何佳佳，王培曉，矯寧，邱爽，朱雄偉，吳鳳東，張慶（.解放軍總醫(yī)院第三醫(yī)學(xué)中心器官移植科，北京 0009，2.安徽醫(yī)科大學(xué)，安徽 合肥 2002，.河南省兒童醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 鄭州 45008）

肝癌是全世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，其中肝細(xì)胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的類型，約占原發(fā)性肝癌的85% ～ 90%［1-3］。在我國約 80%以上的 HCC 患者為乙肝相關(guān)性肝癌，但其具體的發(fā)病機(jī)制尚未明確。PPP2R3A 是蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）的一個調(diào)節(jié)亞基，既能參與PP2A 的活性調(diào)節(jié)，還參與腫瘤相關(guān)信號蛋白的調(diào)節(jié)。有研究顯示PPP2R3A-PP2A 全酶呈現(xiàn)出類似于原癌基因作用，并可能影響腫瘤細(xì)胞的侵襲能力［4］。但是目前關(guān)于PPP2R3A 與乙肝相關(guān)性肝癌的相關(guān)研究尚無報道。本研究旨在探索PPP2R3A 在乙肝相關(guān)性肝癌中的表達(dá)及其臨床意義。

1 材料和方法

1.1 一般資料：收集2009-2012 年在解放軍總醫(yī)院第三醫(yī)學(xué)中心行肝移植的70 例乙肝相關(guān)性肝癌和40 例良性肝病患者的病肝組織和外周血標(biāo)本，所有乙肝相關(guān)性肝癌患者均經(jīng)病理及血清學(xué)證實(shí)。70 例乙肝相關(guān)性肝癌組織為研究組，40 例良性肝?。òㄒ腋胃斡不?5 例、丙肝肝硬化3 例、肝豆?fàn)詈俗冃? 例、自身免疫性肝病3 例、膽汁淤積性肝硬化3 例、布加綜合征1 例和酒精性肝病1 例）和5 例正常肝組織作為對照組。收集70 例肝癌患者的臨床資料，包括腫瘤大小、TNM 分期、Child-Pugh 分級、術(shù)前血清甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）值、病理分期等，其中男性67 例，女性3 例，年齡為30 ～ 69 歲，中位年齡為53 歲。

1.2 試劑與方法

1.2.1 主要試劑：抗體PPP2R3A 試劑盒購自美國Sigma 公司；二步法檢測試劑盒和第二抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；酶聯(lián)免疫吸附劑測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購于上海藍(lán)基生物科技有限公司。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.2.1 免疫組織化學(xué)染色法：選取乙肝相關(guān)性肝癌、良性肝病、供體肝組織病理切片分別70、40、5 張，標(biāo)本均經(jīng)40 g/L 中性甲醛固定，石蠟包埋，4 μm 厚度連續(xù)切片，然后按照免疫組織化學(xué)二步法試劑說明書進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。一抗采用PPP2R3A 抗體（Sigma 公司），濃度為 1：200，二抗采用山羊抗兔IgG 抗體（中杉金橋公司），以羊血清替代一抗作為陰性對照。

染色結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)：評分采用著色深淺和陽性細(xì)胞比例相結(jié)合的方法，無著色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分；陽性細(xì)胞數(shù)＜5%為0 分，5%～25%為1 分，26%～50%為2 分，＞50%為3 分；染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)和陽性細(xì)胞百分比分?jǐn)?shù)相乘得到染色分?jǐn)?shù)，0 分為陰性，1 ～3 分為 +，4 ～ 6 分為 ++，7 ～ 9 分為 +++。

1.2.2.2 ELISA 法：從免疫組化中-強(qiáng)陽性表達(dá)患者中挑選30 例肝癌患者和15 例良性肝病患者的血清標(biāo)本，從-80℃冰箱中取出逐步解凍，按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，酶標(biāo)儀調(diào)至450 nm讀數(shù)，讀取樣本吸光度（OD 值），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣本中PPP2R3A 蛋白的表達(dá)濃度。

1.3 倫理學(xué)：本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，得到醫(yī)院倫理委員會審批（審批號：2014012）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS 25 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（±s）表示，兩組間定性資料的比較采用Pearson 卡方檢驗(yàn)，定量資料的比較采用兩相關(guān)樣本W(wǎng)ilcoxon 秩檢驗(yàn)及兩獨(dú)立樣本Mann-Whitney U 秩和檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman 等級相關(guān)檢驗(yàn)，P ＜0.05 認(rèn)為結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 PPP2R3A 蛋白在肝癌組織中的表達(dá)情況：PPP2R3A 陽性結(jié)果為棕黃色顆粒或團(tuán)塊，主要定位于細(xì)胞胞質(zhì)，部分表達(dá)在胞膜上（圖1A，圖1B）。在70 例乙肝相關(guān)性肝癌組織中，PPP2R3A陽性表達(dá)率100%（70/70），其中中-強(qiáng)陽性表達(dá)率占68.6%（48/70），癌周組織中PPP2R3A 陽性表達(dá)率44.3%（31/70），其中呈中- 強(qiáng)陽性表達(dá)率只有12.8%（9/70），統(tǒng)計學(xué)分析顯示：PPP2R3A 蛋白在癌組織的表達(dá)顯著高于其癌周組織（P ＜ 0.001），見表 1。

