮及雜環(huán)類物質(zhì)等共同組成隴西臘肉的風(fēng)味基礎(chǔ)。但關(guān)于傳統(tǒng)隴西臘肉在制造過程中氣味活性物質(zhì)演變規(guī)律及關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)尚不明確，使得隴西臘肉在現(xiàn)代化工業(yè)生產(chǎn)中風(fēng)味控制技術(shù)的研發(fā)缺乏理論指導(dǎo)。

為此，本試驗(yàn)利用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS)技術(shù)對傳統(tǒng)隴西臘肉制作過程中揮發(fā)性組分進(jìn)行動態(tài)跟蹤檢測分析，以期明確隴西臘肉制作過程中揮發(fā)性物質(zhì)的變化規(guī)律，并明晰關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)，為今后隴西臘肉加工過程中風(fēng)味形成及調(diào)控提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

隴西臘肉：采自于甘肅省隴西縣大胡子傳統(tǒng)臘肉生產(chǎn)基地。

試劑：2-辛醇(色譜級)，美國 Sigma 公司；NaCl(分析純)，購置于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 7000D 安捷倫三重串聯(lián)四級桿氣質(zhì)聯(lián)用儀(配有 EI 離子源和NIST MS 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng))，美國 Agilent 公司；PAL3 自動三合一進(jìn)樣器系統(tǒng)，美國 Agilent 公司；SW-CJH-2FD超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品采集

臘肉樣品采自于甘肅隴西大胡子臘肉生產(chǎn)基地，跟蹤采集隴西臘肉一個(gè)批次生產(chǎn)完整過程。根據(jù)隴西臘肉制作過程關(guān)鍵時(shí)間節(jié)點(diǎn)，確定5個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)(表1)，采樣完成后樣品置于冰盒內(nèi)當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分樣，每份樣品不少于2.5 kg。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)需要采集3個(gè)平行樣品，然后充分混合均勻，準(zhǔn)確稱取樣品分裝于若干個(gè)無菌取樣管，并按照不同采樣時(shí)期編號，以上過程均在超凈工作臺內(nèi)完成，經(jīng)液氮冷凍后存于-80 ℃冰箱，以備進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測定，樣品具體分組信息如表1所示。

表1 樣品信息Table 1 Sample information

1.3.2 揮發(fā)性風(fēng)味檢測

(1)萃取條件：參照師希雄等[16]方法并做修改，具體過程為：準(zhǔn)確稱取10 g臘肉樣品、2 g NaCl于20 mL配有硅膠密封墊圈的玻璃瓶內(nèi)，在70 ℃水浴鍋加熱平衡10 min。然后將頂空萃取頭插入玻璃瓶內(nèi)，推出纖維頭進(jìn)行頂空萃取。萃取時(shí)間為30 min，萃取完成后，于245 ℃的GC-MS進(jìn)樣口解吸10 min。萃取不同樣品需老化萃取頭，老化時(shí)間3 min。

(2)GC條件：參照師希雄等[16]方法并做修改，使用毛細(xì)管色譜柱OV-1701(30 m×0.25 mm, 0.25 μm)，起始溫度30 ℃，保持1 min，以5 ℃/min的速率上升至180 ℃保持3 min，以4 ℃/min升溫至200 ℃，保持6 min，以20 ℃/min升溫至245 ℃，保持15 min；載氣(He)，流速1.0 mL/min。不分流進(jìn)樣。

(3)MS條件：參照師希雄等[16]方法并做修改，EI離子源：70 eV，離子源溫度230 ℃，傳輸線溫度為250 ℃，四級桿溫度為150 ℃，掃描質(zhì)量m/z為40～600。

按匹配度大于800，采用質(zhì)譜NIST譜庫檢索比對定性分析。采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行半定量分析，內(nèi)標(biāo)為2-辛醇，質(zhì)量濃度為88.01 μg/L。風(fēng)味物質(zhì)含量計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：X表示揮發(fā)性風(fēng)味成分的質(zhì)量濃度，μg/L；f代表內(nèi)標(biāo)物的校正因子，值為1；A表示揮發(fā)性風(fēng)味成分的相對峰面積百分比；C表示添加內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度；A0為測得內(nèi)標(biāo)物的相對峰面積。

(4)關(guān)鍵揮發(fā)性物質(zhì)評價(jià)

參照劉登勇等[17]方法并做修改。樣品中關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)采用相對氣味活度值(relative odor activity value，ROAV)分析法確定。在此之前，需要先確定對樣品風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的揮發(fā)性組分。

鑒于此，本研究采用氣味活度值(odor activity value, OAV)方法，即嗅感物質(zhì)的絕對濃度(C)與其感覺閾值(T)之間的比值，計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

根據(jù)(2)式定義，我們規(guī)定對樣品風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的揮發(fā)性組分ROAVmax=100，其他揮發(fā)性組分ROAV值計(jì)算如公式(3)所示：

