王少曼，張彥軍，吳剛，徐飛，胡榮鎖，譚樂和

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 香料飲料研究所，海南 萬寧, 571533)

菠蘿蜜(ArtocarpusheterophyllusLam.)又稱波羅蜜，屬于?？?Moraceae)波羅蜜屬(Artocarpus)植物，是典型的特色熱帶果樹和木本糧作物，主要分布在印度、孟加拉國、中國和一些東南亞熱帶地區(qū)[1-2]。菠蘿蜜果肉占果實重量的30%～35%，果肉肥厚、香味濃郁，被譽為“熱帶水果皇后”，富含菠蘿蜜多糖、酚類化合物、類胡蘿卜素等生物活性物質(zhì)，具有抗氧化、輔助降血糖、提高免疫力等有益的生理作用[3-6]。但是由于菠蘿蜜鮮果肉的高糖低酸環(huán)境，其極易遭受腐敗微生物的侵染而縮短其儲藏期從而限制其商業(yè)化應(yīng)用。菠蘿蜜果酒作為菠蘿蜜果肉的精深加工產(chǎn)品，可提高菠蘿蜜產(chǎn)品的附加值，目前對于菠蘿蜜果酒的研究報道主要集中在菠蘿蜜果酒的菌種選育[7]、發(fā)酵工藝[8]、香氣成分[9]、生物活性成分[10]和抗氧化活性評價[11]研究，而關(guān)于菠蘿蜜果酒發(fā)酵過程酵母菌體生長、還原糖基質(zhì)消耗和乙醇產(chǎn)量生成的動力學(xué)變化規(guī)律尚未研究報道。

菠蘿蜜果酒發(fā)酵過程中酵母菌體生長、還原糖基質(zhì)消耗和乙醇產(chǎn)量生成的變化都存在一定的規(guī)律。微生物發(fā)酵動力學(xué)主要討論的正是微生物發(fā)酵過程中菌體生長、底物消耗和產(chǎn)物生成之間的動態(tài)平衡和內(nèi)在規(guī)律，通過數(shù)學(xué)模型定量描述發(fā)酵過程的速率及影響速率的因素[12]。目前，許多研究已通過建立不同發(fā)酵型果酒如紅心火龍果酒[13]、仙人掌果酒[14]、山葡萄酒[15]、草莓果酒[16]、芒果酒[17]等的發(fā)酵動力學(xué)模型來描述酵母數(shù)目、糖消耗和乙醇生成量的規(guī)律，研究結(jié)果表明Logistic 、SGompertz、Boltzmann和DoseResp均能較好地體現(xiàn)菌體濃度、底物濃度和生成物濃度間的關(guān)系。然而，每種果酒因自身發(fā)酵環(huán)境不同而適用的發(fā)酵動力學(xué)模型存在一定差異。

本研究擬采用經(jīng)典的Logistic、SGompertz、Boltzmann和DoseResp，對菠蘿蜜果酒發(fā)酵過程中酵母菌體生長、還原糖基質(zhì)消耗和乙醇產(chǎn)量生成的變化規(guī)律進(jìn)行非線性擬合，建立菠蘿蜜果酒分批發(fā)酵動力學(xué)模型，為菠蘿蜜果酒的分批發(fā)酵向連續(xù)發(fā)酵的過渡和工業(yè)化發(fā)酵工藝控制提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菠蘿蜜，品種為香飲所11號，采摘于海南省萬寧市興隆熱帶植物園；RV171型葡萄酒活性干酵母(Saccharomycescerevisiae)，安琪酵母股份有限公司；果膠酶(500 U/mg，BR級)，上海源葉生物科技有限公司；亞硫酸氫鈉(分析純)，阿拉丁試劑(上海)有限公司；3, 5-二硝基水楊酸(化學(xué)純)，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉、無水乙醇、四水合酒石酸鉀鈉、苯酚、無水亞硫酸鈉、蔗糖、葡萄糖(分析純)，西隴科學(xué)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AL104電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；HX-PB908多功能料理機，佛山市海迅電器有限公司；DK-98-11A電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；手持糖量折光儀(WZS-80)，上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司；LRH-250F生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；GI54DW自動壓力蒸汽滅菌鍋，致微(廈門)儀器有限公司；HR50-ⅡA2生物安全柜，青島海爾特種電器有限公司；血球計數(shù)板，上海市求精生化試劑儀器有限公司；CX31RTSF生物顯微鏡，奧林巴斯(中國)有限公司；SPECORD 250PLUS紫外/可見分光光度計，德國耶拿分析儀器股份公司；Z36HK臺式高速冷凍離心機，賀默(上海)儀器科技有限公司；酒精計，河北省武強縣華歐儀器儀表廠；TC-15套氏恒溫器，海寧市新華醫(yī)療器械廠；DLSB-5L-10 ℃低溫冷卻液循環(huán)泵，鞏義市河洛大研儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 菠蘿蜜果酒發(fā)酵工藝流程