圖1 PPP2R3A 在不同肝組織中的表達(dá)與定位

2.2 PPP2R3A 蛋白在良性肝病組織中的表達(dá)情況：PPP2R3A 蛋白在良性肝病中主要表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)（圖1C），部分表達(dá)于胞膜和胞核，陰性表達(dá)和弱陽性表達(dá)占65%（26/40），無強(qiáng)陽性表達(dá)，詳見表1。其中，PPP2R3A 蛋白在乙肝肝硬化組織中的陽性（++）表達(dá)率占40%（10/25），丙肝肝硬化組織占 33%（1/3），非病毒性良性肝病組織占25%（3/12）。PPP2R3A 蛋白在嗜肝病毒性肝病組織中的表達(dá)率高于非病毒性肝病組織。PPP2R3A 蛋白在正常肝組織的表達(dá)多數(shù)呈中等陽性（表1），主要定位于細(xì)胞胞質(zhì)。統(tǒng)計學(xué)分析顯示：PPP2R3A 蛋白在肝癌組織的表達(dá)顯著高于良性肝?。≒ ＜ 0.001）。

2.3 PPP2R3A 蛋白在肝癌和良性肝病患者血清中的表達(dá)（表2）： 根據(jù)ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）計算各樣本的蛋白量，結(jié)果顯示在肝癌患者血清中PPP2R3A 蛋白的表達(dá)水平為（13.40±6.73） ng/ml，而在良性肝病患者血清中PPP2R3A 蛋白的表達(dá)水平為（10.11±2.36） ng/ml，通過秩和檢驗(yàn)得到P 值為0.033，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 ELISA 法檢測PPP2R3A 蛋白在血清表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 PPP2R3A 表達(dá)與肝癌臨床病理特征的關(guān)系（表3）：PPP2R3A 的表達(dá)強(qiáng)度與肝癌AFP 值（r ＝0.256，P ＝ 0.032）呈正相關(guān)性。PPP2R3A表達(dá)強(qiáng)度與年齡、性別、Child-Pugh 評分、腫瘤數(shù)目、腫瘤大小、TNM-t、包膜侵犯、血管侵犯、淋巴結(jié)浸潤、HBeAg、HBV-DNA 以及病理分期指標(biāo)無統(tǒng)計學(xué)差異（P ＞0.05）。

3 討 論

PPP2R3A 基因?qū)儆贐″/PR72 家族，該基因位于3q22.2-q22.3，主要編碼2 個成員，即PR130和 PR72［5］。PR130 和 PR72 具有各自特異性的 N-基末端，和共同的C-末端，C-末端包含兩種結(jié)構(gòu)域，即一個保守的疏水基序和2 個參與鈣離子結(jié)合的EF 結(jié)構(gòu)域（EF1、EF2），這些結(jié)構(gòu)域提供了與結(jié)構(gòu)亞基結(jié)合的交互界面、PR72 的核內(nèi)定位以及Ca2+依賴性磷酸酶活性的刺激作用［5］。PP2A 屬于絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶家族，參與調(diào)控許多細(xì)胞生命活動、生物學(xué)功能和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)，而調(diào)節(jié)亞基B 能影響酶的活性，在底物特異性和亞細(xì)胞定位中具有重要作用［5-6］。目前研究發(fā)現(xiàn) PP2A在肺臟、直腸、乳腺、皮膚和子宮等多種部位腫瘤中都出現(xiàn)了亞基的突變，而PPP2R3A 參與了結(jié)腸癌、前列腺癌和淋巴細(xì)胞白血病等的發(fā)生、發(fā)展。但PPP2R3A 基因與肝癌的關(guān)系尚不清楚。我們前期研究發(fā)現(xiàn)PPP2R3A 基因可能通過調(diào)控p53、β-catenin 蛋白的表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖及侵襲，通過Caspase 凋亡途徑抑制細(xì)胞凋亡，與肝癌有一定的關(guān)聯(lián)，但其在乙肝相關(guān)性肝癌與良性肝病中的表達(dá)及分布情況尚不清楚，本研究進(jìn)一步利用大樣本分析PPP2R3A 蛋白在乙肝相關(guān)性肝癌與良性肝病中的表達(dá)情況及其與肝癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系。

表1 PPP2R3A 在不同肝組織中的表達(dá)情況

表2 PPP2R3A 在血清中的表達(dá)情況（±s）

表2 PPP2R3A 在血清中的表達(dá)情況（±s）

組別 例數(shù)（例） 血清PPP2R3A 表達(dá)量（ng/ml） 統(tǒng)計結(jié)果肝癌 30 13.40±6.73 P ＝ 0.033良性肝病 15 10.11±2.36