(3)

式中：Ci和Cmax分別表示各揮發(fā)性組分的相對含量(%)和對樣品總體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大揮發(fā)性組分的相對含量(%)，Ti和Tmax表示各揮發(fā)組分的感覺閾值(μg/L)和對樣品總體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大組分的揮發(fā)性組分的感覺閾值(μg/L)，對樣品總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)越大，揮發(fā)性組分的ROAV值一般越大。

1.3.3 感官評價(jià)

參照孔曉雪等[18]方法，并做修改。選擇10位無飲食偏好的人員且經(jīng)過專業(yè)訓(xùn)練，組成感官評價(jià)小組，將各時(shí)期樣品分開蒸熟，切成厚度為0.5 cm的切片，分別以肉色、口感、氣味、滋味、組織狀態(tài)5項(xiàng)指標(biāo)對不同時(shí)期臘肉樣品品質(zhì)進(jìn)行評定，以此確定制作過程中感官品質(zhì)的變化。評分表見表2。

表2 感官評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)表Table 2 Standards for sensory evaluation

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2010和Origin 9.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理和繪制圖表，利用Heatmap軟件進(jìn)行風(fēng)味熱圖可視化，SPSS 19.0 進(jìn)行顯著性差異及主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 各時(shí)期揮發(fā)性化合物種類及含量變化

傳統(tǒng)隴西臘肉制作過程中揮發(fā)性化合物種類及含量變化如圖1、表3所示，各揮發(fā)性物質(zhì)中除酸類物質(zhì)外，其余各類揮發(fā)性化合物隨工序的進(jìn)行均呈上升趨勢。各時(shí)期共檢測出81種揮發(fā)性化合物，其中烴類13種，主要是苯乙烯；醛類19種，主要是己醛；酯類11種，主要是辛酸乙酯；醇類14種，主要為1-辛烯-3-醇；有機(jī)酸11種，主要是癸酸、己酸；酮類8種，主要是苯乙酮、3-羥基-2-丁酮；其他5種。按時(shí)期分：原料期(T0)58種，總含量1 362.06 μg/kg；腌制中期(T15)69種，總含量2 584.38 μg/kg；腌制后期(T30)79種，總含量4 473.05 μg/kg；風(fēng)干期(T60)77種，總含量2 255.84 μg/kg；成熟期(T90)76種，總含量2 926.59 μg/kg。臘肉中揮發(fā)性化合物含量的高低并不能代表其對風(fēng)味貢獻(xiàn)度的大小，要確定其對臘肉風(fēng)味貢獻(xiàn)的大小，還需進(jìn)一步分析。

表3 各時(shí)期樣品中揮發(fā)性物質(zhì)GC-MS檢測結(jié)果Table 3 GC-MS results of volatile compounds in samples of different periods

續(xù)表3

圖1 各時(shí)期樣品中揮發(fā)性物質(zhì)種類變化Fig.1 Variation of volatile substances in samples of different periods

2.2 揮發(fā)性化合物聚類分析

為進(jìn)一步確定各時(shí)期的香氣成分特點(diǎn)，將揮發(fā)性化合物進(jìn)行熱圖分析，結(jié)果見圖2。不同制作時(shí)期的樣品中揮發(fā)性物質(zhì)的組成及含量存在較大的差異。根據(jù)熱圖中不同時(shí)期揮發(fā)性物質(zhì)的聚類分析可知，樣品T30與樣品T60以及樣品T90聚在一起，說明腌制后期與風(fēng)干中期以及成品肉中揮發(fā)性物質(zhì)的組成及含量相似。而且，T30、T60、T90樣品中熱圖顏色以灰綠色、暗紅色為主，并且，藍(lán)紫色較少，說明揮發(fā)性物質(zhì)主要形成于隴西臘肉制作的中后期。

圖2 樣品中揮發(fā)性物質(zhì)含量熱圖Fig.2 Heat map of volatile substances in samples注：熱圖中藍(lán)紫色表示風(fēng)味物質(zhì)含量為零，顏色由綠色向紅色表示風(fēng)味物質(zhì)含量由低到高的變化

2.3 樣品ROAV分析

發(fā)酵肉的揮發(fā)性化合物中，對香氣起主要貢獻(xiàn)作用的通常僅是一小部分化合物。為進(jìn)一步挖掘隴西臘肉中對風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)的主體揮發(fā)性化合物，基于OAV法和ROAV法并結(jié)合揮發(fā)性物質(zhì)感覺閾值對其進(jìn)行篩選，根據(jù)每組樣品的平均值確定ROAV評分。