菠蘿蜜果酒發(fā)酵工藝流程如下：

菠蘿蜜果實→去果皮和種子、取果肉→打漿→酶解→調(diào)節(jié)糖度→滅菌→接種→恒溫發(fā)酵培養(yǎng)→菠蘿蜜果酒→樣品測定

挑選成熟、無病蟲害腐爛的菠蘿蜜果實，切分除去果皮和種子，取出果肉，按照1∶2(g∶mL)比例添加蒸餾水打漿。用40 mg/L的果膠酶進(jìn)行果漿酶解，酶解溫度為45 ℃，酶解時間為3 h。添加蔗糖調(diào)整菠蘿蜜果漿糖度至21 °Bx。加入一定量的亞硫酸氫鈉使果漿中的SO2含量達(dá)40 mg/L。果漿在60 ℃ 條件下滅菌30 min，然后冷卻至室溫，接種活化后的酵母(將一定量的干酵母用10倍量的含有1/3菠蘿蜜果漿和2/3滅菌蒸餾水的混合液在35 ℃條件下活化30 min)，使果漿中的干酵母用量達(dá)400 mg/L。恒溫發(fā)酵一段時間得到菠蘿蜜果酒樣品，發(fā)酵控溫為24 ℃，發(fā)酵時間為168 h，每24 h取樣分析測定。

1.3.2 檢測方法

1.3.2.1 酵母菌數(shù)量檢測

根據(jù)胡永正等[18]的方法有所改動，采用血球計數(shù)板對果酒發(fā)酵液中酵母菌數(shù)直接計數(shù)，實驗所用計數(shù)板為25×16型。取果酒發(fā)酵液用無菌水稀釋至適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，取少量滴在血球計數(shù)板上，蓋上蓋玻片，在生物顯微鏡下觀察計數(shù)酵母菌個數(shù)。按公式(1)計算酵母菌數(shù)量：

酵母菌數(shù)/(CFU·mL-1)

(1)

1.3.2.2 還原糖含量檢測

采用3, 5-二硝基水楊酸(3, 5-dinitrosalicylicacid, DNS)比色法測定果酒發(fā)酵液中的還原糖含量[19]。DNS試劑按照農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)配制，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.436 1x+0.067 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 4。

1.3.2.3 酒精度檢測

按照GB 5009.225—2016《食品國家安全標(biāo)準(zhǔn) 酒中乙醇濃度的測定》規(guī)定[20]，發(fā)酵液先蒸餾，然后采用酒精計法測定菠蘿蜜果酒中的酒精度。酒精度表示在20 ℃條件下的乙醇體積分?jǐn)?shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

1.4.1 數(shù)據(jù)處理

每組實驗重復(fù)3個平行，結(jié)果取其平均值，采用Origin 9.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計與作圖分析，選取合適的動力學(xué)模型對酵母菌體生長、還原糖基質(zhì)消耗和乙醇產(chǎn)量生成情況進(jìn)行非線性擬合，并利用每個模型的擬合系數(shù)R2作為可靠性評價標(biāo)準(zhǔn)來篩選出擬合度高的動力學(xué)模型進(jìn)行定量描述。

1.4.2 發(fā)酵動力學(xué)模型

酵母菌體生長動力學(xué)模型擬合：根據(jù)實驗數(shù)據(jù)分析，酵母菌體的生長呈“S”型曲線，結(jié)合經(jīng)驗?zāi)Ｐ?，選取Logistic、SGompertz和Botlezman模型進(jìn)行非線性擬合，選取擬合R2系數(shù)最大的模型對描述酵母菌體生長規(guī)律[14]。

乙醇產(chǎn)量生成動力學(xué)模型擬合：乙醇是酵母菌轉(zhuǎn)化糖類代謝而生成的產(chǎn)物，其生成速率與酵母細(xì)胞生長速率有密切聯(lián)系，屬于生長偶聯(lián)型，呈現(xiàn)“S”型曲線，因此選用Logistic、SGompertz和Botlezman經(jīng)典模型對其進(jìn)行非線性擬合，選用擬合系數(shù)R2最大的模型描述乙醇產(chǎn)量生成[21]。

還原糖基質(zhì)消耗動力學(xué)模型擬合：酵母發(fā)酵果酒過程消耗還原糖基質(zhì)作為能量來源并產(chǎn)生乙醇，因此選用Logistic、DoseResp與Botlzman模型進(jìn)行非線性擬合，選用擬合系數(shù)R2最大的模型描述還原糖基質(zhì)消耗情況[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菠蘿蜜果酒發(fā)酵過程中酵母菌數(shù)、還原糖含量和酒精度變化趨勢