表3 PPP2R3A 的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

本研究顯示PPP2R3A 蛋白在肝癌組織中主要定位于細(xì)胞胞質(zhì)，僅部分表達(dá)于胞膜。在良性肝病中PPP2R3A 蛋白也主要定位于細(xì)胞胞質(zhì)，少量表達(dá)于胞膜。有研究結(jié)果顯示PPP2R3A 的亞型PRl30 能使SHIP2 重新分布于細(xì)胞膜，與其結(jié)合后能抑制表皮生長因子受體的降解，而表皮生長因子受體在多種腫瘤中呈現(xiàn)出促腫瘤生長效應(yīng)，因此細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞膜是該基因發(fā)揮生物學(xué)功能的關(guān)鍵部位［7］。通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，PPP2R3A 蛋白在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于其癌周組織的表達(dá)，亦顯著高于其在良性肝病的表達(dá)。ELISA 結(jié)果也發(fā)現(xiàn)在肝癌患者血清中PPP2R3A 蛋白的表達(dá)量高于其在良性肝病患者中的表達(dá)量。并且我們前期研究中的Western Blot 實(shí)驗(yàn)也顯示， PPP2R3A 蛋白在肝癌組織中的表達(dá)高于其癌周組織。說明PPP2R3A 基因在肝癌組織中呈過表達(dá)。其表達(dá)上調(diào)可能與肝癌的發(fā)生有關(guān)。

本研究分析PPP2R3A 的表達(dá)與肝癌臨床病理因素之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)PPP2R3A 高表達(dá)與肝癌血清AFP 含量具有顯著相關(guān)性。AFP 是一種由卵黃囊和胎兒肝臟產(chǎn)生的參與多種物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的糖蛋白，屬于α 球蛋白，位于第4 對染色體上（4q11-q21），分子量約為 64 000 ～ 72 000［8］。AFP 在胚胎時期濃度較高，生理情況下人體內(nèi)水平低于20 μg/L，當(dāng)肝臟發(fā)生癌變時，AFP 可以被激活呈高水平表達(dá)［9］。AFP 的生物學(xué)功能復(fù)雜，有研究顯示AFP對腫瘤細(xì)胞增殖作用及腫瘤逃逸機(jī)體免疫功能均有影響［8］。而在HCC 的細(xì)胞增殖階段和細(xì)胞凋亡階段中，AFP 通過改變p53/Bax/cytochrome c/caspase-3 信號傳導(dǎo)通路正向調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的增殖［9］。并且有研究發(fā)現(xiàn)AFP 通過激活PI3K/AKT信號通路在促進(jìn)HCC 的侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移方面起著關(guān)鍵作用［10］。血清AFP 作為肝癌的特異性標(biāo)志物，與超聲檢查結(jié)合，對早期肝癌的診斷具有重要意義。AFP 不僅是肝癌發(fā)生的標(biāo)志物，同時也與肝癌的大小、數(shù)量、侵襲、癌栓形成、肝外轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)率和生存期等密切相關(guān)，越來越多的研究證實(shí)AFP值與HCC 腫瘤體積、微血管侵襲關(guān)系密切，三者均是影響肝癌治療療效、生存率的重要因素［9-12］。本研究發(fā)現(xiàn)AFP 含量越高，PPP2R3A 的表達(dá)量越高，因此認(rèn)為PPP2R3A 基因可能與AFP 存在某種聯(lián)系，為研究兩者在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)系提供新的思路。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PPP2R3A 能引起肝癌細(xì)胞早期凋亡的減少，抑制肝癌細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞由G 期向S 期轉(zhuǎn)變；經(jīng)transwell 小室實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)PPP2R3A 能促進(jìn)肝癌 Huh-7 細(xì)胞的遷移和侵襲能力［7，13］。并且有研究顯示PPP2R3A 的亞型PR130 能影響腫瘤細(xì)胞的遷移能力［4］，Lin 等和Jin 等亦發(fā)現(xiàn)β-catenin在過表達(dá)PPP2R3A 基因的肝癌細(xì)胞中表達(dá)增多，而Wnt / β-catenin 信號通路的激活通常與肝細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)，β-catenin 的上調(diào)能促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖和遷移能力［14-15］。因此，我們認(rèn)為PPP2R3A 基因可能參與了肝癌的發(fā)生和發(fā)展。但本研究尚未發(fā)現(xiàn)PPP2R3A 的表達(dá)與肝癌的TNM、病理分期及VM 等臨床病理指標(biāo)有顯著相關(guān)性，可通過擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步分析。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)了PPP2R3A 蛋白在肝癌與良性肝病患者中的表達(dá)存在顯著差異性，且與肝癌臨床腫瘤特征（AFP）有相關(guān)性。因此，我們提出PPP2R3A 基因過表達(dá)可能與肝癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，可能成為一種潛在的肝癌診斷指標(biāo)和治療靶點(diǎn)，但PPP2R3A 基因參與肝癌發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制和應(yīng)用價值還需進(jìn)一步研究。