結(jié)果如表4所示，ROAV值為1～100的物質(zhì)總共有22種，ROAV值在0.1～1共有8種。其中ROAV≥1的烴類物質(zhì)主要是D-檸檬烯、苯乙烯、月桂烯；醛類物質(zhì)主要是3-甲基丁醛、辛醛、(E)-2-壬烯醛、己醛、壬醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、(E)-2-辛烯醛、(E)-2-庚烯醛、庚醛；脂類物質(zhì)主要是己酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸香葉酯、乙酸乙酯；醇類物質(zhì)主要是1-辛烯-3-醇和芳樟醇；酮類物質(zhì)主要是2,3-辛二酮，除此之外，還有2-戊基呋喃、茴香醚。初步證明這些化合物是臘肉制作過程中對風(fēng)味起主要貢獻(xiàn)的物質(zhì)。另外，由于烷烴、有機(jī)酸類物質(zhì)感覺閾值比較高，對風(fēng)味貢獻(xiàn)作用不明顯。

表4 隴西臘肉中關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)確定Table 4 Determination of key volatile flavor substances of Longxi bacon

2.4 樣品主成分分析

主成分分析方法主要研究ROAV≥1的風(fēng)味物質(zhì)，并提取主成分特征值不小于1的主成分，所得結(jié)果如表5所示,前3個(gè)主成分的累積方差貢獻(xiàn)率為86.49%。

表5 主成分特征值及方差貢獻(xiàn)率Table 5 principal component eigenvalues and variance contribution rates

圖3-A、圖3-B為隴西臘肉制作過程中關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)的主成分載荷圖。分別以第一主成分為橫坐標(biāo)，第二和第三主成分為縱坐標(biāo)作圖，此圖說明了關(guān)鍵的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)對主成分的影響。由表5可知，其第一、第二和第三的方差貢獻(xiàn)率分別是34.98%、31.12%和20.39%。其中，PC1中載荷正向最高的物質(zhì)S19(己酸乙酯)，載荷負(fù)向最高的物質(zhì)為S20(辛酸乙酯)；PC2中載荷正向最高的物質(zhì)為S16(己醛)，負(fù)向最高的物質(zhì)為S13(3-甲基丁醛)；PC3載荷正向最高的物質(zhì)為S28(芳樟醇)，載荷負(fù)向最高的物質(zhì)為S12[(E)-2-辛烯醛]。上述結(jié)果說明己酸乙酯、茴香醚、己醛、3-甲基丁醛、(E)-2-辛烯醛和芳樟醇是不同時(shí)期樣品中風(fēng)味物質(zhì)含量有明顯差異的揮發(fā)性物質(zhì)，能很好的區(qū)分各時(shí)期的樣品。

圖3 隴西臘肉關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主成分載荷圖Fig.3 Load diagram of principal components of key volatile flavor substances of Longxi bacon注：圖中字母分別與表4相對應(yīng)

同時(shí)，不同時(shí)期的樣品分別位于4個(gè)象限，并且主成分1、2、3能很好地區(qū)分不同時(shí)期的樣品，但風(fēng)干后期(T60)與成品期(T90)始終位于同一象限，與熱圖(圖2)聚類結(jié)果相似，說明這2個(gè)時(shí)期內(nèi)關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)相似，并且主體風(fēng)味物質(zhì)主要在這兩個(gè)時(shí)期內(nèi)形成。

2.5 感官評價(jià)結(jié)果分析

臘肉感官品質(zhì)直接決定了消費(fèi)者的飲食偏好。因此，開展感官評價(jià)對于把握其品質(zhì)變化顯得尤為重要。由表6、圖4可知，隴西臘肉總體感官評分隨著制作過程進(jìn)行逐漸增加，其中成品肉評分最高為 95.3分，說明隨著制作過程的變化和時(shí)間延長，臘肉品質(zhì)日益良好，尤其表現(xiàn)在肉色、口感、氣味、組織狀態(tài)方面，但滋味評分在腌制期內(nèi)(T15、T30)有所降低，這是由于腌制期內(nèi)氯化鈉分布不均勻，導(dǎo)致肉胚內(nèi)、外層咸味不均一所致。

表6 感官評分結(jié)果 單位：分Table 6 Sensory score results

圖4 感官評價(jià)雷達(dá)圖Fig.4 Sensory evaluation radar map

3 討論

傳統(tǒng)隴西臘肉制作過程中的揮發(fā)性化合物的變化情況不同。檢測出的醛類物質(zhì)在種類(19種)和含量(4 162.13 μg/kg)上都是最豐富的，主要是己醛、辛醛、壬醛、3-甲基丁醛和(E)-2-庚烯醛等，這些物質(zhì)的含量在臘肉制作過程中變化趨勢不同，其中己醛在腌制中期(T30)時(shí)含量最高，壬醛則在成熟期(T90)時(shí)含量最高。研究發(fā)現(xiàn)，醛類物質(zhì)主要是脂肪氧化產(chǎn)生[20]，己醛主要是亞油酸和花生四烯酸的產(chǎn)物[21]，而壬醛則是油酸氧化產(chǎn)生[22]，己醛和壬醛分別具有青香味和脂肪味，對臘肉風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)。3-甲基丁醛風(fēng)味閾值很低，只有0.2 μg/kg，且具有堅(jiān)果香味[23]，對臘肉整體風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)作用。