釀酒酵母(S.cerevisiae)分批發(fā)酵菠蘿蜜果漿過程中酵母菌數(shù)、還原糖含量和酒精度變化如圖1所示。釀酒酵母經(jīng)過稀濃度菠蘿蜜果漿的活化后能快速適應(yīng)高濃度菠蘿蜜果漿的發(fā)酵環(huán)境，在48 h的發(fā)酵期，由于養(yǎng)分充足酵母菌數(shù)進(jìn)入對數(shù)生長期，呈指數(shù)趨勢生長。隨后因為還原糖基質(zhì)的消耗和乙醇代謝產(chǎn)物的積累，酵母菌體的生長速率下降，細(xì)胞死亡速率上升，當(dāng)兩者狀態(tài)平衡時，酵母菌數(shù)進(jìn)入穩(wěn)定期[22]，此時酵母菌數(shù)最高達(dá)到5.27×108CFU/mL。96 h后酵母菌數(shù)開始進(jìn)入衰亡期，可能是發(fā)酵環(huán)境中還原糖基質(zhì)和酵母細(xì)胞內(nèi)所儲能量消耗殆盡，酵母細(xì)胞在自身酶的作用下發(fā)生自溶而導(dǎo)致酵母菌數(shù)量的減少[23]。釀酒酵母發(fā)酵菠蘿蜜果漿過程消耗還原糖基質(zhì)產(chǎn)生酒精，體系中的還原糖含量隨著發(fā)酵時間的增加而減少，至72 h時基本被酵母菌消耗完全，含量下降至3.30 g/L，與酵母菌體的生長時間點相一致。酒精是酵母菌厭氧發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)化糖類代謝而生成的產(chǎn)物。酒精度隨著發(fā)酵時間的延長呈逐漸上升的趨勢，發(fā)酵48 h前，因酵母菌的快速增長和還原糖的快速消耗，酒精亦快速生成，到達(dá)72 h時，酒精度達(dá)到最大值，為10.8%vol，表明酒精的生成與酵母菌生長和還原糖消耗是相對應(yīng)的。

圖1 菠蘿蜜果酒發(fā)酵過程中酵母菌數(shù)、還原糖含量和酒精度變化規(guī)律Fig.1 Changes of yeast count, reducing sugar content and alcohol content during fermentation of jackfruit wine

2.2 菠蘿蜜果酒發(fā)酵動力學(xué)模型的建立

2.2.1 酵母菌體生長動力學(xué)模型

由圖1可知，釀酒酵母在菠蘿蜜果漿的發(fā)酵環(huán)境中96 h后進(jìn)入菌體衰亡期，而在發(fā)酵0～96 h處在對數(shù)生長期和穩(wěn)定期，因此本研究擬對發(fā)酵0～96 h時期的酵母菌體生長情況進(jìn)行非線性擬合。Logistic、SGompertz和Boltzmann模型對酵母菌體生長情況的非線性擬合結(jié)果如表1和圖2所示。由圖2的擬合曲線分析可知，模型擬合下的酵母菌生長曲線在菠蘿蜜果酒發(fā)酵72 h后趨于穩(wěn)定，在72 h時酵母菌體數(shù)量達(dá)到最高值。從表1的擬合方程和擬合系數(shù)分析可知，3種模型均能很好地預(yù)測酵母菌體的生長狀況。相比于Logistic模型(R2為0.993 59)和SGompertz模型(R2為0.992 03)，Boltzmann模型的擬合系數(shù)R2為0.993 96，對酵母菌的生長情況的擬合效果最佳。因而Boltzmann模型比其他2個模型更適合對菠蘿蜜果酒中酵母菌生長情況進(jìn)行定量描述。

表1 酵母菌體生長的擬合方程及其擬合系數(shù)Table 1 Fitting equation of yeast growth and its fitting coefficient

2.2.2 乙醇產(chǎn)量生成動力學(xué)模型

采用Logistic、SGompertz和Boltzmann模型對菠蘿蜜果酒發(fā)酵過程乙醇產(chǎn)量生成情況進(jìn)行擬合，菠蘿蜜果酒發(fā)酵過程酒精度實際值與擬合曲線如圖3所示。3種模型擬合下的酒精生成曲線與圖2中的酵母菌生長曲線基本同步，酵母菌在對數(shù)生長期內(nèi)代謝產(chǎn)生酒精的增長速度迅速增加，酒精度在菠蘿蜜果酒發(fā)酵72 h后趨于穩(wěn)定，在72 h時酒精度達(dá)到最大值。3種模型的擬合方程和擬合系數(shù)如表2所示，Logistic、SGompertz和Boltzmann模型的擬合系數(shù)R2分別為0.997 94、0.999 05和0.999，SGompertz和Boltzmann模型的R2比Logistic模型的R2值更趨近于1.0，說明SGompertz和Boltzmann模型均能較好地描述菠蘿蜜果酒發(fā)酵過程乙醇的動態(tài)增長過程。

表2 乙醇產(chǎn)量生成的擬合方程及其擬合系數(shù)Table 2 Fitting equation of ethanol production and its fitting coefficient

a-Logistic模型；b-SGompertz模型；c-Boltzmann模型圖2 發(fā)酵動力學(xué)模型下的酵母菌生長擬合曲線Fig.2 Growth fitting curve of yeast under fermentation kinetics model

a-Logistic模型；b-SGompertz模型；c-Boltzmann模型圖3 發(fā)酵動力學(xué)模型下的乙醇產(chǎn)量生成擬合曲線Fig.3 Fit curve of ethanol production under fermentation kinetics model

2.2.3 還原糖基質(zhì)消耗動力學(xué)模型

Logistic、DoseResp和Boltzmann模型對還原糖含量的擬合方程、擬合系數(shù)和擬合曲線見表3和圖4。由圖4可知，3種模型對還原糖的擬合曲線趨勢基本一致，在菠蘿蜜果酒發(fā)酵的前72 h，還原糖消耗量逐漸增大，在發(fā)酵72 h后，酵母菌數(shù)和酒精度的變化趨于穩(wěn)定，還原糖含量變化亦趨于穩(wěn)定，這也表明菠蘿蜜果酒主發(fā)酵的結(jié)束。由表3可知，3種模型對于還原糖基質(zhì)的消耗擬合效果相較于酵母菌數(shù)和酒精度的較差，Logistic、DoseResp和Boltzmann模型的擬合系數(shù)R2分別為0.978 46、0.987 05和0.987 05，DoseResp和Boltzmann模型的擬合系數(shù)一致，均高于Logistic模型，說明2種模型均能較好地反映菠蘿蜜果酒發(fā)酵過程還原糖消耗的變化。

表3 還原糖基質(zhì)消耗的擬合方程及其擬合系數(shù)Table 3 Fitting equation of reducing sugar consumption and its fitting coefficient

a-Logistic模型；b-DoseResp模型；c-Boltzmann模型圖4 發(fā)酵動力學(xué)模型下的還原糖基質(zhì)消耗擬合曲線Fig.4 Fit curve of reducing sugar consumption under fermentation kinetics model

在微生物的生長過程中，最活躍的時期是對數(shù)生長期，伴隨營養(yǎng)物質(zhì)的貯存和初級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，微生物的發(fā)酵行為可通過數(shù)學(xué)模型被清楚地描繪[24]。李雪等[14]應(yīng)用Logistic、SGompertz、DoseResp和Boltzmann模型對仙人掌果酒的酵母菌數(shù)、酒精度、還原糖量進(jìn)行非線性擬合，擬合度均大于0.99。張琪等[22]采用Logistic、DoseResp、Boltzmann和SGompertz等模型對黑加侖果酒發(fā)酵過程的擬合結(jié)果均呈現(xiàn)較好的擬合效果。李俠等[21]同樣用上述4個模型擬合紅棗酒的發(fā)酵過程，分別呈現(xiàn)出SGompertz、Boltzmann和 DoseResp模型對酵母生長、乙醇生成、還原糖消耗的擬合度最高，研究結(jié)果與本研究的情況一致，本研究采用SGompertz、Boltzmann模型對乙醇產(chǎn)量生成的擬合系數(shù)能達(dá)到0.999。而實驗中DoseResp和Boltzmann模型對還原糖的擬合系數(shù)只有0.98，與張琪等[25]的研究情況一致，可能是由于釀酒酵母生長繁殖旺盛，在72 h時已將還原糖幾乎消耗完全，實驗值低于擬合模型的預(yù)測值。

3 結(jié)論

本研究采用經(jīng)典的Logistic、SGompertz、Boltzmann和DoseResp發(fā)酵動力學(xué)模型對菠蘿蜜果酒分批發(fā)酵過程的酵母菌體生長、還原糖基質(zhì)消耗和乙醇產(chǎn)量生成進(jìn)行非線性擬合，選用擬合系數(shù)R2對擬合模型進(jìn)行可靠性評價。模型均能較好的描述菠蘿蜜果酒發(fā)酵過程的動力學(xué)特征，Boltzmann模型能更好地適用于酵母菌體生長、還原糖基質(zhì)消耗和乙醇產(chǎn)量生成的模擬。本實驗的發(fā)酵動力學(xué)研究可以預(yù)測實驗指標(biāo)，從而為菠蘿蜜果酒大型的發(fā)酵工藝控制提供理論基礎(chǔ)。