醇類物質(zhì)也是隴西臘肉中含量(2 736.47 μg/kg)較高的化合物，在整個(gè)過程中，其含量呈上升趨勢。ROAV分析結(jié)果來看，主要風(fēng)味貢獻(xiàn)物質(zhì)是1-辛烯-3-醇和芳樟醇。其中，1-辛烯-3-醇閾值較低，是脂肪酸氧化的產(chǎn)物，可賦予臘肉蘑菇味、柑橘和玫瑰氣味，還可增強(qiáng)肉中的脂肪香味[24]，也有研究發(fā)現(xiàn)1-辛烯-3-醇是火腿中的重要風(fēng)味物質(zhì)[23]。芳樟醇在原料肉(T0)中未發(fā)現(xiàn)，在腌制期開始檢出，可能是由于香辛料添加的結(jié)果。芳樟醇呈現(xiàn)花香和薄荷香氣，可為臘肉提供良好的風(fēng)味[25]。但是，醇類風(fēng)味閾值相對較高，可能對臘肉風(fēng)味的整體貢獻(xiàn)率較低[24]。

檢出的酮類和酯類物質(zhì)含量相對較低，在整個(gè)過程中，酮類物質(zhì)呈先增后降的趨勢，酯類物質(zhì)一直呈上升趨勢。本研究結(jié)果顯示，隴西臘肉中酯類物質(zhì)主要是己酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸香葉酯和乙酸乙酯，而這些物質(zhì)主要呈現(xiàn)菠蘿味等水果味[26]，是隴西臘肉中重要的風(fēng)味來源，這些酯類物質(zhì)與廣式臘肉中酯類物質(zhì)構(gòu)成相似[12]；酮類物質(zhì)主要是2,3-辛二酮, 其風(fēng)味閾值也較低，為3 μg/kg，具有奶油香味，對臘肉香氣形成有重要作用，白衛(wèi)東等[27]在廣式臘肉中也檢出了此類物質(zhì)。其他類物質(zhì)中2-戊基呋喃含量較高，其閾值也相對較低，呈植物芳香味[28]，研究發(fā)現(xiàn)2-戊基呋喃是臘肉中都含有的重要風(fēng)味化合物[29]。

隨著工序變化，隴西臘肉感官品質(zhì)(肉色、口感、氣味、組織狀態(tài)、滋味)日益良好，感官評分結(jié)果與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的組成和變化的變化趨勢基本一致，這表明揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分和含量的變化直接影響了臘肉的感官特性，是評價(jià)臘肉品質(zhì)的重要指標(biāo)。傳統(tǒng)隴西臘肉屬自然發(fā)酵肉制品，微生物作用也是其制作過程中風(fēng)味形成的重要因素，這也是后期研究的方向。總之，構(gòu)成臘肉風(fēng)味的物質(zhì)基礎(chǔ)豐富多樣，而且風(fēng)味形成反應(yīng)機(jī)制復(fù)雜，要完全明晰風(fēng)味形成機(jī)理還需進(jìn)行大量研究。

4 結(jié)論

本研究采用SPME-GC-MS技術(shù)對傳統(tǒng)隴西臘肉制作過程中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化進(jìn)行動態(tài)檢測分析，共鑒定出烴類、醛類、酯類、醇類、有機(jī)酸、酮類等揮發(fā)性成分共81種。在臘肉制作的不同時(shí)期(T0、T15、T30、T60、T90)，各種揮發(fā)性物質(zhì)的含量表現(xiàn)出一定的變化規(guī)律：揮發(fā)性物質(zhì)總量呈先增高后降低的趨勢，在腌制后期(T30)時(shí)達(dá)到最高，為4 473.05 μg/kg；樣品中醛類物質(zhì)含量最高，其次是醇類物質(zhì)。ROAV分析結(jié)果顯示醛類、酮類、酯類物質(zhì)對風(fēng)味貢獻(xiàn)最大；主成分分析結(jié)果表明己酸乙酯、茴香醚、己醛、3-甲基丁醛、(E)-2-辛烯醛和芳樟醇是各時(shí)期樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量差異明顯的化合物，能很好的區(qū)分各時(shí)期的樣品。感官評分結(jié)果表明，樣品在各評價(jià)指標(biāo)上的評分隨著加工時(shí)期的延長而增高，在成品期 (T90) 時(shí)最高，表明傳統(tǒng)隴西臘肉在整個(gè)制作過程中風(fēng)味逐漸變好。